王 杰，王 碩，蔣榮華，周小雷，龔小妹，韋桂麗，繆劍華＊＊

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南寧 530299；2.廣西藥用植物研究所/西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室 南寧 530023）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種T，B 淋巴細(xì)胞參與的慢性系統(tǒng)自生免疫疾病[1]。該病好發(fā)于手、腕、足等小關(guān)節(jié)，并且反復(fù)發(fā)作，同時還會累及到人體的其他部位，輕者產(chǎn)生疼痛感，導(dǎo)致行動困難，重者會使關(guān)節(jié)畸形、功能受限，以致該部位失去正?；顒拥哪芰?，甚至危害到生命，這種臨床上表現(xiàn)為慢性、對稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變的疾病[2]，不僅給病人帶來了巨大的生理和心理上的痛苦，還給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。我國類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病率約0.32%-0.36%，已經(jīng)成為造成勞動力下降致殘的第一類疾病[3]，同時研究表明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的腫瘤發(fā)病率要明顯的高于正常人，目前國內(nèi)外市場上用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的的方法多種多樣，最主要的手段是在病情發(fā)生不可逆性病變之前，即在病情的早期采取有效的治療措施。其用于治療的化學(xué)藥品主要包括：非甾體抗炎藥，糖皮質(zhì)激素，免疫抑制劑，生物制劑，但這些藥物大多數(shù)只能對癥治療，延緩病情的發(fā)展，而不能對因治療，對病變畸形的組織、器官功能無法進(jìn)行恢復(fù)，且具有一定的毒副作用。因此，越來越多的醫(yī)藥學(xué)家逐漸將目光轉(zhuǎn)投到中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥等傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，以此來尋找治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎更好地手段。

在我國瑤族是一個歷史悠久，同時富有特色的少數(shù)民族，是典型的南方山地民族，主要分布在廣西和湖南、云南、廣東、貴州等省，總?cè)丝谟?00 萬之多，其中廣西占全國瑤族人口152.8 萬，是全國瑤族人口的62%。瑤族分布的地區(qū)普遍為環(huán)境惡劣，氣候潮濕，導(dǎo)致比其他地區(qū)更容易使瑤族人民誘發(fā)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病，從而影響到瑤族人民的正常生活，在長期與疾病的斗爭中，瑤族人民逐漸有了本民族獨特的治療方法和藥物。廣西金秀瑤族自治縣是全國成立最早的瑤族自治縣，被稱為“瑤藥之都”，有“世界瑤藥文化研究中心在中國，中國瑤族研究文化在金秀”的美稱?，幩庯L(fēng)濕骨痛噴霧劑是廣西金秀縣瑤醫(yī)醫(yī)院使用30 多年的傳統(tǒng)的臨床驗方，在傳統(tǒng)瑤醫(yī)的基礎(chǔ)上，該驗方是通過結(jié)合現(xiàn)代制劑技術(shù)開發(fā)研究而成的，主要由生斷腸草、兩面針、七葉一枝花、乳香、沒藥、九節(jié)風(fēng)、木鱉子等瑤藥組成，具有祛風(fēng)除濕、溫陽散寒、通絡(luò)止痛等功效，主要用于肢體關(guān)節(jié)疼痛，痛無定痛以及骨質(zhì)增生等癥[4]，其中斷腸草又名大茶葉、大茶藥、鉤吻等，為馬錢科植物斷腸草（胡蔓藤）的根和葉[5]，外用具有祛風(fēng)散瘀、消腫止痛的功能?，F(xiàn)代藥理表明，其生物堿鉤吻素子具有鎮(zhèn)痛作用[6]。兩面針為蕓香科植物光葉花椒的根、莖，性辛、苦、微溫，有小毒，用于風(fēng)濕痹痛、坐骨神經(jīng)痛等多種病癥。本實驗通過完全弗氏佐劑造模方法誘導(dǎo)大鼠足趾出現(xiàn)繼發(fā)性腫大，考察瑤藥風(fēng)濕骨痛噴霧劑對大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的影響，為瑤藥風(fēng)濕骨痛噴霧劑對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥品

風(fēng)濕骨痛噴霧劑自制：斷腸草、兩面針、七葉一枝花、乳香、沒藥、九節(jié)風(fēng)、木鱉子均購于廣西金秀縣，風(fēng)濕骨痛噴霧劑由廣西藥用植物園西南瀕危植物工程實驗室制備。風(fēng)濕骨痛噴霧劑處方除乳香、沒藥外藥材加10倍量80%乙醇超聲提取2 h，過濾。濾渣用5倍量80%乙醇超聲提取2 h 兩次，合并濾液，回收乙醇至3 L，加入乳香、沒藥，加熱溶解，待用。

消腫止痛酊（廣西壯族自治區(qū)花紅藥業(yè)有限公司，批號：20140505），雙氯芬酸鈉凝膠（先聲藥業(yè)，批號：35-150105）。

1.2 試劑

PGE2試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：S16010958），TNF-α試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：S24010957），RF 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：S11010953），IL-1 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：S14010955），IL-6 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號：S05010954）；弗氏完全佐劑（FCA，美國Sigma 公司，批號：098K8729）；氯化鈉注射液（昆明市宇斯藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：13010204）；乙醇消毒液（武漢市雪環(huán)醫(yī)用消毒用品有限公司，批號：20140507）；蒸餾水、去離子水均為實驗室自制。

1.3 實驗動物

雌性SD大鼠70只，體質(zhì)量200±20 g，SPF級，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2009-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（桂）2009-0004。飼養(yǎng)條件：動物分籠飼養(yǎng)，保持晝夜節(jié)律，室溫（22±2）℃中，濕度60%，自由取食飲水。

1.4 儀器

CP224S 型分析天平（德國Sartorius 公司），TC30K型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠），4K15型低溫高速離心機（美國sigma Sartoriu 公司），HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（上海天恒醫(yī)療器械有限公司），F(xiàn)200 型pro酶標(biāo)儀（Tecan Infinite），自制排水體積法測試儀（精密度0.02 mL）。

1.5 實驗方法

取70只SD大鼠，雌性，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為空白組、模型組、陽性組1（消腫止痛酊）、陽性組2（雙氯芬酸鈉凝膠）、風(fēng)濕骨痛噴霧劑高、中、低劑量組，每組10只。造模方法參照文獻(xiàn)完全弗氏佐劑造模方法造模[7]。實驗第1天開始造模：空白對照組注射0.1 mL生理鹽水，其余各組于右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑（CFA）0.1 mL 致炎。第10 天，足趾出現(xiàn)繼發(fā)性腫大并加重，表示藥物造模成功。給藥方法為：將風(fēng)濕骨痛噴霧劑配成高劑量（12.60 g·kg-1）、中劑量（6.30 g·kg-1）、低劑量（3.15 g·kg-1），按每100 g 體質(zhì)量取0.1 mL 噴于致炎部位，用透明膠布包扎，保持3 h，每天1 次，空白組、模型組以噴霧劑所用溶劑代替；陽性組1（消腫止痛酊）、陽性組2（雙氯芬酸鈉凝膠）按照以上同樣方法處理。致炎后第21天各組停藥，繼續(xù)觀察3天。

采用排水體積法測量致炎足（原發(fā)性）和對側(cè)足（繼發(fā)性）致炎前后的體積，計算腫脹度與腫脹抑制率。

腫脹度=致炎后體積-致炎前體積

腫脹抑制率（%）=[（對照組腫脹度-給藥組腫脹度）/對照組腫脹度]×100%

大鼠致炎后第12 天開始觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度，每3天1次，全身病變按5級分法評價（0分：無紅腫；1 分：小趾關(guān)節(jié)紅腫；2 分：趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4 分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹）。根據(jù)未注射佐劑的余下肢體的病變程度累計積分，計算出AI（各個關(guān)節(jié)的積分累計起來，即為每只大鼠的AI）。停藥后3 天，大鼠禁食不禁水12 h，用10%水合氯醛麻醉大鼠（0.3 mL·100g-1），大鼠翻正反應(yīng)消失后，打開腹腔，用真空管腹主動脈取血，室溫靜置4 h，1 000 r·min-1，溫度為4℃，離心10 min，分離血清，分裝后，放入-20 ℃冰箱保存。在致炎側(cè)踝關(guān)節(jié)上方0.5 cm 處剪下炎性足腫脹，縱向切開，5 mL生理鹽水4℃浸泡2 h，離心取上清。按照試劑盒要求測定血清及炎性組織液中的PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF的含量。

表1 各組大鼠體質(zhì)量的影響

表2 對AA大鼠致炎側(cè)（右后足）足趾腫脹度的影響（xˉ±s，n=10）

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)用（xˉ±s）表示。

2 實驗結(jié)果

2.1 對各組大鼠體質(zhì)量的影響

與空白組相比，模型組在第2 周、3 周有明顯的差異（P ＜0.01）；ROS高、中、低劑量組與空白組相比沒有明顯的差異（P ＞0.05）（表1）。

2.2 對AA大鼠足趾腫脹度的影響

造模后，2天足趾腫脹達(dá)到高峰，持續(xù)2-3天后，腫脹減輕，1周后再次出現(xiàn)腫脹，表明ROS能夠顯著抑制AA大鼠的足腫脹度。與模型組比較，ROS高劑量組在給藥15天后，對腫脹出現(xiàn)明顯的抑制作用（P ＜0.05）；給藥17 天，21 天，ROS 各劑量組均出現(xiàn)明顯的足趾腫脹抑制作用（P ＜0.05）（表2、表3）。

表3 對AA大鼠AI的影響（xˉ±s，n=10）

2.3 對AA血清中中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF含量的影響

與空白組相比較，模型組血清中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF 含量均顯著高于空白組（P ＜0.01，P ＜0.05）；與模型組相比，ROS 高、中、低劑量組均能顯著降低血清中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF 含量（P ＜0.01，P＜0.05）（表4）。

表4 對AA大鼠血清中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF含量的影響（xˉ±s，n=10）

表5 對AA大鼠炎性組織液中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF含量的影響（xˉ±s，n=10）

2.4 對AA大鼠組織液中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF含量的影響

與空白組相比較，模型組血清中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF含量明顯高于空白組（P ＜0.01）；與模型組相比，ROS 高、中、低劑量組均能顯著抑制組織液中PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF 含量（P ＜0.01，P ＜0.05）（表5）。

3 討論

完全弗氏佐劑性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎T細(xì)胞依賴性的AA模型，其原理為BCG作為抗原進(jìn)入機體使T細(xì)胞致敏（急性反應(yīng)炎癥），當(dāng)再次接觸抗原，致使T細(xì)胞分化增值，釋放各種淋巴因子以及直接殺傷靶細(xì)胞，引起單核細(xì)胞浸潤，同時由抗原抗體形成的免疫復(fù)合物激活補體，導(dǎo)致白細(xì)胞趨化激活，釋放一系列致炎因子產(chǎn)生局部和全身性炎性反應(yīng)（繼發(fā)反應(yīng)）。病理主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)原發(fā)性和繼發(fā)性病變，關(guān)節(jié)紅腫脹痛，關(guān)節(jié)滑膜組織增生，炎性細(xì)胞浸潤，血管翳生成，與人類的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特征極為相似，是篩選和研究治療人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的理想模型[8]。

PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF 等細(xì)胞因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中，起到十分重要的作用。這類細(xì)胞因子的升高與滑膜組炎性反應(yīng)和超長增生，關(guān)節(jié)變形有著密切的關(guān)系。IL-1、PGE2在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中是一種重要的炎性介質(zhì)，參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎FLSs（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞）的激活作用，是金屬蛋白酶的關(guān)鍵介質(zhì)，參與對關(guān)節(jié)的骨和軟骨的侵蝕[9,10]。IL-6 是一種多效性前炎癥因子，有多種生物活性，可以促進(jìn)自身的免疫現(xiàn)象，使急性炎癥轉(zhuǎn)化為慢性炎癥狀態(tài)，造成系統(tǒng)炎癥，破壞軟骨，骨侵蝕，滑膜增生[11-14]。TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展過程中的特征性細(xì)胞因子，其高水平的分泌可刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生PGE2和膠原酶，引起骨和和軟骨吸收的破壞，造成纖維細(xì)胞的增生，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理過程中起到關(guān)鍵作用[15,16]。RF是抗人或動物免疫球蛋白IgG 和Fc 段的抗體，多以IgM 型為主，它廣泛存在于患者血清或以免疫復(fù)合物形式沉積于關(guān)節(jié)滑膜，繼而激活補體，引起慢性漸進(jìn)性免疫炎癥損傷，從而誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，是作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎分類診斷中的重要指標(biāo)，具有提高類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷效率和敏感性、特異性，減少誤診和漏診的發(fā)生，對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展具有重要意義[17-21]。

本研究表明，風(fēng)濕骨痛噴霧劑能夠顯著抑制AA大鼠足腫脹度，降低AI 指數(shù)，證明了其良好的抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的效果。其作用機制可能是通過抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，抑制PGE2、IL-1、IL-6、TNF-α、RF 分泌，阻止細(xì)胞因子的炎性進(jìn)程，達(dá)到抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用。