戴瀟逸, 鐘江

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)與微生物工程系, 上海 200438

柯薩奇病毒B3 (coxsackievirus B3，CVB3) 屬細(xì)小RNA病毒科(picornaviridae)腸病毒屬(enterovirus)，基因組為一條長(zhǎng)7.4 kb的單股正鏈RNA。CVB3通常引發(fā)輕癥感染，但作為病毒性心臟病的主要病原體[1-2]，可引發(fā)病毒性心肌炎和擴(kuò)張型心肌病，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致病人猝死。開(kāi)發(fā)低致病性的毒株對(duì)于制備減毒活疫苗有重要意義[3]。另外，有研究將CVB3用于腫瘤治療。如何使該病毒具有腫瘤細(xì)胞靶向性，也是一項(xiàng)重要的課題[4]。

microRNAs (miRNAs)是一類(lèi)非編碼小RNA，種類(lèi)眾多，在調(diào)控真核生物發(fā)育、免疫、腫瘤形成等方面有重要作用。它通過(guò)結(jié)合靶序列引發(fā)目標(biāo)mRNA的降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)。利用miRNA特異性降解目標(biāo)RNA的特點(diǎn)，在病毒基因組中加入特定miRNA的靶序列，就可以限制病毒在高水平表達(dá)該種miRNA的細(xì)胞中的復(fù)制。He等[5]利用miRNA靶序列限制CVB3對(duì)心肌細(xì)胞的趨向性，降低了野生型CVB3的致病力。

人類(lèi)miRNA hsa-miRNA-205(包括miR-205-3p和miR-205-5p，簡(jiǎn)稱(chēng)為miR-205)參與上皮細(xì)胞分化、遷移和凋亡[6-8]。有研究表明miR-205在人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中低表達(dá)[9-10]，而在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 細(xì)胞中高表達(dá)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了在CVB3基因組編碼區(qū)含有多拷貝miR-205靶序列的重組病毒v205T。實(shí)驗(yàn)顯示重組病毒在HeLa和A549細(xì)胞系中的復(fù)制呈現(xiàn)明顯差異，一系列小RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明病毒復(fù)制的差異由miR-205引起，證實(shí)了使用miR-205靶點(diǎn)改造CVB3的可行性。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和培養(yǎng)基

HeLa、A549細(xì)胞均采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。

1.2 CVB3感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

野生型CVB3 感染性克隆質(zhì)粒pCVB3-WT由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建(圖1A，未發(fā)表)，該質(zhì)粒以pcDNA3.1(+)為骨架，在CMV啟動(dòng)子后帶有CVB3全長(zhǎng)基因組，并以一段多聚腺苷序列(30 nt)結(jié)尾。在其下游加上了一段丁型肝炎病毒(HDV)的核酶序列[13]和牛生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(BGH polyA signal)。HDV核酶序列可以切去轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA 3端的多余序列，保證與天然病毒基因組一致。在pCVB3-wt中，病毒衣殼蛋白編碼區(qū)與2A蛋白酶編碼區(qū)之間插入miR-205靶序列。該靶序列由hsa-miR-205-3p互補(bǔ)序列(5′-GAAC-TTCACTCCACTGAAATC-3′)和hsa-miR-205-5p的互補(bǔ)序列(5′-CAGACTCCGGTGGAATG-AAGGA-3′)各3個(gè)拷貝串聯(lián)構(gòu)成，每個(gè)拷貝之間以5nt隨機(jī)核苷酸分隔。在保留原有病毒蛋白酶2A切割位點(diǎn)(TMTNTGAFGQQSGA)的同時(shí)，加入另一個(gè)同樣的位點(diǎn)，使插入序列上下游各有一個(gè)切割位點(diǎn)(圖1B)。插入序列由上海捷瑞生物公司合成，通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶插入目標(biāo)位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pCVB3-205T。經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證顯示正確。

A: Wild type CVB3 infectious clone. B:CVB3 infectious clone with miR-205 targets. PCMV: CMV promoter；5′ UTR, 3′ UTR: 5′ and 3′ untranslated region; A30: A string of poly-polyadenylic acid of 30nt; BGH polyA signal: Bovine growth hormone polyA signal; HDV ribozyme: Hepatitis D virus ribozyme.

圖1 CVB3 感染性克隆和插入miR-205靶位點(diǎn)克隆的結(jié)構(gòu)示意圖

Fig.1 Diagram of CVB3 infectious clone and the clone with miR-205 targets

1.3 重組病毒的拯救和傳代

以pCVB3-WT和pCVB3-205T質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑為DNA Transfectin 3 000(HEROGEN)，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。24 h后更換培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后觀測(cè)到大部分HeLa細(xì)胞發(fā)生裂解或出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象，此時(shí)收獲細(xì)胞培養(yǎng)物并凍融3次，5 000 g離心5 min后保留上清液，得到拯救病毒vWT和v205T。病毒在HeLa細(xì)胞中擴(kuò)增后用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 病毒滴度及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

待測(cè)病毒液10倍系列稀釋后，分別接種到長(zhǎng)有60%匯合度的HeLa細(xì)胞的96孔板上。培養(yǎng)3天后顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的病理變化，使用Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度(TCID50/mL)。在12孔板上接種匯合度為60%的HeLa細(xì)胞或A549細(xì)胞，以MOI=1(pfu/cell)接入v205T和vWT，孵育60 min后去除病毒液，以PBS清洗3次，隨后加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分時(shí)段收獲感染細(xì)胞和培養(yǎng)液，反復(fù)凍融、離心后測(cè)定病毒液滴度。

1.5 miRNA類(lèi)似物和抑制物

miRNA類(lèi)似物和抑制物(序列見(jiàn)表1)由上海吉瑪生物技術(shù)公司合成，用HiPerFect 轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞或A549細(xì)胞，具體步驟參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。RNA終濃度均為200 nmol。用兩種RNA轉(zhuǎn)染時(shí)每種的濃度均為100 nmol。轉(zhuǎn)染后5 h后用病毒感染細(xì)胞(MOI=2～3)，培養(yǎng)1h后更換200 μL培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)24 h(HeLa細(xì)胞)或48 h(A549細(xì)胞)。結(jié)束后吸取細(xì)胞培養(yǎng)液并測(cè)定病毒滴度。

表1 實(shí)驗(yàn)中用到的 miRNA類(lèi)似物及抑制物序列

Tab.1 miRNA mimics and inhibitors used in the study

NameSense(+/-)Sequences(5′-3′)hsa-miRNA-205-5pmimic+UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG-GACUCCGGUGGAAUGAAGGAUUhsa-miRNA-205-3pmimic+GAUUUCAGUGGAGUGAAGUUC-ACUUCACUCCACUGAAAUCUUNonspecificmiRNAmimic+UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-ACGUGACACGUUCGGAGAATThsa-miRNA-205-3pinhibitor+GAACUUCACUCCACUGAAAUChsa-miRNA-205-5pinhibitor+CAGACUCCGGUGGAAAUGAAGGANon-specificmiRNAinhibitor+CAGUACUUUUGUGUAGUACAA

1.6 細(xì)胞活性分析

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行病毒感染，感染一定時(shí)間后吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL新鮮的DMEM培養(yǎng)基和10 μL的CCK-8試劑(上海翊圣生物科技有限公司)，45 min后加入1% 十二烷基磺酸鈉溶液終止反應(yīng)，使用微孔板分光光度儀(BioTek Epoch)讀取OD450值，計(jì)算相對(duì)細(xì)胞活性。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)組均經(jīng)獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。每組實(shí)驗(yàn)測(cè)定3個(gè)樣本以上數(shù)據(jù)，各圖顯示測(cè)定結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 CVB3感染性克隆的構(gòu)建和重組病毒的獲得

在野生型CVB3感染性克隆質(zhì)粒(pCVB3-WT)中插入miR-205 目標(biāo)序列，構(gòu)建質(zhì)粒pCVB3-205T，即在病毒VP1和2Apro編碼區(qū)之間插入miR-205-5p及miR-205-3p的靶序列各3個(gè)拷貝，并將該位置原有的2A蛋白酶切割位點(diǎn)改為2個(gè)拷貝，分別位于插入序列的上下游，同時(shí)保證原開(kāi)放讀碼框架(open reading frame，ORF)不變，確保獲得的重組病毒能正確表達(dá)并產(chǎn)生病毒蛋白(圖1)。

以質(zhì)粒pCVB3-WT和pCVB3-205T轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，36h后陸續(xù)出現(xiàn)細(xì)胞病變；轉(zhuǎn)染72h后，幾乎所有的細(xì)胞都從細(xì)胞板上脫離，部分細(xì)胞裂解。將細(xì)胞凍融3次，得到病毒懸液vWT和v205T。

2.2 病毒在HeLa 和A549細(xì)胞中的復(fù)制

分別用vWT和v205T感染HeLa和A549細(xì)胞，定時(shí)測(cè)定病毒滴度，如圖2。結(jié)果顯示，2株病毒在HeLa細(xì)胞中的滴度增長(zhǎng)動(dòng)態(tài)接近，但在A549細(xì)胞中差異明顯， vWT在各個(gè)階段的滴度均顯著高于v205T，差別最大時(shí)超過(guò) 1 000 倍，48 h時(shí)差距有所縮小，但仍約為80倍左右(P<0.01)。感染48 h后，vWT感染的A549細(xì)胞多數(shù)發(fā)生了細(xì)胞病變，而v205T感染的A549細(xì)胞仍有相當(dāng)部分形態(tài)基本保持正常。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果與滴度測(cè)定結(jié)果一致?？梢?jiàn)miR-205靶序列的插入使病毒在A549 細(xì)胞中的復(fù)制水平下降(圖3)。

The averages of three replica were shown, and the error bars represented the standard errors.

圖2 vWT和v205T在Hela細(xì)胞和A549 細(xì)胞中的復(fù)制曲線

Fig.2 Growth curve of vWT和v205T in HeLa and A549 cells

HeLa: 48 h post infection; A549: 72 h post infection; Scale bars: 50 μm.

圖3 病毒感染HeLa和A549 細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡觀察

Fig.3 Light microscopy of virus-infected HeLa and A549 cells

2.3 miR-205類(lèi)似物顯著降低v205T在HeLa細(xì)胞中的復(fù)制

v205T在A549 細(xì)胞中的復(fù)制水平較在HeLa細(xì)胞顯著降低，這與miR-205在HeLa細(xì)胞中低表達(dá)而在A549 細(xì)胞中高表達(dá)[8-11]的報(bào)道相一致。為證明病毒復(fù)制水平確與細(xì)胞中miR-205表達(dá)水平有關(guān)，進(jìn)一步在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miR-205的類(lèi)似物，分析病毒復(fù)制和細(xì)胞病理效應(yīng)(圖4A)。

細(xì)胞活力檢測(cè)表明，HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染200 nmol miR-205-3p或miR-205-5p類(lèi)似物后，并沒(méi)有影響vWT感染造成的細(xì)胞死亡，但卻大大降低了感染v205T造成的細(xì)胞死亡，使細(xì)胞相對(duì)活性從0.03±0.01上升到0.26±0.04(miR-205-3p)和0.46±0.02(miR-205-5p)(圖4A)，病毒產(chǎn)量也隨之下降，尤其是當(dāng)miR-205-3p 和 miR-205-5p聯(lián)合使用時(shí)，滴度約降低到原來(lái)的1‰(圖4B)。這一結(jié)果證實(shí)miR-205的表達(dá)顯著降低v205T在HeLa細(xì)胞中的復(fù)制。

Cell viability (A) and virus titre (B) were determined 24 h post infection. The average of three replica were shown, and the error bars represented the standard errors. *:P<0.05; **:P<0.01.

圖4 轉(zhuǎn)染miR-205類(lèi)似物對(duì)病毒感染HeLa細(xì)胞的影響

Fig.4 The effect of miR-205 mimics on the virus infection in HeLa cells

2.4 miR-205抑制物顯著增強(qiáng)v205T在A549細(xì)胞的復(fù)制

在已知miR-205表達(dá)水平偏高的A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-205(miR-205-3p和miR-205-5p)抑制劑(濃度均各為100 nmol)，細(xì)胞相對(duì)活性從對(duì)照的0.38±0.01降低到0.19±0.01 (圖5A)，病毒效價(jià)也上升了10倍以上(圖5B)，證明了miR-205抑制物可以提高v205T對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。但是，miR-205(miR-205-3p和miR-205-5p)抑制物對(duì)vWT在A549中的復(fù)制沒(méi)有明顯影響。分別用miR-205-3p抑制物和miR-205-5p抑制物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同樣觀察到v205T對(duì)A549細(xì)胞殺傷作用的提高，包括細(xì)胞的活性下降(miR-205-3p：0.31±0.02；miR-205-5p：0.36±0.02)，使病毒滴度提高(miR-205-3p：6.6倍；miR-205-5p: 3.0倍)，但效果略低于兩種抑制物聯(lián)用(結(jié)果未在圖中顯示)。

3 討論

運(yùn)用miRNA的靶序列改建重組病毒的技術(shù)可在維持病毒基本增殖能力和基因組穩(wěn)定的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)在特定細(xì)胞中對(duì)病毒毒性和增值效率的有效調(diào)控，實(shí)現(xiàn)靶向性感染。該技術(shù)在弱毒株疫苗設(shè)計(jì)，腫瘤治療等領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用前景[14-16]。如，有研究利用miR-let-7b靶序列構(gòu)建了減毒H1N1流感病毒，該病毒在雞胚中具有正常的復(fù)制能力，但對(duì)小鼠的毒性明顯降低，在小鼠免疫實(shí)驗(yàn)中取得了良好的保護(hù)效果[17-18]。也有研究在腺病毒中加入了在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中低表達(dá)的4個(gè)miRNA(miR-124、miR-128、miR-146b和miR-218)的靶序列，得到的腺病毒對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的特異性有明顯提高[19]。由于miRNA 靶位點(diǎn)短小，該技術(shù)對(duì)于CVB3這類(lèi)基因組容量較小的病毒尤為適合。隨著對(duì)miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的積累，豐富、可用的miRNA靶點(diǎn)將有助于這一技術(shù)的完善和實(shí)際運(yùn)用。

The average of three replica were shown, and the error bars represented the standard errors. **:P<0.01

圖5 轉(zhuǎn)染miR-205抑制物對(duì)病毒感染A549細(xì)胞的影響

Fig.5 The effect of miR-205 inhibitor on the virus infection in 549 cells. Cell viability (A) and virus titre (B) were determined 48h post infection

本研究顯示，帶有miR-205目標(biāo)序列的v205T在A549細(xì)胞(miR-205高水平表達(dá))的復(fù)制效率顯著低于野生型病毒，而在的HeLa細(xì)胞(miR-205低水平表達(dá))中復(fù)制效率與野生型病毒一致。轉(zhuǎn)染miR-205類(lèi)似物可以抑制v205T在HeLa細(xì)胞中復(fù)制，轉(zhuǎn)染miR-205抑制物則可以提高v205T在A549細(xì)胞中的復(fù)制，而無(wú)論類(lèi)似物還是抑制物對(duì)野生型病毒的復(fù)制均無(wú)顯著影響。這些結(jié)果證明miR-205確實(shí)造成了病毒在2個(gè)細(xì)胞系中復(fù)制的差異。

細(xì)小RNA病毒基因組較小，編碼一個(gè)完整的ORF，因此在進(jìn)行重組改造時(shí)維持基因組正常功能非常重要。He等在CVB3基因組的5′和3′非翻譯區(qū)(untranslated regions，UTR)間選擇了4個(gè)位點(diǎn)，進(jìn)行插入隨機(jī)序列或miR-133和miR-206靶序列的嘗試，發(fā)現(xiàn)改造后的CVB3載體均不能產(chǎn)生有侵染力的子代病毒，因此選擇將miRNA靶序列放在ORF的起始密碼子之后[5]。本研究將miR-205的靶位點(diǎn)設(shè)置在CVB3的P1與P2編碼區(qū)之間，并使用2A蛋白酶切位點(diǎn)隔離插入序列和病毒基因。結(jié)果顯示v205T在HeLa細(xì)胞中與原型病毒具有相似的活性，基因組在傳代5次后仍能維持穩(wěn)定，表明這一構(gòu)建策略不會(huì)影響病毒的正常復(fù)制。此外，我們還嘗試了在病毒衣殼蛋白基因VP3和VP1之間插入兩側(cè)帶有3C蛋白酶(3Cpro)切割位點(diǎn)的Flag Tag序列，發(fā)現(xiàn)同樣能產(chǎn)生具有感染力的重組CVB3病毒，且其活力與野生型病毒相似(數(shù)據(jù)未顯示)。細(xì)小RNA病毒科的病毒在復(fù)制時(shí)首先產(chǎn)生一個(gè)大的蛋白，經(jīng)過(guò)2Apro、3Cpro等蛋白酶切割后變?yōu)槌墒斓鞍?。本研究的結(jié)果表明，在編碼區(qū)蛋白酶切割位置插入外源序列并同時(shí)添加蛋白酶切割位點(diǎn)，不會(huì)影響子代病毒的產(chǎn)生。

本研究證實(shí)，插入miRNA靶序列可有效地影響病毒的復(fù)制，但這究竟是因?yàn)樵斐闪瞬《綬NA的降解或是影響了病毒蛋白質(zhì)的合成，確切機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。另外，帶有miRNA靶位點(diǎn)的病毒遺傳穩(wěn)定性也值得研究。為了避免細(xì)胞miR-205對(duì)v205T的選擇壓力導(dǎo)致該位點(diǎn)變異的積累，應(yīng)選擇miRNA表達(dá)水平較低的細(xì)胞，甚至可選用敲除miR-205基因的細(xì)胞系用于該病毒的生產(chǎn)制備。

控制病毒毒性和細(xì)胞趨向性是制備溶瘤病毒和新型減毒活疫苗的重要因素。本實(shí)驗(yàn)為使用miRNA靶位點(diǎn)改造CVB3積累了數(shù)據(jù)，也可為CVB3病毒減毒活疫苗的制備或基于CVB3載體的溶瘤病毒的研發(fā)提供經(jīng)驗(yàn)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，可根據(jù)特定的需要，在病毒的基因組中插入多個(gè)miRNA靶序列，更有效地調(diào)控病毒復(fù)制水平和組織細(xì)胞靶向性。