劉云娣 高佳珠 楊智華 麥喆钘 孫治中 李俊哲 溫俊茂

摘要：目的? 采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析補(bǔ)腎益心片治療高血壓的作用機(jī)制，為其臨床與應(yīng)用提供參考。方法? 檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺（TCMSP）獲取補(bǔ)腎益心片活性成分，運(yùn)用DRAR-CPI服務(wù)器、GeneCards和OMIM等數(shù)據(jù)庫篩選活性成分治療高血壓的作用靶點(diǎn)。采用Cytoscape3.6.0軟件構(gòu)建補(bǔ)腎益心片活性成分-高血壓靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)合String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape的NetworkAnalyzer分析蛋白相互作用關(guān)系。采用Systems Dock Web Site進(jìn)行活性成分與靶點(diǎn)分子對接。并進(jìn)行GO分析、KEGG通路富集分析。結(jié)果? 篩選出補(bǔ)腎益心片活性成分30個，作用于62個靶點(diǎn)，主要通過調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)、Toll樣受體信號通路、PI3K-AKT信號通路和Jak-STAT信號通路等發(fā)揮治療高血壓的作用。結(jié)論? 本研究初步揭示了補(bǔ)腎益心片治療高血壓的多成分、多靶點(diǎn)作用機(jī)制，可為后續(xù)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)腎益心片;高血壓;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);靶點(diǎn);通路

中圖分類號：R2-05;R285??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）08-0104-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.021????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Objective To analyze the mechanism of Bushen Yixin Tablets （BYT） for hypertension based on network pharmacology; To provide references for clinic and application. Methods Active components in BYT were obtained by retrieving TCM systems pharmacology database and analysis platform （TCMSP）. The active targets of BYT were screened by using databases such as DRAR-CPI， GeneCards and OMIM. Cytoscape3.6.0 was used to form the active components of BYT-hypertension targets network. String database and Cytoscape NetworkAnalyzer were used to analyze protein interactions. The System Dock Web Site was used to interface the active components with the target molecule. GO analysis and KEGG pathway enrichment analysis were conducted. Results Totally 30 active components of BYT and 62 target were obtained. BYT played the role of treating hypertension through regulating renin-angiotensin system. Toll-like receptor signaling pathway， PI3K-AKT signaling pathway and Jak-STAT signaling pathway. Conclusion This study preliminarily discloses the multi-component and multi-target mechanism of BYT for hypertension， which can provide references for further research.

Keywords： Bushen Yixin Tablets; hypertension; network pharmacology; targets; pathway

高血壓主要發(fā)生于中老年人群，但有逐漸呈年輕化趨勢。目前主要采用改善患者生活方式并配合藥物治療的方式，以達(dá)到將血壓降至正常血壓值的治療目標(biāo)。但高血壓常伴多種并發(fā)癥，難以根治。

補(bǔ)腎益心片是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院多年來治療各種高血壓的常用中藥復(fù)方制劑。臨床觀察顯示補(bǔ)腎益心片可明顯改善患者生活質(zhì)量、生理癥狀、性功能、工作狀態(tài)、生氣和活力、睡眠等方面的問題[1]。補(bǔ)腎益心片主要組成藥物為淫羊藿和車前子[2]。研究表明，補(bǔ)腎益心片可調(diào)節(jié)血壓，促一氧化氮合成、抗血小板聚集、利尿，對心、腦、腎等靶器官具有保護(hù)作用，還可使血漿過氧化脂質(zhì)下降，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶回升，調(diào)節(jié)睪酮和雌二醇水平[2-3]。同時，補(bǔ)腎益心片對高血壓患者腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用[4]。但目前研究大多關(guān)注藥物對個體和個別分子的影響，補(bǔ)腎益心片治療高血壓的有效活性成分及作用機(jī)制尚不明確。其藥理學(xué)研究仍處于單基因-單靶點(diǎn)研究階段，系統(tǒng)性研究鮮見報(bào)道。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析補(bǔ)腎益心片的化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)、信號通路，并進(jìn)行GO分類富集分析及KEGG通路富集分析，分析“藥物-基因-靶點(diǎn)-疾病”間的關(guān)系，并進(jìn)行可視化展示，為其臨床與應(yīng)用提供參考。

1? 資料與方法

1.1? 藥物化學(xué)成分和活性成分的獲取

登錄中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/，TCMSP），分別以補(bǔ)腎益心片組成藥物“淫羊藿”“車前子”為關(guān)鍵詞檢索，獲得2種藥物的化學(xué)成分信息，包括成分編號（Mol ID）、分子量（MW）、脂水分配系數(shù)（AlogP）、氫鍵供體（Hdon）、氫鍵受體（Hacc）、口服生物利用度（OB）、Caco-2滲透率、血腦屏障（BBB）、類藥性（DL）、負(fù)分?jǐn)?shù)可表達(dá)面積（FASA-）?？紤]到中藥成分紛繁復(fù)雜，必非所有成分均能進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用，選取同時滿足OB>30%、DL>0.18的化學(xué)成分，作為其活性成分。

1.2? 活性成分作用靶點(diǎn)獲取

利用Discovery Studio 4.0對成分進(jìn)行預(yù)處理，選擇Minimize ligands模塊，在CHARMm力場下采用共軛梯度法與最陡下降法相結(jié)合的能量優(yōu)化算法，進(jìn)行成分的能量最小化分析。然后采用BEST模式對分子進(jìn)行多構(gòu)象的生成。通過Chembiodraw Ultra 12.0軟件繪制出淫羊藿-車前子的活性成分3D結(jié)構(gòu)圖，以mol2格式保存。

將活性分子的3D結(jié)構(gòu)上傳到DRAR-CPI服務(wù)器（http：//cpi.bio-x.cn/drar/），基于反向分子對接方法，對活性成分和蛋白相互作用的親和性進(jìn)行打分。按照服務(wù)器推薦，選定Z-score<-0.5的蛋白作為淫羊藿-車前子活性分子的預(yù)測靶點(diǎn)。通過UniProtKB數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）檢索淫羊藿-車前子活性分子預(yù)測靶點(diǎn)的PDB ID，檢索字段為“All Fields”，限定物種為“human（人）”，以獲取預(yù)測靶點(diǎn)相應(yīng)基因。

1.3? 高血壓相關(guān)靶點(diǎn)基因獲取

分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards. org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）以“hypertension”或“HTN”為關(guān)鍵詞檢索與高血壓病相關(guān)的靶點(diǎn)基因。將相關(guān)的靶點(diǎn)基因和淫羊藿-車前子活性分子的預(yù)測靶點(diǎn)基因錄入Excel表格，進(jìn)行兩者的對比，篩選出共同部分，作為淫羊藿-車前子活性成分抗高血壓的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4? 活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將補(bǔ)腎益心片活性成分與抗高血壓作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.6.0軟件，構(gòu)建活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5? 核心靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

以String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）為背景網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，將補(bǔ)腎益心片活性分子抗高血壓的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為“homo sapiens”，檢索獲得蛋白相互作用關(guān)系，以TSV格式保存結(jié)果。再將其導(dǎo)入Cytoscape3.6.0軟件繪制蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并用Cytoscape的NetworkAnalyzer工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，根據(jù)degree值（連接度）調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)的大小、顏色，以獲取最終的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.6? 分子對接

通過System Dock Web Site進(jìn)行分子對接得出的Docking評分，可評估配體-受體的結(jié)合潛力[5]。因此，基于上述的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，篩選出degree值最高的5個靶點(diǎn)，并導(dǎo)入System Dock Web Site服務(wù)器（http：//systemsdock. unit.oist.jp/iddp/home/index），按照服務(wù)器原始參數(shù)設(shè)定，與淫羊藿-車前子活性分子進(jìn)行對接。通過對結(jié)果的Docking評分進(jìn)行分析，評估活性分子與核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合潛力。

1.7? 生物學(xué)過程與信號通路分析

DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）為大量基因或蛋白提供系統(tǒng)全面的生物功能注釋信息，并能找出最顯著富集的生物學(xué)注釋[6]。將補(bǔ)腎益心片活性分子作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，Select Identifier 設(shè)為“OFFICIAL GENE SYMBOL”，List Type 設(shè)為“Gene List”，限定物種為“human”，進(jìn)行GO分析和KEGG信號通路富集分析，得到并保存結(jié)果。選取滿足P<0.001的通路和生物過程，并根據(jù)富集基因數(shù)的大小，選取排名前20位的信號通路，使用OmicShare網(wǎng)站（http：//www.omicshare. com/）繪圖。

1.8? 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過分析富集基因數(shù)排名前20位的KEGG信號通路，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)檢索，篩選出可能與抗高血壓相關(guān)的信號通路，找出富集在這些通路上淫羊藿-車前子抗高血壓的靶點(diǎn)，并與相應(yīng)藥物的活性分子相配對，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

2? 結(jié)果

2.1? 補(bǔ)腎益心片活性成分

TCMSP收集到淫羊藿化學(xué)成分130個，車前子化學(xué)成分55個。經(jīng)篩選，得到活性成分30個，其中淫羊藿活性成分23個、車前子活性成分9個，如木犀草素（luteolin）、槲皮苷（quercetin）、谷甾醇（sitosterol）、山柰酚（kaempferol）和高車前苷元（Dinatin）等，見表1。

2.2? 靶點(diǎn)預(yù)測

30個活性成分在DRAR-CPI服務(wù)器中得到Z-score<-0.5的靶點(diǎn)有62個，在UniProtKB數(shù)據(jù)庫中輸入這些蛋白靶點(diǎn)的PDB ID，獲得62個基因靶點(diǎn)。再與OMIM與GeneCards數(shù)據(jù)庫的高血壓相關(guān)靶點(diǎn)基因進(jìn)行比對，篩選出與高血壓相關(guān)的作用靶點(diǎn)62個，見表2。

2.3? 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

在Cytoscape3.6.0軟件中導(dǎo)入活性成分與作用靶點(diǎn)的信息及對應(yīng)關(guān)系，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖1。此網(wǎng)絡(luò)包括92個節(jié)點(diǎn)、487條邊。節(jié)點(diǎn)代表活性成分與作用靶點(diǎn)，而邊則代表成分與靶點(diǎn)之間存在相關(guān)關(guān)系。不同的靶點(diǎn)可對應(yīng)同一個的活性成分，單個靶點(diǎn)也可與不同的活性成分相對應(yīng)，由此可見淫羊藿-車前子治療高血壓具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

2.4? 核心靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將62個潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中，限定物種為人，獲取蛋白相互作用關(guān)系，使用Cytoscape3.6.0軟件繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖2。此網(wǎng)絡(luò)共包括62個節(jié)點(diǎn)、352條邊。圖中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián)。degree值越大則節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，結(jié)果提示degree值最高的5個潛在靶點(diǎn)分別是IL-6、VEGFA、TNF、EDN1、TGFB1。

2.5? 分子對接結(jié)果

degree值高意味著該蛋白在補(bǔ)腎益心片活性分子治療高血壓中具有重要作用。在Systems Dock Web Site服務(wù)器中輸入關(guān)鍵靶點(diǎn)TNF、IL-6、VEGFA、EDN1、TGFB1的PDB ID，并與30個活性成分進(jìn)行對接（見圖3）。結(jié)果顯示有18個的Docking評分>7.0，有79個在7.0～5.0之間，有45個在5.0～4.25之間，<4.25的18個。當(dāng)Docking評分>4.25時表示分子和靶點(diǎn)具有一定結(jié)合能力，>5.0時表示結(jié)合能力較高，>7.0時表示結(jié)合能力高。由此可見，補(bǔ)腎益心片的活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能力良好。

2.6? GO分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

對潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG分析，以P<0.01為閾值篩選富集數(shù)量較多的通路與生物過程，其中富集占相應(yīng)通路比例越大、P值越小的通路，與補(bǔ)腎益心片活性分子治療高血壓的關(guān)系更密切。GO分析和KEGG通路富集分析結(jié)果見圖4～圖7。風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)為富集在該通路的靶點(diǎn)與通路靶點(diǎn)總數(shù)的比值。

2.7? 活性成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)

從KEGG結(jié)果排名前20位的信號通路中篩選出可能與高血壓相關(guān)的5條，并將其與補(bǔ)腎益心片的活性成分、作用靶點(diǎn)一一對應(yīng)，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路多維網(wǎng)絡(luò)，見圖8。由圖分析可得，補(bǔ)腎益心片治療高血壓涉及的活性成分共10個，包括木犀草素、槲皮苷、谷甾醇等，靶點(diǎn)有TNF、IL-6、VEGFA等，主要涉及腎素-血管緊張素系統(tǒng)、Toll樣受體信號通路、PI3K-AKT信號通路和Jak-STAT信號通路。

3? 討論

補(bǔ)腎益心片中淫羊藿性溫，具有補(bǔ)腎壯陽之功;車前子性寒，具有清肝利水等作用。二藥合用，一溫一寒，一補(bǔ)一清，具有補(bǔ)腎清肝的功效。

本研究收集到補(bǔ)腎益心片組成中具有治療高血壓作用的活性成分共30個，如木犀草素、槲皮苷、谷甾醇、山柰酚和高車前苷元等。通過30個活性成分收集到可能與高血壓相關(guān)的作用靶點(diǎn)62個。表明補(bǔ)腎益心片治療高血壓具有多成分、多靶點(diǎn)特點(diǎn)。成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)也體現(xiàn)了該特點(diǎn)。此外，靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)出補(bǔ)腎益心片活性分子治療高血壓的各蛋白靶點(diǎn)之間關(guān)系密切，提示其作用機(jī)制復(fù)雜多樣，非單一蛋白靶點(diǎn)作用而成。分子對接試驗(yàn)顯示，補(bǔ)腎益心片活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)之間結(jié)合能力良好，說明本研究數(shù)據(jù)及結(jié)果準(zhǔn)確度較高，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果具一定參考價(jià)值。

GO和KEGG通路富集分析與成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，補(bǔ)腎益心片治療高血壓涉及腎素-血管緊張素系統(tǒng)、Toll樣受體信號通路、PI3K-AKT信號通路和Jak-STAT信號通路等。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)人體重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)血壓和水-電解質(zhì)平衡。機(jī)體可合成血管緊張素Ⅰ，進(jìn)而合成血管緊張素Ⅱ，然后激活其AT1受體，發(fā)揮收縮血管、再吸收腎鈉離子、分泌醛固酮、增加血壓和促進(jìn)高血壓發(fā)生的作用。因此抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)可有效治療高血壓，補(bǔ)腎益心片可能通過影響機(jī)體腎素-血管緊張素系統(tǒng)改善高血壓的病理狀態(tài)。

Toll樣受體信號通路中TLR4介導(dǎo)的先天及適應(yīng)性免疫反應(yīng)參與高血壓慢性血管炎性反應(yīng)，其對血壓調(diào)控的機(jī)制主要與TLR4介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷及血管反應(yīng)性增強(qiáng)有關(guān)[7]。TLR4的表達(dá)增強(qiáng)可升高血壓，而抑制TLR4可降低血壓。通路分析結(jié)果顯示，補(bǔ)腎益心片可能通過影響TLR4的表達(dá)起到治療高血壓的作用。

延髓頭端腹外側(cè)區(qū)（RVLM）是交感神經(jīng)調(diào)控的關(guān)鍵中樞，在維持基礎(chǔ)血壓和保持交感神經(jīng)緊張中具有重要作用。此中樞內(nèi)PI3K-AKT信號通路參與了血壓的調(diào)節(jié)。在高血壓大鼠RVLM中PI3K通路明顯上調(diào)，其失活導(dǎo)致RVLM內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生減少，改善高血壓心血管功能[8]。本研究結(jié)果提示，淫羊藿-車前子可能通過影響PI3K-AKT信號通路而治療高血壓。

Jak-STAT信號通路是大多數(shù)細(xì)胞因子及活性物質(zhì)發(fā)揮生物作用的共同通路。血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1）自身抗體AT1-AAs有促細(xì)胞增殖的作用，而Jak-STAT信號通路的激活參與了AT1-AAs所致的血管平滑肌細(xì)胞增殖效應(yīng)，從而參與了高血壓病的發(fā)生發(fā)展[9]。補(bǔ)腎益心片可能影響Jak-STAT信號通路的激活，起到治療高血壓的作用。

綜上，補(bǔ)腎益心片治療高血壓涉及多種活性成分、作用靶點(diǎn)及信號通路。本研究通過分子對接驗(yàn)證了檢索數(shù)據(jù)，所得結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道符合，但該研究結(jié)果還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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（收稿日期：2019-01-13）

（修回日期：2019-02-28;編輯：向宇雁）