田培，李曉輝，賀文俊，段杜薇，徐世曉，楊鐵釗

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號(hào) 450002

煙草根結(jié)線蟲病是世界各國(guó)煙草生產(chǎn)中的主要病害之一，尤其以南方根結(jié)線蟲危害為重。我國(guó)煙區(qū)南方根結(jié)線蟲病發(fā)生范圍廣、危害重、防治難度大[1-3]。受環(huán)境和經(jīng)濟(jì)水平所限，我國(guó)大部分缺水旱作煙區(qū)無(wú)法開展水旱輪作，多采用化學(xué)手段防治，雖取得了一些成效，但也造成了煙葉農(nóng)藥殘留增加、煙葉品質(zhì)下降和環(huán)境污染加重等后果[4]。不同煙草品種對(duì)南方根結(jié)線蟲表現(xiàn)明顯的抗性差異，種植抗病品種或抗/耐基因的利用是防治根結(jié)線蟲病最有效、最經(jīng)濟(jì)和最環(huán)保的方法[5]。在煙草與根結(jié)線蟲的互作中，煙草細(xì)胞識(shí)別線蟲入侵后，會(huì)激活自身免疫反應(yīng)，包括抗病相關(guān)的代謝產(chǎn)物的合成，或者信號(hào)分子的產(chǎn)生以調(diào)節(jié)代謝過(guò)程[6]。代謝組學(xué)主要是比較兩組或多組生物樣本之間代謝模式的差異，進(jìn)一步研究一些關(guān)鍵的不同代謝物的功能和意義[7]，在藥物作用機(jī)理研究、功能基因研究、代謝途徑及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)理解析、作物育種等許多領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[8]。根結(jié)線蟲侵染煙草過(guò)程中互作方面的研究多在轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的水平[9-10]，而涉及煙草代謝組學(xué)的研究多集中在基因功能解析、不同組織器官代謝差異、煙草香味物質(zhì)調(diào)控等方面[11-12]。利用代謝組學(xué)手段研究根結(jié)線蟲侵染抗感煙草品種代謝途徑的差異還未見相關(guān)報(bào)道。本研究以抗病品種G28與感病品種長(zhǎng)脖黃為材料[13-14]，采用LC/MS分析技術(shù)，探討其受南方根結(jié)線蟲侵染后在代謝組水平上發(fā)生的變化。通過(guò)對(duì)差異代謝物和代謝途徑的分析，為煙草與南方根結(jié)線蟲互作機(jī)理的深入研究和根結(jié)線蟲病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)進(jìn)行。供試煙草品種為抗病品種G28與感病品種長(zhǎng)脖黃，均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)育種實(shí)驗(yàn)室提供。南方根結(jié)線蟲由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供病土培養(yǎng)番茄，按照劉維志[15]的研究方法分離獲得。所用試劑包括：甲醇、甲酸、水、乙腈、碳酸氫銨均購(gòu)自CNW公司，L-2-氯苯丙氨酸購(gòu)自上海恒創(chuàng)生物科技有限公司。所有化學(xué)藥品和溶劑均為分析純或色譜級(jí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

G28（G）與長(zhǎng)脖黃（C）均播于無(wú)菌基質(zhì)的穴盤中，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化育苗。成苗后，選取長(zhǎng)勢(shì)均勻的壯苗移入塑料盆（直徑10 cm，高8.3 cm）中，每個(gè)塑料盆栽一棵，按照隨機(jī)區(qū)組排列。移栽10 d后，每個(gè)品種選擇長(zhǎng)勢(shì)均勻一致，無(wú)病害的壯苗，設(shè)置4個(gè)處理：1）G28接種J2s懸浮液（G_RKN）；2）長(zhǎng)脖黃接種J2s懸浮液（C_RKN）；3）G28接種清水（G_CK）；4）長(zhǎng)脖黃接種清水（C_CK）。每個(gè)處理（含3株煙苗）重復(fù)3次。接種10 d后，將4組處理分別拔出根部，用清水沖洗干凈，放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 南方根結(jié)線蟲的繁育與接種

南方根結(jié)線蟲在感病番茄品種早豐中擴(kuò)繁。番茄移栽后3個(gè)月，出現(xiàn)明顯根結(jié)時(shí)，選取有南方根結(jié)線蟲卵塊的根結(jié)，用1%的NaClO液消毒，再用去離子水沖洗干凈，放置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化。3～4 d后收集孵化出的二齡幼蟲（J2s），顯微鏡下計(jì)數(shù)，制成300條/mL的J2s懸浮液，在24h內(nèi)進(jìn)行接種處理。接種方法為在煙株根部周圍（1～2 cm左右）打孔（5孔/盆），在孔內(nèi)注入5 mL懸浮液/清水，用基質(zhì)掩埋[16]。

1.2.3 LC/MS樣品前處理[17]

煙草根部磨碎后稱取80 mg，放入1.5 mL離心管中，加入20 μL內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配置）和1 mL的甲醇與水混合液（體積比為7：3）； -20℃放置2 min預(yù)冷，加入研磨機(jī)研磨2 min（60 Hz,）；繼而超聲提取30 min（4℃）； -20℃靜置20 min后，離心15 min（13000 rpm，4℃），用注射器吸取200 μL上清液，每個(gè)樣品重復(fù)3次，并將3次上清液合并；使用0.22 μm的有機(jī)相針孔過(guò)濾器過(guò)濾后，轉(zhuǎn)移到LC進(jìn)樣小瓶，-80℃條件下保存，進(jìn)行LC- MS分析。

1.2.4 LC/MS分析

采用沃特世科技有限公司的UPLC超高效液相色譜與ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，柱溫45℃，流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的超純水，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙腈；流速為0.4 mL/min，進(jìn)樣體積為5 μL。洗脫梯度見表1。

采用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的高分辨質(zhì)譜儀。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源ESI，樣品質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用正負(fù)離子掃描模式。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表1 洗脫梯度Tab.1 Elution gradient

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Mass spectrometry parameter

質(zhì)控樣本（QC）由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，每個(gè)質(zhì)控樣本的體積以及分析方法與樣本完全相同，在分析過(guò)程中，每10個(gè)分析樣本中插入一個(gè)質(zhì)控樣本。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析流程

首先通過(guò)去噪平滑，基線矯正，重疊峰識(shí)別等步驟提取LC/MS數(shù)據(jù)。其次對(duì)4組煙草樣本（G_RKN、G_CK、C_RKN、C_CK）的代謝組原始數(shù)據(jù)采用有監(jiān)督的偏最小二乘法（PLS-DA）與正交偏最小二乘法（OPLS-DA）進(jìn)行分析。再應(yīng)用中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所與大連達(dá)碩信息技術(shù)有限公司聯(lián)合開發(fā)的代謝組學(xué)小分子化合物快速鑒定分析軟件系統(tǒng)（OSI / SMMS） 鑒定差異代謝物。所用數(shù)據(jù)庫(kù)為The Human Metabolome Database（HMDB，網(wǎng)址：http：//www.hmdb.ca/）和METLIN的一級(jí)數(shù)據(jù)（網(wǎng)址：https：//metlin.scripps.edu/），并參考中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所與大連達(dá)碩信息技術(shù)有限公司建立的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Main Standard Library）。OPLS 建模需要以 PLS 模型通過(guò)驗(yàn)證為基礎(chǔ)[18]。篩選組間差異代謝物的標(biāo)準(zhǔn)為OPLS-DA模型第一主成分的VIP值 >2，t檢驗(yàn)（student’s t test）的P<0.05。最后把差異代謝物映射到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（網(wǎng)址：http：//www.genome.jp/KEGG/pathway.html），使用 MBRole（http：//csbg.cnb.csic.es/mbrole/）網(wǎng)站的ID轉(zhuǎn)換功能，獲取差異代謝物的KEGG的物質(zhì) ID號(hào)，再通過(guò)MBRole通路分析功能，利用差異代謝物的KEGG ID進(jìn)行通路富集分析，獲得代謝通路富集結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 G28與長(zhǎng)脖黃根部樣品的LC/MS分析和數(shù)據(jù)預(yù)處理

圖1為正離子模式下抗病品種G28根部典型的基峰離子流圖，圖2為正離子模式下感病品種長(zhǎng)脖黃根部典型的基峰離子流圖。原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)XCMS軟件處理后檢測(cè)到2978個(gè)代謝物（由保留時(shí)間和質(zhì)荷比值組成的數(shù)據(jù)對(duì)表示）。

圖1 G28處理組與對(duì)照組樣品的基峰離子流圖Fig.1 Base peak ion current chromatograms of G28 roots of the treatment group and control group

圖2 長(zhǎng)脖黃處理組與對(duì)照組樣品的基峰離子流圖Fig.2 Base peak ion current chromatograms of Changbohuang roots of the treatment group and control group

2.2 根結(jié)線蟲誘導(dǎo)差異代謝產(chǎn)物的鑒定

圖3是4組煙草樣本的PLS-DA分析的得分圖，處理組和對(duì)照組的分離趨勢(shì)明顯。由模型參數(shù)表3得，兩個(gè)主成分的累計(jì)值Q2（cum）分別高達(dá) 0.995與0.998，且兩個(gè)成分對(duì) X 和 Y的累積解釋能力R2X（cum）和R2Y（cum）分別為 0.819、1與0.925、1，說(shuō)明模型的穩(wěn)定性和可預(yù)測(cè)能力以及對(duì)數(shù)據(jù)的擬合度較好，滿足 OPLS-DA 的建模要求。

為防止模型過(guò)擬合，同時(shí)獲得導(dǎo)致兩組樣本存在差異的準(zhǔn)確代謝物信息，采用七次循環(huán)交互驗(yàn)證（7-fold cross validation）和200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)（response permutation testing，RPT）的方法來(lái)考察模型的質(zhì)量。圖4顯示處理組（RKN）與對(duì)照組（CK）有明顯區(qū)分，說(shuō)明根結(jié)線蟲侵染對(duì)抗、感品種根部代謝有影響，由于感病品種長(zhǎng)脖黃分離更加明顯，預(yù)示感病品種侵染前后代謝差異更大。

表4數(shù)據(jù)顯示，OPLS-DA模型可以清楚地解釋兩個(gè)品種對(duì)照組和處理組之間的差異，且兩組模型的預(yù)測(cè)能力較好，模型質(zhì)量較高。擬合驗(yàn)證結(jié)果見圖5，所得參數(shù)Q2＜0，表明得到了正確預(yù)測(cè)的樣本，說(shuō)明采用OPLS-DA模型能夠有效地找出對(duì)照組和處理組間的最大差異，適合進(jìn)行后續(xù)分析。

圖3 G28、長(zhǎng)脖黃處理組與對(duì)照組PLS-DA分析的得分圖Fig.3 PLS-DA score plot of G28 ＆ changbohuang treatment group and control group

表3 模型累積解釋率Tab.3 Cumulative interpretation rate of model

圖4 G28、長(zhǎng)脖黃處理組與對(duì)照組OPLS-DA分析的得分圖Fig.4 OPLS-DA score plot of G28 ＆ changbohuang treatment group and control group

圖5 G28、長(zhǎng)脖黃OCS-PLS模型過(guò)擬合驗(yàn)證Fig.5 Over-fitting validation of G28 ＆ changbohuang OCS-PLS model

表4 模型累積解釋率Tab.4 Cumulative interpretation rate of model

2.3 差異代謝物的鑒定

接種南方根結(jié)線蟲后，G28共篩選出77個(gè)差異代謝物，其中上調(diào)的有45個(gè)，下調(diào)的有32個(gè)；長(zhǎng)脖黃共篩選出87個(gè)差異代謝物，其中上調(diào)的有59個(gè)，下調(diào)的有28個(gè)。OPLS-DA模型中VIP值越大，說(shuō)明差異越顯著。表5、6中列出的均為VIP值大于4的化合物，初步標(biāo)記為差異明顯的化合物。FC為接種后差異物含量的倍數(shù)變化。表中的差異代謝物包括生物堿類物質(zhì)、脂肪酸、類黃酮、萜類和聚酮等化合物，說(shuō)明這些化合物可能參與煙草對(duì)南方根結(jié)線蟲的抗病反應(yīng)。此外，比較倍數(shù)變化值可看出，兩個(gè)品種接種后，G28代謝產(chǎn)物含量的提高倍數(shù)均高于長(zhǎng)脖黃，說(shuō)明G28的代謝更為活躍。

表5 G28重要差異代謝物鑒定結(jié)果Tab.5 Identification of partial important DEMs in G28

續(xù)表5

表6 長(zhǎng)脖黃重要差異代謝物鑒定結(jié)果Tab.6 Identification of partial important DEMs in Changbohuang

續(xù)表6

2.4 差異代謝物的代謝通路分析（基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)）

表7列出了G28與長(zhǎng)脖黃差異代謝物關(guān)于代謝通路分析的摘要信息。再進(jìn)行通路富集分析 （表8、9）。最后代謝通路中p<0.05的部分，以代謝通路名稱為橫坐標(biāo)，以-log（p-value）為縱坐標(biāo)繪制代謝通路富集圖。

根據(jù)表7可知，G28與長(zhǎng)脖黃共有的差異代謝產(chǎn)物是檸檬酸（Citric acid）與磷酸（Phosphoric acid）。在G28中，檸檬酸參與了8條代謝通路，在長(zhǎng)脖黃中，檸檬酸參與了3條代謝通路，兩個(gè)品種共有的代謝通路有3條；磷酸在G28與長(zhǎng)脖黃中均參與了2條代謝通路，共有代謝通路有2條。圖6和7所示，G28和長(zhǎng)脖黃被南方根結(jié)線蟲侵染后引起的差異代謝產(chǎn)物分別參與了10種和5種代謝途徑。說(shuō)明兩個(gè)煙草品種在南方根結(jié)線蟲侵染后代謝途徑存在一定的差異性。綜合表7、8及圖6，G28特有的代謝途徑為：萜類和聚酮類生物堿代謝，鳥氨酸、賴氨酸和煙酸生物堿代謝，萜類和甾體代謝以及莽草酸途徑。說(shuō)明抗性品種G28通過(guò)自身特有的差異代謝產(chǎn)物變化，影響了一些代謝途徑變化，從而有助于抵抗南方根結(jié)線蟲的侵染。還可以看出G28發(fā)生變化的代謝通路主要與生物堿代謝、植物激素代謝相關(guān)。綜合表7、9以及圖7可看出感病品種長(zhǎng)脖黃的主要代謝通路變化是苯丙的生物合成。

表7 G28與長(zhǎng)脖黃差異代謝物關(guān)于代謝通路分析的摘要信息Tab.7 Summary of G28 ＆ Changbohuang DEMs

表8 G28差異代謝通路富集表Tab.8 Pathway analysis of G28 DEMs

表9 長(zhǎng)脖黃差異代謝通路富集表Tab.9 Pathway analysis of Changbohuang DEMs

圖6 G28差異代謝物通路富集圖Fig.6 Pathway analysis of G28 DEMs

圖7 長(zhǎng)脖黃差異代謝物通路富集圖Fig.7 Pathway analysis of Changbohuang DEMs

3 討論

本試驗(yàn)以抗病品種G28與感病品種長(zhǎng)脖黃作為試驗(yàn)材料，利用LC/MS分析技術(shù)探索接種前后煙草根部代謝產(chǎn)物的變化。OPLS-DA分析發(fā)現(xiàn)，不同品種與處理間有明顯的分離趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)差異代謝物進(jìn)行通路富集分析，可以幫助理解在抗、感品種中代謝途徑變化機(jī)制。鑒定G28與長(zhǎng)脖黃差異代謝產(chǎn)物都發(fā)現(xiàn)了抗病相關(guān)的物質(zhì)，如生物堿類物質(zhì)、脂肪酸、類黃酮、聚酮等，其中G28中還鑒定出了很多萜類物質(zhì)。生物堿可增加寄主植物抗螺旋線蟲（helicotylenchus dihystera）、根結(jié)線蟲（root knot nematode）、跟斑線蟲（paratylenchus scribneri）的能力，還可以增加寄主的抗病性，抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖[19]。脂肪酸不僅是所有生物中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，還是脂類物質(zhì)的重要組成部分[20]。早期研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸在植物防御中的作用是被動(dòng)進(jìn)行的，扮演的角色為表皮組分或者植物激素（茉莉酸）的生物合成前體[21]。隨著研究的深入，證實(shí)越來(lái)越多的脂肪酸或者其降解產(chǎn)物直接誘導(dǎo)了各種植物防御反應(yīng)，并且發(fā)現(xiàn)脂肪酸及其衍生物對(duì)植物免疫有重要作用[22]。類黃酮、萜類、聚酮類物質(zhì)都與抗病性有關(guān)[23]。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)無(wú)論抗感品種篩選出的差異代謝物中烷醇類物質(zhì)都具有顯著性差異，這可能與烷醇類物質(zhì)影響植物的抗（耐）性有關(guān)，Seo 等發(fā)現(xiàn)擬南芥的抗旱能力與角質(zhì)層蠟質(zhì)中烷類和醛類物質(zhì)呈正相關(guān)[24]，還有研究表明三十烷醇在提高植物的光合作用、促進(jìn)根和莖的生長(zhǎng)、緩解各種脅迫(如鹽、鎘脅迫)等有重要的作用[25-26]。由此推測(cè)烷醇類物質(zhì)的顯著性變化可能與根結(jié)線蟲侵染引發(fā)植物的防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)。

代謝組分析結(jié)果表明南方根結(jié)線蟲侵染在抗病和感病煙草植株中均引起了復(fù)雜的應(yīng)答反應(yīng)。差異代謝物的代謝通路分析結(jié)果顯示，抗性品種的生物堿代謝與植物激素代謝途徑均達(dá)到極顯著水平，其中鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、 色氨酸等不僅是生物堿合成途徑的起始物質(zhì)，也與體內(nèi)相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成密切相關(guān)[27-28]。已有研究表明，這幾種氨基酸及其代謝產(chǎn)物，參與木質(zhì)素、苯丙素、生物堿等抗病相關(guān)次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成途徑[18][29]。本研究發(fā)現(xiàn)在G28中，檸檬酸（Citric acid）與D型3-磷酸甘油醛（D-Glyceraldehyde 3-phosphate）參與了植物激素的合成途徑。在逆境條件下，植物內(nèi)源激素不僅可以調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，也作為一種微量信號(hào)物質(zhì)調(diào)控抗病反應(yīng)[30]，并且多種植物激素相互協(xié)同或拮抗作用使植物對(duì)病原物的防御能力有所提升[31]。所以線蟲侵染造成根系損傷也必然會(huì)影響體內(nèi)原有的激素平衡狀態(tài)[32-34]，而本研究也從代謝角度證明了植物激素對(duì)抗病反應(yīng)的調(diào)控作用。檸檬酸、磷酸均為抗病途徑的重要中間產(chǎn)物，其次，莨菪亭屬于多酚類物質(zhì)，也是植物抗逆反應(yīng)的重要參與者[35]。另外，苯丙的生物合成，萜類和甾體代謝，莽草酸途徑，氧化磷酸化作用，TCA循環(huán)等代謝通路也都發(fā)生了明顯變化，在前人研究中，這些途徑都與植物抵抗逆境相關(guān)，所以推測(cè)這些代謝通路與南方根結(jié)線蟲入侵體內(nèi)產(chǎn)生防御機(jī)制有一定聯(lián)系[36-39]。

4 結(jié)論

由分析結(jié)果看出，抗病品種G28有10條抗病相關(guān)的代謝通路發(fā)生了明顯變化，其中有4條通路變化有極顯著性；而感病品種長(zhǎng)脖黃僅僅只有5條抗病相關(guān)的代謝通路，其中只有1條有極顯著性。這也說(shuō)明了南方根結(jié)線蟲入侵時(shí)，抗病品種中的抗病相關(guān)代謝通路被激活的更多，這也為選育高抗品種提供了理論價(jià)值和應(yīng)用參考。

綜上所述，南方根結(jié)線蟲侵染抗、感品種前后代謝方面的響應(yīng)有很大差異，這對(duì)于防控病蟲害，開展高抗新品種選育以及煙草抗根結(jié)線蟲病機(jī)理的深入研究有重要意義。