董莉莉，吳素玲，馬春華，隆紅艷，沙明慧

(南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心，江蘇 南京 210000)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，其主要特征為慢性滑膜炎癥,對稱性多關(guān)節(jié)慢性炎癥是其主要表現(xiàn)[1]。RA的發(fā)病機制目前來說基本達成了共識：RA患者可以誘導T、B細胞活化、局部浸潤，產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)、細胞因子，引起關(guān)節(jié)滑膜炎癥，出現(xiàn)慢性炎癥癥狀。慢性炎癥反應在RA的發(fā)展中起重要作用，其中，核因子-κB (NF-κB)的活化可以促進多種促炎癥基因轉(zhuǎn)錄[2],包括:腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-2等等，導致RA炎癥反應及結(jié)構(gòu)破壞。

類風濕關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“尪痹”范疇，其致病因素為風寒濕邪，風、寒、濕相互交結(jié)成為本病的病理關(guān)鍵，“尪痹”多從風寒濕論治。痹痛合劑(蘇藥制字Z04000864)是江蘇省南京市中醫(yī)院的院內(nèi)制劑。綜觀全方,組方精當,可使風濕除、肝腎強、筋骨壯而痹痛愈。臨床觀察驗證了本方可有效地改善關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)疼痛和活動受限的臨床表現(xiàn)[4],是治療類風濕關(guān)節(jié)炎癥的有效方藥。且以往研究顯示，痹痛合劑能夠延緩關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨的退變，提高關(guān)節(jié)軟骨細胞中Bc1-2基因的表達[5]，抑制炎癥因子IL-1的表達[6]。本課題組通過佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察不同濃度的痹痛合劑對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中相關(guān)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達的影響，探討痹痛合劑對于類風濕關(guān)節(jié)炎的作用機制和靶點，為痹痛合劑治療類風濕關(guān)節(jié)炎提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠40只，體重：200～220 g，由南京市中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證編號：SYXK(蘇)2014-0001。所有動物于室溫(22±1)℃，空氣濕度40%～50%，晝夜交替時間12 h條件下普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。適應性喂養(yǎng)1周。動物飼養(yǎng)按照國家實驗動物管理條例進行。

1.2 藥物與試劑 痹痛合劑(蘇藥制字Z04000864，每瓶250 mL，南京市中醫(yī)院)；雙氯芬酸鈉片(中國藥科大學制藥有限公司，國藥準字H10960217，每片50 mg)；弗式完全佐劑(南京納晟生物科技有限公司，批號:ex210804)；蒸餾水(實驗室自制)；生理鹽水(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司，批號：150920D02)；蘇木精水溶液、二甲苯、伊紅乙醇染色液。大鼠IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(批號：E-EL-R0012c)、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(批號：E-EL-R0019c)、大鼠白介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(批號：E-EL-R0015c)均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.3 儀器 全波長酶標儀(Bio-Tek Epoch)；熒光顯微鏡(奧林巴斯 BX43)；垂直電泳系統(tǒng)(Bio-Rad Mini Protean Tetra)；轉(zhuǎn)膜印跡系統(tǒng)(Bio-Rad Mini Trans-Blot)；低溫冰箱(海爾 DW-25L262)；臺式離心機(美國貝爾曼)；超純水系統(tǒng)(美國Thermo LabTower)；全自動高壓滅菌鍋(日本 Tomy SX-500)；微量分析天平(瑞士梅特勒 IKA T10)。

2 方法

2.1 動物分組 40只SD大鼠隨機分成5組:空白組、模型組、雙氯芬酸鈉組、痹痛合劑高劑量組、痹痛合劑低劑量組，每組8只。

2.2 模型制備 0.2 mL弗氏完全佐劑皮內(nèi)注射大鼠右后足趾，經(jīng)過變態(tài)反應后形成佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，正常組注射等體積的生理鹽水在相同部位注射。

2.3 給藥方法 造模成功后，計算給藥劑量，痹痛合劑成人劑量為869 mg·kg-1，雙氯芬酸鈉成人劑量為1.66 mg·kg-1，以“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”為標準，痹痛合劑大鼠劑量為536 mg·(100 g)-1，雙氯芬酸鈉組每天劑量為0.5 mg·(100 g)-1，故痹痛合劑高劑量組每天劑量為536 mg·(100 g)-1痹痛合劑低劑量組每天劑量為268 mg·(100 g)-1痹痛合劑，空白組、模型組給予等體積蒸餾水。每組大鼠根據(jù)設(shè)定劑量連續(xù)灌胃給藥21 d。給藥21 d后，腹腔注射麻醉藥劑，頸動脈放血處死大鼠。

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 關(guān)節(jié)滑膜組織蘇木素-伊紅染液染色(HE染色) 于大鼠的右后肢正中縱行切開皮膚，分離肌肉露出膝蓋骨，繼續(xù)向下分離便能看見滑膜組織，手術(shù)刀分離關(guān)節(jié)囊的滑膜層、纖維層，取出滑膜層組織。取右后肢關(guān)節(jié)滑膜組織固定，在甲醛中過夜，固定包埋于石蠟后切成 4 mm 厚的切片。用二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，HE染色；蓋玻片覆蓋在載玻片上封片，置于光學顯微鏡下觀察并記錄病變。

2.4.2 ELISA試劑盒檢測大鼠滑膜組織中的炎癥因子的含量 取大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織，加入一定量磷酸鹽緩沖液，3 500 rpm離心15 min，取其上清。檢測關(guān)節(jié)滑膜組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

2.4.3 Western blot分析 采用Western blot檢測大鼠NF-κB信號通路相關(guān)蛋白IKBa(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、P65(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)、和 P-P65(1∶1 000)表達。關(guān)節(jié)滑膜組織總蛋白用RIPA裂解液進行提取，12 000 rpm條件下離心15 min，收集上清。采用BCA試劑盒進行蛋白定量。蛋白樣品置于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中直至樣品到達分離膠的底部，并將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。轉(zhuǎn)膜完畢后，將條帶浸入5%脫脂牛奶中封閉2 h。封閉結(jié)束后將PVDF膜分別浸入一抗中于4 ℃ 孵育過夜。第2天棄一抗加入第二抗體于搖床室溫孵育2 h。二抗孵育結(jié)束后，棄抗體，取出PVDF膜用TBST清洗3次。使用凝膠成像系統(tǒng)進行曝光并用凝膠掃描成像系統(tǒng)掃描條帶分析各條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理學改變 空白組：軟骨表面光滑，軟骨細胞排列整齊，且四層結(jié)構(gòu)清晰可辨，潮線完整，軟骨基質(zhì)染色為粉紅色，著色均勻，未見炎性細胞浸潤及血管增生現(xiàn)象；模型組：關(guān)節(jié)軟骨破壞最為嚴重，軟骨表面粗糙糜爛不整，形成缺損區(qū)，可見大量的炎性細胞浸潤；陽性藥組：細胞四層結(jié)構(gòu)基本清晰，潮線基本完整；痹痛合劑低劑量組：細胞四層結(jié)構(gòu)基本清晰，有少許軟骨細胞存在輕度變性；痹痛合劑高劑量組：潮線可見基本完整，關(guān)節(jié)軟骨存在少許炎性細胞浸潤，關(guān)節(jié)軟骨細胞具有輕度變性，表面仍有粗糙現(xiàn)象，結(jié)果見圖1。

A.空白組;B.模型組;C.陽性藥組;D.痹痛合劑低劑量組;E.痹痛合劑高劑量組圖1 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理

3.2 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平 與空白組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、 IL-6 和 TNF-α等炎性細胞因子含量顯著增加。與模型組相比，陽性藥組、痹痛合劑低劑量組、痹痛合劑高劑量組關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6 和 TNF-α等炎性細胞因子含量顯著降低(P<0.05)。表明痹痛合劑可以通過減少炎癥因子的表達緩解大鼠關(guān)節(jié)滑膜炎癥的癥狀，結(jié)果見表1。

表1 佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平(pg·mL-1,n=8)

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與陽性藥組比較，☆P<0.05；與合劑低劑量組比較，▲P<0.05

3.3 采用Western blot檢測痹痛合劑對NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的改善作用。如圖2～3所示，與空白對照組相比，模型組大鼠IKBa、MyD88、P65、TLR4、p-IκBα和 P-P65的表達上調(diào)，在痹痛合劑低劑量組和痹痛合劑高劑量組治療后，這些蛋白的表達顯著下調(diào)，結(jié)果表明，痹痛合劑是通過NF-κB信號通路體現(xiàn)其對關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用。

A.空白組；B.模型組；C.陽性藥組；D.痹痛合劑低劑量組；E.痹痛合劑高劑量組圖2 痹痛合劑對關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

4 討論

類風濕關(guān)節(jié)炎病變主要累及滑膜組織，主要病理特點是滑膜細胞增生，炎性細胞浸潤。研究發(fā)現(xiàn)，多種炎性細胞因子如 IL-1β、干擾素(IFN) -γ、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17等參與了RA的病理過程，此類細胞因子是導致軟骨和骨損傷，介導RA發(fā)生及發(fā)展的重要因素。因此，抑制、阻斷這類細胞因子及其受體是研究治療RA藥物的一個方向[7-8]。

痹痛合劑是經(jīng)過我院研究開發(fā)的院內(nèi)制劑。本方以牛膝、狗脊為君,治以強筋骨、補肝腎,懷牛膝是為引經(jīng)藥;防風、獨活祛除風寒濕邪;徐長卿、威靈仙舒筋通絡(luò);雞血藤、土鱉蟲、桂枝活血通絡(luò),通達四肢關(guān)節(jié);川草烏(制)散寒止痛;白術(shù)(炒)、茯苓健脾利濕;虎杖清熱活血解毒,同時防諸藥辛燥太過。臨床觀察驗證，本方可有效地改善患者關(guān)節(jié)疼痛和活動受限的臨床表現(xiàn),是治療RA的有效方藥[4]。

本課題觀察了痹痛合劑對RA大鼠滑膜組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-кB表達的影響，觀察發(fā)現(xiàn)造模后，RA大鼠滑膜組織中 IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-кB的表達量均比正常組明顯增高。痹痛合劑高低劑量組和雙氯芬酸鈉組中IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-кB的表達量均有所降低，且痹痛合劑高劑量組較雙氯芬酸鈉組在降低 IL-6，NF-кB表達方面更為顯著。實驗的結(jié)果說明痹痛合劑可通過降低RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥因子的表達，來有效減輕RA大鼠滑膜組織的炎癥反應。

C.空白組；M.模型組；Y.陽性藥組；D.痹痛合劑低劑量組；G.痹痛合劑高劑量組圖3 佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中P-NF-кBP65/NF-кBP65、P-IkBa/IKBa、TLR4/GAPDH、MyD88/GAPDH的表達 注：與空白組比較，*P<0.05;與空白組和治療組比較，**P<0.05；與空白組比較，##P<0.05，治療組之間比較無統(tǒng)計學差異