周爭道，劉建明，楊宇秀，葉錫勇，高建華

（江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 上饒 334000）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's Disease，AD）是一種以進(jìn)行性的，常發(fā)于老年群體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。AD 的主要臨床表現(xiàn)為：患者記憶能力及自理能力下降，且同時還伴有精神類疾病及行為障礙。其發(fā)病率隨著年齡的增長急劇升高，嚴(yán)重影響到社會發(fā)展[2,3]。當(dāng)前學(xué)術(shù)界多認(rèn)為β-淀粉樣蛋白（β-amyloid Protein，Aβ）的沉積及異常代謝是引發(fā)AD 的關(guān)鍵誘因，也認(rèn)為Aβ與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡密切關(guān)系，Aβ可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4,5]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)AD還伴有神經(jīng)突觸的改變[6]。

傳統(tǒng)中藥苦參是豆科植物苦參的干燥根，具有抗菌消炎，能利尿、抗過敏、鎮(zhèn)痛、平喘、祛痰。苦參堿（Matrine，MAT）是中藥苦參的一種重要活性成分，一般為苦參總堿?？鄥⒈粡V泛用于抗腫瘤、抗心率失常及抗炎等治療[7-9]。截止目前，現(xiàn)代苦參制劑已經(jīng)有30多年的臨床應(yīng)用及藥理學(xué)研究歷史。其中，MAT的抗炎作用尤為突出，大量科學(xué)研究和臨床資料表明MAT是有激素樣作用而無激素副作用的強(qiáng)力抗炎藥[10,11]。近年來已有少量關(guān)于MAT 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥作用的報道[12,13]。但MAT對神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的動物學(xué)習(xí)記憶功能損傷的影響，并從海馬突觸超微結(jié)構(gòu)方面的研究尚未見文獻(xiàn)報道。本研究首次基于海馬突觸炎癥在AD發(fā)病過程中扮演的重要作用以及MAT良好的抗炎活性，采用大鼠海馬注射凝聚態(tài)凝聚態(tài)Aβ1-40構(gòu)建AD動物模型，通過給藥觀察MAT 對AD 大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，并考察其對海馬超微結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用，研究了MAT 對Aβ1-40所致AD 模型大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為進(jìn)一步闡明MAT 對AD 模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)性作用及機(jī)制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量在250-300 g，購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，動物合格證號：SCXK-2015-0004。大鼠標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)，經(jīng)Morris水迷宮初篩（大鼠適應(yīng)性游泳2 min，剔除呆滯不游和游泳姿勢不良者，剔除測試中2 min內(nèi)沒能找到平臺者）[14,15]。將36 只SD 大鼠隨機(jī)分為正常對照組（Normal control group，NC 組）、模型組（Model group，MC 組）和苦參堿組（Matrine group，MAT組），每組12只。

1.2 主要試劑和實驗儀器

Aβ1-40購于美國Sigma 公司；TUNEL 凋亡試劑盒購于美國promega 公司；鼠抗細(xì)胞色素C 購于SantaCruz公司；SP 試劑盒購于Zymed 公司；MAT 購于上海克隆生物高技術(shù)有限公司；BD 流式細(xì)胞儀FACSCalibur 購于美國BD公司；307-G臺式牙鉆車購于上海醫(yī)用儀器廠；江灣Ⅰ型C 大鼠腦立體定位儀購于上海川沙花木農(nóng)機(jī)廠；Image-ProPlusv6.0 顯微圖像分析系統(tǒng)購于MediaCy-bernetics公司；手術(shù)顯微鏡SXP-1C購于上海醫(yī)療器械股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Aβ1-40孵育

用無菌生理鹽水，將0.5 mg Aβ1-40稀釋成濃度為10 μg·μl-1的溶液，將恒溫箱溫度調(diào)至37℃，孵育1周，使其變?yōu)槟蹜B(tài)Aβ1-40，采用封口膜封口，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 大鼠模型的構(gòu)建

用6%水合氯醛腹腔注射麻醉SD 大鼠，將其固定于大鼠腦立體定位儀上。采用Cushman 和Pellegrino編著的《大鼠腦立體定位圖譜》所設(shè)計方法，以大鼠前囟為原點，向后4.0 mm，中線旁2.0-2.5 mm，采用微量進(jìn)樣器在顱骨面下進(jìn)針3.0-3.5 mm，每只SD 大鼠各1次性注射凝聚態(tài)Aβ1-405 μl造模[16,17]。NC組按照AD模型組方法，注射生理鹽水5 μL。MAT組大鼠在正常喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上從造模手術(shù)當(dāng)天開始灌胃MAT組15 mg·kg-1治療，NC 組及MC 組灌胃等劑量生理鹽水，各組共給藥28天。

1.3.3 電鏡觀察

生理鹽水或藥物干預(yù)結(jié)束后，大鼠以1%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）腹腔麻醉，用2%多聚甲醛-2.5%戊二醛緩沖液（pH=7.2）經(jīng)左心室主動脈插管灌注固定2 h后，參照腦立體定位圖譜，在每例動物的海馬區(qū)注射點附近將樣本組織切成數(shù)個1 mm小塊，放入上述固定液再固定3-4 h，常規(guī)包埋，半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡定位后，再做成超薄切片，經(jīng)醋酸鈾、枸椽酸鉛雙染色，H-600透射電鏡觀察突觸超微結(jié)構(gòu)[18]。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測

用藥15 天后，動物經(jīng)戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）腹腔麻醉，斷頭取腦，用PBS 將其中的血液洗干凈，取出海馬，并在手術(shù)顯微鏡下去除包膜和血管。將海馬剪碎成1-5 mm3大小，放入三角燒杯中，加入0.25%的胰蛋白酶4 mL，37℃水浴箱中消化，不停地輕輕幌動，每5 min 收集一次2/3 的消化液，同時加入等量新鮮的0.25%的胰蛋白酶繼續(xù)消化，收集的消化液置于盛有等量的含有10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液的離心管中終止反應(yīng)，并輕輕吹打數(shù)次，置于37℃培養(yǎng)箱中。消化完成后，將所有的離心管低速離心（1 000 r·min-1）5 min，倒掉上清液，收集沉底的細(xì)胞于同一離心管，并將細(xì)胞重懸于DMEM 培養(yǎng)液中；再離心5 min，棄去培養(yǎng)液。3 mL PBS洗滌、收集上述沉底的細(xì)胞1次，離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4℃，1 h。離心棄去固定液，3 mLPBS重懸5 min。400目的篩網(wǎng)過濾1次，離心5 min（1 000 r·min-1），棄去PBS，上樣測定。

1.3.5 TUNEL染色檢測

生理鹽水或藥物干預(yù)結(jié)束后，麻醉下經(jīng)左心室插管至主動脈，剪開右心耳，150 mL生理鹽水快速沖洗，再用4℃的4%多聚甲醛緩沖液300 ml 灌注，先快而后慢，取腦置于4℃的4%多聚甲醛液中恒溫冰箱內(nèi)后固定3 h，再放入30%蔗糖緩沖液中浸泡至下沉，取出進(jìn)行冰凍切片。采取在海馬注射點附近連續(xù)冠狀面冰凍切片，片厚20 μm，相鄰切片分4套將切片裱片于載玻片上，室溫下干燥。按Promega DeadEndTM Colorimetric TUNEL System 說明書操作顯微鏡（×400），每只動物每張切片隨機(jī)抽取海馬區(qū)10 個不相重復(fù)的視野計數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 免疫組織化學(xué)染色[19]

采用SP法操作：依次采用3%H2O2液浸潤10 min，正常的山羊血清37℃浸潤15 min，傾去，再分別滴入鼠抗細(xì)胞色素C（1∶300）抗體4℃過夜，然后用生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶100）37 ℃浸潤30 min，再用辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素液（1∶100）37℃浸潤30 min；通過DAB顯色，脫水，透明，中性明膠封片。PBS夜代替I抗作為陰性對照。每只SD大鼠隨機(jī)取切片3張，每張切片在注射區(qū)附近，隨機(jī)抽取3個不重疊的視野，在顯微鏡下采用Image-Proplusv 6.0 圖像分析系統(tǒng)測出細(xì)胞色素C陽性產(chǎn)物數(shù)及其平均光密度。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0 統(tǒng)計分析軟件，兩組間比較用t 檢驗計量資料，多組間比較采用方差分析。

圖1 大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)（透射電鏡×20000）

圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率（流式細(xì)胞直方圖）

2 結(jié)果

2.1 電鏡結(jié)果

大鼠海馬內(nèi)的神經(jīng)元軸突和樹突分支均以及膠質(zhì)細(xì)胞突起，而相互交織形成了神經(jīng)氈，各組突觸的超微結(jié)構(gòu)和數(shù)量均發(fā)生了不同程度的變化。NC 組大鼠神經(jīng)氈內(nèi)的突觸超微結(jié)構(gòu)清晰，整體數(shù)量多，其突觸前囊內(nèi)觀察，可見大量圓形透亮、輪廓清晰的突觸泡，且突觸后的膜胞漿面可觀察到電子密度高的致密物質(zhì)（圖1A）。與NC 組大鼠比較，MC 組大鼠的海馬神經(jīng)氈內(nèi)突觸的數(shù)量減少，突觸泡減少且輪廓不清，其致密物質(zhì)的厚度變薄（圖1B）。MAT 組大鼠海馬神經(jīng)氈內(nèi)的突觸數(shù)量及突觸前囊內(nèi)的突觸泡較之模型組增多，但仍比對照組少，致密物質(zhì)厚度亦較模型組增加（圖1C）。

表1 流式細(xì)胞儀檢測和TUNEL染色結(jié)果(xˉ±s,n=6)

2.2 流式細(xì)胞儀測定結(jié)果

NC 組出現(xiàn)典型二倍體峰，未見明顯的亞二倍體峰（圖2A）；MC 組在二倍體峰前面出現(xiàn)了典型的亞二倍體峰（圖2B），提示有大量凋亡發(fā)生；MAT 組的亞二倍體峰明顯降低（圖2C）。分析結(jié)果表明：MC組海馬細(xì)胞凋亡百分率較對照組顯著升高(P ＜0.01)，而MAT組海馬細(xì)胞凋亡百分率較MC組顯著降低(P ＜0.01（)表1）。

2.3 海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)的變化

經(jīng)TUNEL 染色，陽性細(xì)胞呈棕黃色，染色位于細(xì)胞核內(nèi)，并呈顆粒狀，小圓形或環(huán)形。NC 組大鼠呈陽性的細(xì)胞數(shù)極少見（圖3A）；MC組大鼠的海馬區(qū)TUNEL染色，呈陽性的細(xì)胞數(shù)量顯著增多（圖3B），表明有大量細(xì)胞調(diào)亡出現(xiàn)；MAT組大鼠呈陽性的細(xì)胞數(shù)量相對又較少（圖3C）。實驗結(jié)果提示：MC 組大鼠呈陽性的細(xì)胞數(shù)量較NC組顯著增加（P ＜0.01）；而MAT組大鼠的海馬區(qū)TUNEL 染色，呈陽性的細(xì)胞數(shù)量，較之模型組顯著減少（P ＜0.01）（表1）。

圖3 各組大鼠海馬TUNEL染色陽性細(xì)胞

表2 大鼠海馬細(xì)胞色素C免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(xˉ±s,n=6)

2.4 免疫組織化學(xué)染色

細(xì)胞色素C 的陽性產(chǎn)物呈棕黃色，以顆粒狀分布。NC組海馬細(xì)胞色素C陽性產(chǎn)物數(shù)量較少，且分布均勻，染色淺。MC組海馬細(xì)胞色素C的陽性產(chǎn)物數(shù)量較NC 組明顯增多（P ＜0.01），且出現(xiàn)大量集中分布現(xiàn)象，光密度較對照組明顯增高（P ＜0.01）；MAT 組海馬細(xì)胞色素C 的陽性產(chǎn)物數(shù)量明顯比MC 組減少（P ＜0.01），未出現(xiàn)大量集中現(xiàn)象，光密度也較MC組低（P ＜0.01）（表2）。

3 討論

認(rèn)知記憶功能方面的減退是AD 病人的重要臨床表現(xiàn)。本課題組前期Morris水迷宮檢測結(jié)果提示MAT對MC 大鼠的認(rèn)知記憶功能障礙有顯著的改善作用。大量老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和選擇性神經(jīng)元及突觸的丟失是AD病的重要神經(jīng)病理學(xué)特征。老年斑的核心成分Aβ代謝異常和沉積是AD 形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素[18,19]。有研究TUNEL 染色檢測和電鏡觀察顯示，腦內(nèi)注射凝聚態(tài)Aβ1-40，礎(chǔ)導(dǎo)致大鼠海馬突觸素免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物和突觸數(shù)量減少[20]。本實驗結(jié)果與上述研究相符，提示Aβ1-40對突觸有神經(jīng)毒性作用，但其神經(jīng)毒性作用的具體機(jī)制尚不清楚。

神經(jīng)細(xì)胞凋亡是AD 中神經(jīng)元大量丟失的主要原因之一，且被越來越多的實驗證據(jù)所支持[21]。在AD患者的腦組織標(biāo)本、動物模型、離體細(xì)胞實驗中，均發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的證據(jù)。大量的研究表明：AD病人腦組織切片中存在DNA 斷裂、染色質(zhì)顆粒狀改變和邊集、細(xì)胞外形的萎縮及不規(guī)則改變等凋亡特征性變化以及凋亡相關(guān)蛋白的改變[22]。本實驗結(jié)果顯示:模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞TUNEL 染色陽性細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增多；透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量減少，部分胞漿空泡化，雙層核膜欠清晰，核內(nèi)染色質(zhì)分布不均，向核膜邊集，形成不規(guī)則的高電子密度團(tuán)塊，呈現(xiàn)早期凋亡征象，提示Aβ1-40可誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

朱曉蕾等[23]發(fā)現(xiàn)Aβ1-42可誘導(dǎo)SD大鼠神經(jīng)元線粒體細(xì)胞色素C釋放增加，激活線粒體凋亡途徑，促使神經(jīng)元凋亡，從而導(dǎo)致海馬神經(jīng)元大量丟失，出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力障礙。本實驗免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也證實了上述結(jié)論，MC組海馬細(xì)胞色素C陽性產(chǎn)物數(shù)量和平均光密度明顯高于對照組，且出現(xiàn)大量集中分布現(xiàn)象。本實驗結(jié)果提示，Aβ1-40可促使細(xì)胞色素C 的釋放，激活線粒體凋亡途徑，促使神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

有研究表明，Aβ1-40可激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、NO 等免疫炎性產(chǎn)物，而AD 腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)可損害海馬突觸結(jié)構(gòu)[24]。因此，筆者認(rèn)為Aβ1-40對突觸的神經(jīng)毒性作用可能與AD 腦內(nèi)的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。MAT 是由苦參的干燥根、植株、果實經(jīng)乙醇等有機(jī)溶劑提取制成，具有較強(qiáng)的抗炎作用。本研究結(jié)果提示，經(jīng)MAT治療后海馬突觸受損程度減輕，表明MAT對AD 模型大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)有一定的保護(hù)作用，其可以抑制AD模型大鼠海馬免疫炎性介質(zhì)的表達(dá)。本研究基于海馬突觸炎癥在AD發(fā)病過程中扮演的重要作用以及MAT良好的抗炎活性，發(fā)現(xiàn)MAT可緩解Aβ1-40誘導(dǎo)的大鼠阿爾茨海默病和神經(jīng)炎癥，這些作用可能是通過減輕大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的破壞及減少海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用。