尹 偉， 劉雙雙， 方三華

(浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，杭州 310058)

0 引 言

圖像拼接技術(shù)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮了巨大的作用，由于組織切片或者活體動物較大，使用高倍物鏡時分辨率高，但視野狹窄，低倍物鏡相對視野大，但分辨率低，只能觀察樣本局部，很難了解整體。利用圖像拼接技術(shù)，可獲取一個高分辨率的完整組織圖貌。激光共聚焦顯微鏡(Confocall Laser Scanning Microscope,LCSM)的拼接功能解決了在高放大倍數(shù)下，在單幀顯微圖像中無法獲取所觀測對象全貌的問題。曾毅波等[1]將激光共聚焦顯微鏡技術(shù)應(yīng)用于微機電系統(tǒng)中，在懸臂梁的形貌分折中獲得清晰的三維圖像，運用拼接功能獲得384 μm×288 μm的視場面積。Kulesa等[2]結(jié)合拼圖技術(shù)，在8個視野中利用共聚焦技術(shù)和雙光子技術(shù)進行光活化和多點掃描，提供了一種更有效率，減少侵入性的技術(shù)來跟蹤斑馬魚細胞的運動，但是這些傳統(tǒng)方法耗用的時間較長。隨著細胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，對大視野拼圖的成像速度提出了越來越高的要求。

虛擬切片(Virtual slides)又叫數(shù)字切片(digital slides)，是利用計算機結(jié)合顯微鏡攝影技術(shù)，將一張傳統(tǒng)的組織切片轉(zhuǎn)化為全視野的數(shù)字化虛擬切片，并保持完整性和真實性[3-4]。虛擬切片技術(shù)應(yīng)用廣泛，可應(yīng)用于常規(guī)HE染色、特殊染色、熒光染色的組織切片。VS120是奧林巴斯為全視野大面積掃描和高分辨率圖像采集專門設(shè)計推出的數(shù)字切片掃描系統(tǒng)，可用于明場和熒光觀察，能滿足快速大視野無縫拼接和高分辨率細節(jié)成像，是組織病理學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等眾多學(xué)科都需要的重要工具，能大大提高熒光成像的質(zhì)量和速度，存儲方便檢索迅速，隨意選擇放大倍率，實現(xiàn)精確的圖像處理和分析從而提高了研究人員的工作效率。本文對VS120虛擬數(shù)字切片掃描系統(tǒng)的硬件配置和軟件功能進行詳細介紹，結(jié)合具體使用實例探討該儀器的應(yīng)用。由于該儀器實行校內(nèi)外共享服務(wù)，是醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺中使用頻率較高的儀器之一，在管理和維護方面需要達到更高的標準?？偨Y(jié)使用過程中遇到的常見問題，分析造成的原因，并提出對策，以期為數(shù)字切片掃描系統(tǒng)的共享使用提供重要借鑒和參考。

1 配置參數(shù)及成像特點

(1) 相機。采用2/3 in 500萬像素彩色高分辨率相機(Charge Coupled Device,CCD)成像,色彩還原性優(yōu)異。

(2) 顯微鏡。研究級BX61顯微鏡,高精度電動載物臺，可實現(xiàn)全視野樣品的自動化精確無縫圖像拼接，復(fù)眼透鏡呈現(xiàn)更均勻明亮的熒光。標配有2倍、10倍、20倍和40倍4款尖端物鏡，并有60X、100X多款油鏡可供選擇。

(3) 濾色片。配置高速熒光激發(fā)及吸收濾色片轉(zhuǎn)輪8孔位，最多可進行13通道成像，切換時間約58 ms，每一通道可單獨調(diào)整曝光時間和Z軸焦平面位置，保證最佳焦平面激發(fā)。

(4) 切片加載系統(tǒng)。VS120-S6-W切片加載系統(tǒng)允許手動加載1～6片標準切片。為了高通量研究和病理學(xué)分析，VS120-L100-W系統(tǒng)配有一個高度可靠、強勁，可裝載高達100張切片的裝載系統(tǒng)。

(5) 軟件。軟件具有注釋、測量、景深擴展、X、Y、Z三維序列掃描、不同倍率圖層掃描、Zoom時標尺自動改變等多種功能。直觀、人性化的軟件界面可以高效地控制全電動顯微鏡，完成自動聚焦和圖像采集設(shè)置。有多種掃描模式可供選擇，如簡單的快速掃描和全程控制的專家掃描。多通道熒光圖像采集可以自動疊加，以輕松查看任意通道的圖像。

(6) 成像特點。Smart Scan掃描方式，明場成像，自動聚焦“地形圖”，智能化的“邊緣偵查”，透射光成像，平滑無縫隙圖像拼接、優(yōu)異的自動和半自動對焦功能。

2 VS120在組織病理學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等研究領(lǐng)域的應(yīng)用

VS120可以在2 min內(nèi)快速掃描完一張切片，創(chuàng)建一個數(shù)字“虛擬切片”，由于能數(shù)字化分享實驗室、教室里的切片，VS120成為研究、疾病診斷等遠程會診、病理、切片資料歸檔、課堂教學(xué)數(shù)據(jù)共享方面應(yīng)用的完美之選，在組織病理學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)[5-11]等研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。文獻[12-13]中將VS120應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究，繪制了全腦神經(jīng)地圖，Ohara等[14]將VS120應(yīng)用于腫瘤方法學(xué)，研究一種多重注射針對胰腺腫瘤藥物分布的改善。在實際應(yīng)用中，VS120日均預(yù)約量達8 h以上，服務(wù)醫(yī)學(xué)院內(nèi)外100余個課題組，樣本量大，處于供不應(yīng)求的狀態(tài)。下面列舉幾個具體案例并就感興趣區(qū)域進行細節(jié)放大，包括樣本類型、拍攝條件、拍攝參數(shù)等。

2.1 樣本類型：神經(jīng)熒光腦片

拍攝條件：熒光(Fluorescence,FL) Red -20 ms，F(xiàn)L Green -158 ms，F(xiàn)L Blue -42 ms,10X物鏡。圖像大?。?0 mm×7 mm。拍攝時間:47 s。具體效果如圖1所示。

圖1 神經(jīng)熒光腦片成像圖(10X)

2.2 樣本類型：熒光腸切片

拍攝條件：FL Red -183 ms，F(xiàn)L Green -158 ms，F(xiàn)L Blue -126 ms,10X物鏡。圖像大?。?.8 mm×3.4 mm。拍攝時間：16.75 s。具體效果如圖2所示。

圖2 熒光腸切片成像圖(10X)

2.3 樣本類型：視網(wǎng)膜熒光片

拍攝條件：FL Green -110 ms,20X物鏡。圖像大?。? mm×5.8 mm。拍攝時間：38.57 s。具體效果如圖3所示。

圖3 視網(wǎng)膜熒光片成像圖(20X)

2.4 熒光內(nèi)臟切片

拍攝條件：FL Green -150 ms，F(xiàn)L Blue -200 ms,10X物鏡。圖像大?。?.8 mm×5.8 mm。拍攝時間：24 s。具體效果如圖4所示。

圖4 熒光內(nèi)臟切片成像圖(10X)

2.5 明場骨切片

拍攝條件：40X物鏡。圖像大小：3.8 mm×3.2 mm。拍攝時間：42 s。具體效果如圖5所示。

圖5 明場骨切片成像圖(40X)

2.6 明場腎切片

拍攝條件：40X物鏡。圖像大?。?.2 mm×10.3 mm。拍攝時間：2 min 09 s。具體效果如圖6所示。

圖6 明場腎切片成像圖(40X)

3 VS120使用過程中遇到的問題、造成原因及解決方案

問題1預(yù)覽掃描和實際掃描會因為超出掃描界限而彈出報錯提示。

造成原因在掃描過程中，利用stage navigator來進行多次重復(fù)定義預(yù)覽區(qū)域時，如果第2次預(yù)覽定義的區(qū)域小于上次定義的區(qū)域容易出現(xiàn)該提示。

解決方案取消掃描，在采集模塊校準界面里重新做一次預(yù)覽區(qū)域定義校準，即可解決。

問題2切片最右邊的區(qū)域位于掃描區(qū)域以外。

造成原因軟件系統(tǒng)在設(shè)計預(yù)覽邊界時，為了盡可能避免掃描的錯誤和節(jié)省時間，特意避開了夾片器支撐玻片的區(qū)域，所以會出現(xiàn)最右邊一小塊區(qū)域位于掃描界限之外。

解決方案建議制備樣品時盡量預(yù)留出周圍的區(qū)域，既可以便于指甲油封片不影響樣品成像，也可以避免樣品位于掃描區(qū)域之外。

問題3vsi格式的讀取和另存方案。

造成原因VS120進行全視野掃描的數(shù)據(jù)量十分巨大，超出了Java系統(tǒng)讀圖的限制，所以常規(guī)Windows讀圖軟件無法讀取超大數(shù)據(jù)量的.tiff和.jpg格式的文件。VS120軟件自身生成的格式.vsi可以很有效的存儲數(shù)據(jù)又節(jié)省空間，但是其他軟件一般情況下無法讀取。

解決方案①掃描過程中設(shè)置自動存儲，直接存成.tiff格式文件。②使用Fiji+vsi reader進行.vsi數(shù)據(jù)讀取和另存。③使用奧林巴斯提供的免費看圖軟件OlyVIA。④加配圖像批量轉(zhuǎn)換插件，可以對圖像進行批量的格式轉(zhuǎn)換和另存，可與圖像掃描同時進行。

問題440X鏡頭成像清晰度差。

造成原因①40X物鏡上面有一個校正環(huán)，用于校準蓋玻片的厚度。由于不同批次的蓋玻片厚度略有差別，所以要結(jié)合校正環(huán)一起調(diào)節(jié)使用，才能得到最佳最清晰的成像。②數(shù)字切片系統(tǒng)是基于寬場成像的，與共聚焦的原理不同，成像時也會采集到非焦平面的圖像信息，這是光學(xué)系統(tǒng)本身的特性。40X物鏡的數(shù)值孔徑更高，景深更小，所以這種現(xiàn)象會更加明顯。

解決方案①針對不同的樣品，對校正環(huán)進行調(diào)節(jié)，以獲得在焦面位置最清晰的成像。②基于寬場成像的原理，建議制備更薄的標本，或者使用VS120的實時EFI功能進行成像。

問題5過厚的熒光樣品和過弱的熒光樣品采集出現(xiàn)拼接陰影。

造成原因①過厚的熒光樣品——在進行拍攝時，很難找到比較合適的焦面，如果多個聚焦點之間的Z軸相差太大，焦面移動過程中的背景熒光亮度整體會發(fā)生變化，這樣就容易出現(xiàn)拼接陰影。②過弱的熒光樣品在進行采集的時候，樣品信噪比不好，為了拍攝出信號，需要提高曝光時間或者提高熒光光源的功率，容易造成樣品的淬滅。而且，此時采集到的圖像中，背景熒光亮度大部分都是自發(fā)熒光，也容易出現(xiàn)淬滅。系統(tǒng)在拼圖時需要重復(fù)拍攝邊界區(qū)域進行重疊拼接，樣品淬滅則容易出現(xiàn)拼接陰影。

解決方案①建議樣品厚度不要超過40 μm，熒光樣品進行焦面設(shè)置時選擇手動調(diào)焦，以保證快速確定焦面，盡量避免熒光淬滅。由于樣品比較厚，可以設(shè)置的焦面范圍相對比較寬，建議盡量保持Z軸數(shù)值一致。②熒光信號過弱的樣品信號較弱，信噪比較差，做數(shù)字切片掃描時背景信號相對被放大，容易有拼接陰影，建議改進樣品制備方法。針對熒光觀察，優(yōu)先選擇延長曝光時間，而非增加光源強度，盡量避免樣品的淬滅。

4 結(jié) 語

虛擬切片技術(shù)優(yōu)勢巨大，前景廣闊，逐步作為形態(tài)學(xué)實驗教學(xué)、科學(xué)研究和病理會診的一種輔助手段，相較于傳統(tǒng)激光共聚焦的大視野拼圖技術(shù)，VS120拼圖速度更快更高效，且拼縫更小，幾乎做到完美拼接，但其圖像質(zhì)量仍取決于組織切片的制作質(zhì)量，因此傳統(tǒng)切片還不能完全被取代[15]。對于此類共享率高、使用量大的顯微成像儀器，如何做好維護和管理并且合理地開發(fā)利用是儀器管理人員需要不斷研究和深入的問題。