李憲剛 劉堯 于遠(yuǎn)洋 張靜嬌 周凌

摘 要：目的：研究摸索HPLC測(cè)定喘嗽寧片中甘草酸（按甘草酸銨折算）含量的方法，并測(cè)定3批次喘嗽寧片中甘草酸的含量。方法：采用高效液相色譜法，Thermo SCIENTIFIC C18（4.6×250mm，5μm）色譜柱，流動(dòng)相系統(tǒng)以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～8 min，19%A；8～30 min，19%A→50%A；30min，50%A），流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。結(jié)果：甘草酸銨與相鄰組分分離度良好，甘草酸銨線性范圍為0.1209～2.4173 μg（r=0.9999），線性關(guān)系良好，平均加樣回收率（n=6）為96.7%，RSD小于2.0%。結(jié)論：本文研究確定的方法符合檢驗(yàn)方法驗(yàn)證要求，可用于喘嗽寧片中甘草酸含量的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：喘嗽寧片；HPLC；甘草酸銨

中圖分類(lèi)號(hào)：R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2019）15-0198-02

0 引言

喘嗽寧片具有清熱平喘，止咳化痰功效。用于治療支氣管哮喘，喘息型支氣管炎，肺氣腫，早期肺心病等疾病。該中藥復(fù)方制劑由白果、苦杏仁、地龍、桑白皮、陳皮、黃芩、白前、苦參、甘草、茯苓10味藥材組成，加水煎煮，收集稠膏，壓片而制成?，F(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)：中藥成方制劑第十九冊(cè)[1]（編號(hào)：WS3-B-3696-98），目前，標(biāo)準(zhǔn)中尚無(wú)處方組分有效成分含量測(cè)定的控制項(xiàng)目。鑒于該品種處分組分比較復(fù)雜，標(biāo)準(zhǔn)制定年代久遠(yuǎn)，因此建立準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的質(zhì)量分析方法至關(guān)重要。處方中甘草有解毒、祛痰、止痛、解痙以至抗癌等藥理作用，本文查閱相關(guān)文獻(xiàn)，建立HPLC梯度洗脫法對(duì)制劑中甘草酸[2-5]（以甘草酸銨為測(cè)定物質(zhì)，經(jīng)折算得出甘草酸含量）活性成分進(jìn)行檢測(cè)，完善了本品的質(zhì)量控制體系[6-7]。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀。Waters e2695并配備有waters2998二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、電子分析天平Sartorius BP211D②型。檢測(cè)用乙腈、甲醇、磷酸為色譜純，提取用乙醇為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

對(duì)照品甘草酸銨（批號(hào)：110731-201619）購(gòu)入自中檢院。收集已有產(chǎn)品上市的三個(gè)廠家各1批成品，包含薄膜衣0.6g/片，糖衣片、薄膜衣片0.35g/片三種規(guī)格。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

（1）對(duì)照品溶液。取甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加70%乙醇制成每1ml含50μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。（2）供試品溶液。取供試品20片，除去包衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取約1.0g，精密稱(chēng)定，加70%乙醇100，加熱回流30min，放冷，再次稱(chēng)定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。（3）陰性樣品溶液。按喘嗽寧片的制備工藝，制成不含甘草藥材的陰性樣品。按上述供試品制備方法制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

甘草酸銨HPLC色譜圖1所示，選用Thermo SCIENTIFIC（4.6×250mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相系統(tǒng)為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8分鐘，19%A；8～30 min分鐘，19%A→50%A；30分鐘之后，50%A）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30攝氏度；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。分別取對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照溶液各10μL，通過(guò)液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，理論板數(shù)以甘草酸銨峰計(jì)應(yīng)不低于5000。

3 方法學(xué)考察

3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品、供試品及陰性樣品溶液各10μL，按上述的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)并記錄液相譜圖（見(jiàn)圖1）。陰性樣品的色譜圖中，與對(duì)照品譜圖保留時(shí)間相同的位置未見(jiàn)干擾的色譜峰，結(jié)果表明方法專(zhuān)屬性良好，陰性無(wú)干擾。

3.2 線性關(guān)系考察

精密稱(chēng)取甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)110731-201619純度：93.0%）10.83mg，置25ml量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液3ml置10ml容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，分別取樣1ml、2ml、4ml、8ml、10置10ml容量瓶中加70%乙醇稀釋至刻度，精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液3ml置5ml容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，分別吸取上述溶液10μl測(cè)定峰面積，結(jié)果表明甘草酸銨的進(jìn)樣量在0.1209～2.4173μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，以對(duì)照品的濃度為X軸橫坐標(biāo)，測(cè)得的峰面積為Y軸縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=738343x-9267.8，r=0.9999。

3.3 精密度試驗(yàn)

儀器精密度：取上述制備方法制備的同一份對(duì)供試品溶液，同一儀器連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量10μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算各6次甘草酸銨峰面積值的RSD為0.9%。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液同一批，在室溫條件下存放0h，2h，4h，8h，12h，24h的條件下進(jìn)樣10μL，按甘草酸銨峰面積計(jì)算，RSD為1.1%，表明供試品溶液24h存放期內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取相同批號(hào)的喘嗽寧片（0.6g/片）樣品，分別按上述供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定，6份樣品中的甘草酸銨含量RSD為1.1%，表明該方法的重復(fù)性良好。

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批樣品（已知含甘草酸銨1.64mg/g）6份各1.0g，分別精密加入對(duì)照品稱(chēng)重10.83mg、10.80mg所制備的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液4mL，按方法制備供試溶液，測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，詳細(xì)見(jiàn)表1。

3.7 樣品測(cè)定

取收集的喘嗽寧片3批，按上述供試品制備方法的制得供試品溶液進(jìn)行測(cè)定并依照外標(biāo)法計(jì)算成品甘草酸銨含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

4.1 檢定波長(zhǎng)選擇

本方法采用HPLC-DAD方法在200～400nm范圍內(nèi)對(duì)被測(cè)組分進(jìn)行掃描并進(jìn)行色譜峰純度檢測(cè)，結(jié)果表明，甘草酸銨在250 nm處有最大吸收且色譜峰純度良好，故本實(shí)驗(yàn)的測(cè)測(cè)波長(zhǎng)確定為紫外光250nm。

4.2 提取溶劑選用、提取方式考察

鑒于甘草藥材煎煮入藥，借鑒《中國(guó)藥典》（2015年版）甘草品種含量測(cè)定項(xiàng)下的制備方法，通過(guò)對(duì)50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇不同濃度提取溶劑的提取效力考察，比較了回流和超聲兩種提取方式及不同提取時(shí)間，依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定加以70%乙醇加熱回流30min的方式作為本實(shí)驗(yàn)供試品的提取制備方法。

4.3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定的甘草酸銨的提取時(shí)間、提取溶劑、檢測(cè)波長(zhǎng)、色譜柱類(lèi)型、流動(dòng)相條件，并進(jìn)行了檢驗(yàn)方法學(xué)的研究，該方法準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可有效對(duì)喘嗽寧片處方甘草藥材中活性成分進(jìn)行質(zhì)量控制，為加強(qiáng)中藥復(fù)方制劑監(jiān)管，進(jìn)一步提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

參考文獻(xiàn)

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