張紅醫(yī), 陳 躍, 馬紅玉, 李美婷, 何怡帆, 周 燦

(河北大學(xué) a. 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院； b. 化學(xué)教學(xué)研究所；c. 化學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心, 河北 保定 071002)

0 引 言

就目前常用的分離檢測技術(shù)而言，毛細管電泳或離子色譜主要使用水基緩沖液，因此被認為是綠色分離技術(shù)[1]。根據(jù)Welch等[2]的測算，一臺配備了傳統(tǒng)尺寸色譜柱的傳統(tǒng)液相色譜儀器每天至少產(chǎn)生1 L的廢液，并且這些廢液中往往包含了較高含量的影響健康和環(huán)境安全的有機溶劑。據(jù)文獻估計,世界上有13萬臺液相色譜儀正在使用[3]，那么每年將產(chǎn)生3 400萬L化學(xué)廢液。

為了響應(yīng)綠色化學(xué)的要求，圍繞著減少液相色譜廢液的產(chǎn)生、降低廢液的處理費用，近年來綠色液相色譜分析法的研究日益得到重視。綠色液相色譜的一個突出的做法就是使用小內(nèi)徑，如UPLC(內(nèi)徑2.1 mm或1 mm)的柱子代替內(nèi)徑4.6 mm的傳統(tǒng)液相色譜柱HPLC[4]。超高效液相色譜(UHPLC)不僅采用了更小內(nèi)徑的柱子，而且采用了更短的柱子，顯著降低了分析時間，進而大大降低了分析過程中溶劑的消耗和廢液的產(chǎn)生[5-6]。綠色液相色譜的另一個做法就是從液相色譜的流動相入手，例如：用乙醇代替乙腈做流動相[7-8]、過熱水色譜(Superheated Water Chromatography)[9-10]、離子液體作為流動相改性劑或流動相[11-12]。

盡管如此，綠色液相色譜實驗在本科生儀器分析實驗課程及其實驗教材中還沒有得到應(yīng)有的重視[13-14]。在我校自編的實驗教材中，也只有一個實驗涉及到了超高效液相色譜法[14]。本文在文獻[15]的基礎(chǔ)上，形成了一個適合本科生實驗的綠液相色譜方法。該方法采用間接紫外檢測法對溶液中甲醇、乙醇含量進行了測定。該實驗的開設(shè)會帶來如下三方面的好處。① 激勵學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情。從方法上講，該實驗采用反相液相色譜間接檢測法，其有別于目前常見的直接紫外檢測法，會使學(xué)生有耳目一新的感覺。從檢測對象來看，樣品是生活中常見的酒品或生物燃料，會使學(xué)生感到一種親近感。② 學(xué)會并掌握一種評價液相色譜流動相的環(huán)境評價標(biāo)準(zhǔn)(Environmental Assessment Tool, EAT)[16]的小程序，為其今后從文獻中選擇和評價液相色譜方法提供了一個新視角和新工具。③ 更重要的是該實驗向?qū)W生們直接傳遞了可持續(xù)發(fā)展、綠色化學(xué)(Green chemistry)、綠色分析化學(xué)(Green Analytical Chemistry, GAC)[17]和綠色液相色譜法(Green reversed phase high performance liquid chromatography)[18]等先進的理念，以及化學(xué)工作者在推進綠色化學(xué)研究和應(yīng)用中所應(yīng)擔(dān)負的社會責(zé)任。通過深入挖掘該實驗中的“綠色、生態(tài)、環(huán)?！钡扰c社會主義核心價值觀相關(guān)的思想政治元素，在一定程度上起到了“課程思政”的育人作用[19]。

1 原理和實驗

1.1 原理和程序

(1) 間接檢測的基本原理[20]。間接光度液相色譜檢測法一般是在流動相體系中加入一種在檢測波長范圍內(nèi)具有較高吸收系數(shù)的試劑(稱為紫外洗脫試劑)，以形成高的紫外吸收本底。當(dāng)樣品引入到色譜柱內(nèi)后，無紫外吸收的待測組分與紫外洗脫試劑發(fā)生相互作用或者在色譜柱上產(chǎn)生競爭保留，由于基流的變化而導(dǎo)致吸收信號的變化，產(chǎn)生組分色譜峰。間接光度檢測時既會出現(xiàn)正方向色譜峰也會出現(xiàn)負方向色譜峰，一般符合表1所示的規(guī)律。

表1 間接光度法中的正負峰規(guī)律

(2) 液相色譜流動相環(huán)境評價標(biāo)準(zhǔn)原理和計算程序。Koller等[21]采用從不同數(shù)據(jù)庫中提取的數(shù)據(jù)，充分考慮了物質(zhì)的物理、化學(xué)、環(huán)境和安全性質(zhì)計算出了安全因子S、健康因子H和環(huán)境因子E。在計算方法中，通過規(guī)定可替代的數(shù)據(jù)源，有效地解決了因物理、化學(xué)、或者毒性數(shù)據(jù)缺失所產(chǎn)生的制約因素。S,H和E數(shù)據(jù)可用于高度刻畫和區(qū)分不同溶劑和化學(xué)品。

基于13種最常用的液相色譜有機溶劑，Gaber等[16]創(chuàng)立了一種簡單工具(HPLC-EAT)，該方法可以以計算得分的辦法來識別所選HPLC方法的綠色性。HPLC-EAT 法可以計算從等度洗脫到三元梯度等不同運行模式下的不同流動相的HPLC-EAT指標(biāo)量。當(dāng)純水流動相或含有改性劑(或者鹽緩沖液)的水溶液做流動相時，因為有機溶劑的重要作用，因而將它們的S、H和E設(shè)為零

HPLC-EAT=S1m1+H1m1+E1m1+S2m2+

H2m2+E2m2+ … +Snmn+

Hnmn+Enmn

式中：S、H和E分別是Koller等所用的安全因子、健康因子和環(huán)境因子；n代表溶劑數(shù)目;m代表溶劑質(zhì)量。HPLC-EAT計算程序和使用手冊可以從下面網(wǎng)頁的右側(cè)區(qū)域免費下載：https://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2011/GC/c0gc00667j#!。divAbstract該程序的運行需要在Java環(huán)境下。

1.2 儀器與試劑

(1) 儀器。LC-20AD型高效液相色譜儀(島津，日本)，配有Diamonsil反相C18色譜柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm，Dikma)、SPD-20A紫外/可見分光光度檢測器(島津，日本)、CBM-10A型在線工作站(島津，日本)，7725i手動進樣閥(美國)及AT-330型色譜柱恒溫箱；SKCH-10S超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；SZ-93自動蒸餾水器(上海亞榮生化儀器廠)。

(2) 試劑。甲醇、丙酮均為色譜級試劑，乙醇為分析純試劑，實驗用水為雙蒸水，實驗樣品為白酒和烹飪用生物燃料等。測試樣品溶液和流動相使用前要經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。

1.3 實驗步驟

(1) 樣品溶液制備。醇基燃料：量取一定體積的樣品，并定量轉(zhuǎn)移到蒸餾瓶中進行水浴蒸餾，接收80 ℃以內(nèi)的餾分。餾分直接進樣分析，進樣體積5 μL。白酒：過濾后直接進樣分析，進樣體積5 μL。

(2) 反相液相色譜條件的設(shè)定。流動相：丙酮/水(4 / 96)，流速：0.8 ml/min，檢測波長：233 nm，進樣體積：5 μL，柱溫30 ℃。

(3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。配制系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(乙醇：1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%，甲醇：1%、3%、5%、10%、20%)進行反相高效液相色譜測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，通過Origin繪制工作曲線，得到線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)等數(shù)據(jù)。

(4) 實際樣品的測定。在相同的儀器條件下，測定樣品溶液。用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對樣品進行定量測定。

2 實驗要點

2.1 流動相的優(yōu)化

丙酮具有明顯的紫外吸收，它在流動相中所占的比例對間接光度檢測中起著決定性的作用。當(dāng)以10%(體積百分數(shù))的甲醇為樣品，進樣體積保持5 μL不變的條件下，對流動相中丙酮的百分含量進行研究。由圖1可見，當(dāng)丙酮含量較低時(2%)時，甲醇的峰面積也較低；當(dāng)丙酮含量在3%～4%時，甲醇的峰面積達到最大；當(dāng)丙酮含量高于4%后，甲醇的峰面積開始明顯下降。因此，選擇4%丙酮作為最優(yōu)流動相。

圖1 甲醇峰面積隨流動相中丙酮百分含量的變化

2.2 檢測波長的優(yōu)化

在丙酮與水體積比為4%的流動相條件下，考察了不同檢測波長對甲醇的峰面積的影響。由圖2可見，隨著檢測波長220～233 nm逐漸增大，甲醇的峰面積也逐漸增大。當(dāng)檢測波長在233 nm 和236 nm時，甲醇的峰面積基本保持不變。當(dāng)檢測波長在236～250 nm范圍內(nèi)依次變大時，對應(yīng)的甲醇峰面積卻逐漸降低。因此，選擇233 nm 作為最佳檢測波長。

圖2 甲醇峰面積隨檢測波長的變化

2.3 典型色譜圖與樣品分析

在最佳的色譜條件為：以丙酮/水(4/96，體積分數(shù))為流動相，流速0.8 mL/min，檢測波長設(shè)定為233 nm，進樣體積為5 μL，色譜柱溫度為30 ℃，將不同濃度的甲醇和乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液注射到色譜柱內(nèi)進行色譜分析。甲醇和乙醇混合溶液的典型色譜圖如圖3所示。從圖3可以看出，每個色譜圖都有3個色譜峰，其中1#峰為甲醇峰，2#峰為乙醇峰，3#峰為系統(tǒng)峰。由于甲醇和乙醇以及作為紫外洗脫試劑使用的丙酮都不帶電荷，且1#甲醇峰的保留時間短于3#系統(tǒng)峰的保留時間，2#乙醇峰的保留時間長于3#系統(tǒng)峰的保留時間，所以，甲醇應(yīng)為正峰，乙醇應(yīng)為負峰。系統(tǒng)峰有時為正峰，有時為負峰，但該峰的保留時間均在2.78 min。當(dāng)只注射甲醇水溶液時，甲醇峰為正峰，而此時的系統(tǒng)峰為負峰。隨著甲醇的濃度依次增大，甲醇峰將隨之增大，而系統(tǒng)峰也將向著負峰方向逐漸增大。當(dāng)只注射乙醇水溶液時，乙醇峰為負峰，而此時系統(tǒng)峰為正峰還是負峰，會受乙醇濃度的影響。當(dāng)乙醇濃度小于1%時，系統(tǒng)峰為負峰；而當(dāng)乙醇濃度高于1%時，系統(tǒng)峰為正峰[22]。

在最佳條件下，分別制作甲醇和乙醇的工作曲線。甲醇(正峰)和乙醇(負峰)的工作曲線分別為：

其中Y為峰面積，X為體積百分數(shù)。將取自某飯店的醇基燃料經(jīng)蒸餾處理后，測得其蒸餾后乙醇含量為23.26%，甲醇的含量為4.90%。實驗測得某品牌白酒為36%，其標(biāo)示量為38%。圖4為經(jīng)處理后的含醇燃料的色譜圖。

(a) 1% methanol + 2% ethanol

(b) 2% methanol + 1% ethanol

(c) 10% methanol + 20% ethanol

(d) 20% methanol + 10% ethanol

1—methanol； 2—ethanol； 3—system peak.

圖3 不同甲醇和乙醇濃度所對應(yīng)的液相色譜圖

圖4 經(jīng)蒸餾處理后的生物燃料的典型色譜圖

2.4 液相色譜流動相環(huán)境評價(EAT)的計算

通過Web of Science檢索發(fā)現(xiàn)文獻[23]是HPLC測定甲醇的最經(jīng)典方法。該方法在HPLC分析前需要對甲醇進行衍生化處理，所用的流動相為正己烷-二氯甲烷 (9∶1)。用HPLC-EAT程序分別對本文所介紹的液相色譜流動相以及文獻[23]的流動相進行EAT評價。由圖5可見新方法的總EAT得分小于0.017 5，而文獻[23]所對應(yīng)的總EAT得分大于25。顯而易見，從綠色化學(xué)的角度來看，本文所推薦的液相色譜法顯著優(yōu)于文獻[23],而且本文的方法可以同時實現(xiàn)甲醇和乙醇的測定。

(a) HPLC Environment Assessment Chart

(b) HPLC Environment Assessment Chart

3 結(jié) 語

本文推薦了一個可用于甲醇和乙醇同時檢測的綠色液相色譜分析法實驗，該方法用4%的丙酮水溶液作為流動相。該流動相的EAT得分值小于0.017 5，其綠色指數(shù)顯著優(yōu)于測定甲醇的經(jīng)典HPLC方法[23](EAT得分25)。它起到了對目前儀器分析實驗中綠色色譜實驗匱乏的一點彌補作用。從實驗時間來看，該方法實驗消耗少，分析時間短，可在4 min內(nèi)完成，十分適合做本科生的實驗。從實驗內(nèi)容看，間接光度檢測豐富了學(xué)生對檢測方法的全面理解，初步了解液相色譜中系統(tǒng)峰的概念。從實驗的推廣和實用性來看，可以讓學(xué)生掌握HPLC-EAT程序的使用，掌握對液相色譜方法進行評價的一個新的指標(biāo)，掌握一種測定白酒類和生物燃料中甲醇和乙醇的一種新方法。