譚會潔, 郭常川, 邢 晟, 趙艷霞, 張迅杰, 石 峰, 鞏麗萍

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 山東 濟(jì)南 250101)

隨著我國肥胖人群不斷增加,減肥類藥品及保健食品市場空間越來越大,無數(shù)商家競相掘金。與此同時(shí),市場的無序和混亂觸目驚心。一些減肥類保健食品的生產(chǎn)廠家受利益驅(qū)動(dòng),在保健食品中非法摻入減肥類化學(xué)藥,使其符合廣告所宣傳的治療效果以促進(jìn)銷售,由于處方中沒有標(biāo)明添加化學(xué)藥物的種類及劑量,如使用不當(dāng),將對服用者的健康和生命造成危害。為有效打擊這種制假摻偽的不法行為,有必要建立快速、專屬的方法鑒定保健食品中非法摻入的此類藥物。

與減肥功效相關(guān)的藥物主要包括食欲抑制劑(如西布曲明、芬氟拉明)、中樞興奮劑(咖啡因、麻黃堿等)、瀉藥(大黃素等)、利尿劑(呋塞米)等[1]。目前已報(bào)道的用于檢測非法添加減肥類藥物的分析方法主要包括薄層色譜聯(lián)用顯微紅外光譜法[2]、薄層色譜聯(lián)用原位拉曼光譜法[3]、高效液相色譜法(HPLC)[4,5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[1,6-13]、液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-HRMS)[14,15]、流動(dòng)注射-質(zhì)譜聯(lián)用法[16]等。LC-MS由于其具有快速簡便、靈敏度高、選擇性好的優(yōu)勢,是目前國內(nèi)外非法添加檢驗(yàn)領(lǐng)域的最常用方法[17-19]。已報(bào)道的LC-MS以低分辨質(zhì)譜法為主,也有兩篇高分辨質(zhì)譜法的文獻(xiàn)采用了飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF)[14,15]。作為高分辨質(zhì)譜兩種不同類型的質(zhì)量分析器,相對于TOF, Orbitrap由于其質(zhì)譜掃描分辨率的優(yōu)勢(最高可達(dá)1 000 000 FWHM[20]),能夠大幅提高篩查定性能力,保證結(jié)果更加真實(shí)可靠,同時(shí)具有媲美三重四極桿的定量性能。

本研究根據(jù)近年來國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[1-16]及多年的日常非法添加檢驗(yàn),確定了西布曲明、酚酞等15種非法添加減肥類化合物作為分析物,旨在開發(fā)一種簡便可靠的超高效液相色譜-Orbitrap高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-Orbitrap HRMS)方法,同時(shí)構(gòu)建TraceFinder篩查數(shù)據(jù)庫和自動(dòng)篩查方法,用于保健食品中15種非法添加減肥類藥物的高精度篩查、鑒定和定量,為日常的減肥類非法添加檢測工作提供更可靠的技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo Q ExactivePlusTM超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)包括Ultimate 3000液相泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱以及Orbitrap高分辨質(zhì)譜(Thermo,德國); XCalibur 4.0軟件(Thermo,美國),用于質(zhì)譜儀控制和數(shù)據(jù)處理;Mettler XS205電子天平(梅特勒,瑞士); Sigma 3K15高速冷凍離心機(jī)(Sigma,德國); KQ-300 GDV溫控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

15種減肥類對照品均購自中檢院(含量均>98.0%); HPLC級甲醇(純度99.9%)、乙腈(純度99.9%)以及超純水均購自Fisher公司(美國), HPLC級乙酸銨(純度97%)購自ACS恩科化學(xué)公司(美國);樣品信息:29批保健食品(全部為膠囊劑)來自山東省食品藥品監(jiān)督管理局或山東省各市、縣食品藥品監(jiān)督管理局監(jiān)督抽樣。隨機(jī)挑選未檢出15種減肥類成分的10批樣品,混合均勻,作為陰性樣品基質(zhì)。10批陰性樣品編號分別為Sample 4、Sample 7、Sample 8、Sample 10、Sample 13、Sample 16、Sample 19、Sample 20、Sample 22和Sample 29。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1對照品溶液的制備

分別取麻黃堿、克侖特羅、鹽酸芬氟拉明、鹽酸西布曲明對照品(A組)適量,精密稱定,分別用甲醇溶解并配成500 mg/L的對照品儲備液,各取適量,以甲醇稀釋為100 mg/L的混合對照品溶液I;分別取咖啡因、呋塞米、氯噻酮、苯佐卡因、布美他尼、依他尼酸、酚酞、芐氟噻嗪、大黃素、螺內(nèi)酯、奧利司他對照品(B組)適量,精密稱定,分別用甲醇溶解并配成500 mg/L的對照品儲備液,各取適量,以甲醇稀釋為100 mg/L的混合對照品溶液II。對照品儲備液、混合對照品溶液I和II均放置于-20 ℃冰箱保存。臨用前,恢復(fù)至室溫使用。

分別取混合對照品溶液I和II適量,以50%(v/v)甲醇水溶液逐級稀釋為系列對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液(A組化合物質(zhì)量濃度為1.0、5.0、10、20、50、100、200 μg/L, B組化合物質(zhì)量濃度為5.0、25、50、100、250、500、1 000 μg/L)。

1.2.2供試品溶液的制備

取供試品適量,研細(xì)后稱取約0.5 g,精密稱定,置于50 mL具塞離心管中,加入甲醇20 mL,渦旋1 min混勻,20 ℃恒溫超聲提取15 min,于10 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min,上清液過0.22 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液即得供試品溶液。若測得化合物濃度超過定量上限,則以50%(v/v)甲醇水溶液作為稀釋液,將供試品溶液稀釋后再進(jìn)行測定。

1.2.3色譜條件

色譜柱為Thermo Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm, 3 μm),流動(dòng)相:10 mmol/L的乙酸銨溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫程序:0～0.5 min, 5%B; 0.5～20.0 min, 5%B～90%B; 20.0～22.5 min, 90%B; 22.5～22.6 min, 90%B～5%B; 22.6～25.0 min, 5%B。流速:300 μL/min;柱溫:45 ℃;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:20 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。

表 1 15種減肥類化合物的Orbitrap HRMS數(shù)據(jù)庫Table 1 Orbitrap HRMS database of the 15 compounds

1.2.4質(zhì)譜條件

Q ExactiveTM質(zhì)譜系統(tǒng)配有HESI源,采用正負(fù)離子同時(shí)掃描模式,噴霧電壓為3.0 kV(正離子模式)或2.5 kV(負(fù)離子模式),毛細(xì)管溫度和噴霧溫度分別為350 ℃和250 ℃。鞘氣和輔助氣流速分別設(shè)為40和15 arb, S-lens RF電壓為50 V。質(zhì)譜掃描方式為Full MS/dd-MS2模式。Full MS(一級質(zhì)譜全掃描)分辨率設(shè)為70 000 FWHM,質(zhì)譜掃描范圍為m/z100～1 000,自動(dòng)增益控制(AGC)、最大注入時(shí)間(IT)分別設(shè)為1.0e6和100 ms; dd-MS2(數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描)分辨率設(shè)為17 500 FWHM, AGC設(shè)為2.0e5, IT設(shè)為50 ms,分離窗口設(shè)為m/z1.0,強(qiáng)度閾值(intensity threshold)設(shè)為4.0e4,同位素排除設(shè)為“on”,動(dòng)態(tài)排除設(shè)為10.0 s。各化合物的步進(jìn)歸一化碰撞能量(NCE)統(tǒng)一設(shè)為20、40、60。表1列出了15種化合物的分子式、保留時(shí)間、分子離子準(zhǔn)確質(zhì)量、碎片離子準(zhǔn)確質(zhì)量等信息。

1.3 軟件

使用TraceFinder 3.3軟件(Thermo,美國)進(jìn)行篩查定性,使用XCalibur 4.0軟件(Thermo,美國)進(jìn)行定量分析,使用Excel (Microsoft,美國)進(jìn)行必要的計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

為簡化操作步驟并提取得到盡可能多的化合物,本研究對超聲提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。分別考察了不同提取溶劑(甲醇、乙腈、50%(v/v)甲醇水溶液、50%(v/v)乙腈水溶液)和不同提取時(shí)間(10、15、30 min)的提取效果。結(jié)果表明,甲醇作為提取溶劑提取效率最高,而超聲提取15 min和30 min均可達(dá)到較高的提取效率?？紤]到節(jié)省樣品預(yù)處理時(shí)間,本研究選擇甲醇作為提取溶劑、超聲提取15 min。

分別以50%(v/v)甲醇水溶液稀釋對照品儲備液,得到10 mg/L的15種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別使用單針進(jìn)樣的方式注入質(zhì)譜儀,在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描,優(yōu)化質(zhì)譜條件(質(zhì)譜掃描極性、分子離子準(zhǔn)確質(zhì)量、噴霧電壓、毛細(xì)管溫度和噴霧溫度、鞘氣和輔助氣流速等),輸入至方法設(shè)置中。在建立的LC-MS聯(lián)用方法中,質(zhì)譜掃描方式選擇正負(fù)離子切換Full MS/dd-MS2模式,此模式包含一級全掃描和數(shù)據(jù)依賴的二級掃描,得到高精度一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜。其中,高分辨一級質(zhì)譜圖用于化合物的篩查、鑒定和定量,二級質(zhì)譜圖用于化合物確認(rèn)。

為選擇最佳流動(dòng)相,本研究考察對比了甲醇-水和乙腈-水混合體系,并在水相中分別添加了0.1%(v/v)甲酸水溶液、10 mmol/L甲酸銨、10 mmol/L乙酸銨等。結(jié)果表明,乙腈-10 mmol/L乙酸銨流動(dòng)相體系可獲得最佳的色譜峰形和分離效果,且正離子和負(fù)離子模式的不同化合物均能獲得較高的質(zhì)譜響應(yīng)。因此,本研究選擇乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相體系,并采用梯度洗脫程序。

圖 1 15種減肥類化合物的提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the 15 weight loss compounds

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1專屬性

取陰性樣品,按1.2.2節(jié)方法處理得到空白基質(zhì)溶液,進(jìn)樣分析?？瞻谆|(zhì)溶液的提取離子色譜圖(extracted ion chromatograms, XICs)中,各化合物保留時(shí)間處沒有干擾峰出現(xiàn)或干擾峰很小(低于定量限的10%),方法專屬性強(qiáng)。

取對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液(A組化合物濃度為5.0 μg/L, B組化合物濃度為25 μg/L)進(jìn)樣分析,記錄色譜圖(見圖1)。15種減肥類化合物可在25 min內(nèi)完成色譜分離和洗脫,峰形好,靈敏度高。代表性化合物----芬氟拉明的二級質(zhì)譜圖及裂解機(jī)理如圖2和圖3所示,二級質(zhì)譜碎片離子有助于確證化合物的存在,裂解機(jī)理闡明了主要碎片離子可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)及裂解途徑。

2.2.2基質(zhì)效應(yīng)

分別制備空白基質(zhì)加標(biāo)溶液和對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液(A組化合物濃度約為20 μg/L, B組化合物濃度約為100 μg/L),分別進(jìn)樣,計(jì)算二者響應(yīng)值百分比,即為基質(zhì)效應(yīng)[21]。15種化合物的基質(zhì)效應(yīng)在87.9%～105.4%范圍內(nèi),證明空白基質(zhì)對化合物響應(yīng)影響很小。

2.2.3線性范圍和靈敏度

取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣測定。以峰面積作為y,標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度作為x,擬合校正曲線,建立回歸方程,計(jì)算相關(guān)系數(shù)(r)。15種化合物的峰面積與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好,r均大于0.998,線性范圍寬,可滿足準(zhǔn)確定量的需求。以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)作為定量限(S/N≥10)。結(jié)果見表2。

圖 2 芬氟拉明的二級質(zhì)譜圖及碎片離子結(jié)構(gòu)推斷Fig. 2 MS2 spectrum of fenfluramine with fragment ion structures tentatively assigned

圖 3 芬氟拉明的二級碎片裂解機(jī)理Fig. 3 Fragmentation mechanism of fenfluramine

2.2.4回收率和精密度

精密稱取陰性供試品0.50 g至50 mL具塞離心管中,分別加入20 mg/L的A組混合對照品溶液20 μL、20 mg/L的B組混合對照品溶液100 μL,再加入20 mL甲醇,按照1.2.2節(jié)所述方法處理得到供試品溶液,其中A組化合物質(zhì)量濃度約為20 μg/L, B組化合物濃度約為100 μg/L。平行測定6次,計(jì)算回收率平均值和精密度(RSD),數(shù)據(jù)見表3。得到15種減肥類化合物的回收率范圍為79.7%～95.4%,精密度在3.3%～8.7%之間。

2.2.5穩(wěn)定性

考察了100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置1、2、4、8、12、24、48 h的穩(wěn)定性,15種化合物在上述時(shí)間下的穩(wěn)定性為 97.8%±2.5%(平均值±RSD),說明該條件下樣品穩(wěn)定性良好。

2.3 篩查數(shù)據(jù)庫的開發(fā)與應(yīng)用

本研究通過TraceFinder 3.3軟件實(shí)現(xiàn)了快速自動(dòng)篩查。首先,建立篩查數(shù)據(jù)庫和篩查方法。通過對照品溶液的UHPLC-HRMS進(jìn)樣分析可獲得15種減肥的保留時(shí)間、一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜準(zhǔn)確質(zhì)量,據(jù)此建立15種減肥類化合物的篩查數(shù)據(jù)庫,如表1所示。在數(shù)據(jù)庫中保存化合物的特征信息,如化合物名稱、分子式、可能的加合物(如[M+H]+、[M-H]-等)、保留時(shí)間、分子離子準(zhǔn)確質(zhì)量、碎片離子準(zhǔn)確質(zhì)量等。然后設(shè)定篩查的各項(xiàng)參數(shù),建立篩查方法。以分子離子和保留時(shí)間作為鑒定依據(jù),碎片離子和同位素分布作為確證依據(jù)。峰面積閾值設(shè)為10 000 000,分子離子準(zhǔn)確質(zhì)量和碎片離子準(zhǔn)確質(zhì)量偏差閾值均設(shè)為5×10-6(5 ppm),保留時(shí)間窗口設(shè)定為15 s,用于確證的碎片離子數(shù)量至少為2,同位素分布的擬合閾值設(shè)為90%,質(zhì)量偏差閾值設(shè)為5×10-6(5 ppm),同位素離子強(qiáng)度偏差閾值設(shè)為10%。

將UHPLC-HRMS采集的所有樣品原始數(shù)據(jù)(raw格式)直接導(dǎo)入TraceFinder軟件,以建立的篩查數(shù)據(jù)庫和篩查方法進(jìn)行自動(dòng)篩查。軟件會把儀器采集的樣品信息與篩查數(shù)據(jù)庫、篩查方法和接受標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行自動(dòng)比對。如果樣品中某個(gè)離子的4個(gè)篩查選項(xiàng)(即分子離子準(zhǔn)確質(zhì)量、保留時(shí)間、碎片離子準(zhǔn)確質(zhì)量及同位素分布)均符合篩查標(biāo)準(zhǔn)(通過標(biāo)準(zhǔn)則綠燈亮起),則判定樣品為陽性。圖4～6給出了代表性樣品Sample 3的提取離子色譜圖、一級全掃描質(zhì)譜圖、同位素分布比對圖及二級質(zhì)譜比對圖,圖中顯示了Sample 3的[M+H]+232.130 8離子實(shí)測和理論保留時(shí)間偏差(0.03 min,即1.8 s)、分子離子準(zhǔn)確質(zhì)量與理論值偏差(-1.256 1×10-6(-1.256 1 ppm))、碎片離子準(zhǔn)確質(zhì)量與理論值偏差(均小于2×10-6(2 ppm))及同位素分布(評分為100%)均在篩查方法設(shè)定的接受標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)。4個(gè)篩查選項(xiàng)標(biāo)記均為綠燈,Flag標(biāo)記也為綠燈,表明軟件判定Sample 3檢出了芬氟拉明。因此,使用已建立的數(shù)據(jù)庫和篩查方法進(jìn)行高度可靠的快速自動(dòng)篩查,可以將假陽性和假陰性樣品的風(fēng)險(xiǎn)降至最低。

表 2 15種化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 2 Regression equations, correlation coefficients (r), and linear ranges of the 15 compounds

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

表 3 減肥類化合物的回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precisions of the 15 compounds (n=6)

圖 4 代表性陽性樣品的提取離子色譜圖及一級全掃描質(zhì)譜圖Fig. 4 Extracted ion chromatograms (XICs) and full scan mass spectrum of a representative positive sample

圖 5 代表性陽性樣品中芬氟拉明的同位素分布及TraceFinder比對Fig. 5 Isotope pattern and the TraceFinder fit of a representative positive sample

圖 6 代表性陽性樣品中芬氟拉明的二級質(zhì)譜圖及TraceFinder比對Fig. 6 MS2 spectra and the TraceFinder fit of a representative positive sample

2.4 實(shí)際樣品檢測

將建立的UHPLC-Orbitrap HRMS分析方法用于29批保健食品樣品中非法添加減肥類藥物的檢測,將得到的raw原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入TraceFinder 3.3篩查軟件,根據(jù)TraceFinder中建好的篩查數(shù)據(jù)庫和篩查方法進(jìn)行快速自動(dòng)篩查,并使用XCalibur軟件對陽性樣品進(jìn)行定量分析。

在總計(jì)29批次樣品中檢出6批陽性樣品,陽性率為20.7%。檢測到的非法添加物涉及鹽酸西布曲明、酚酞、鹽酸芬氟拉明、依他尼酸,非法添加物含量(見表4)差異很大,有的甚至遠(yuǎn)超臨床用量。此外,在陽性樣品中還發(fā)現(xiàn)了幾種化合物同時(shí)添加的現(xiàn)象,如Sample 14同時(shí)添加了鹽酸芬氟拉明與依他尼酸。這些結(jié)果表明了非法添加的隨意性及不可預(yù)料性,對消費(fèi)者健康具有較大危害。

表 4 陽性樣品檢出成分及含量Table 4 Detected compounds and their contents in positive samples

3 結(jié)論

本研究建立了檢測保健食品中非法添加減肥類藥物的液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法,采用TraceFinder軟件構(gòu)建了Orbitrap高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,建立了篩查方法,將液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入TraceFinder軟件進(jìn)行快速、自動(dòng)篩查分析。陽性樣品可使用XCalibur軟件進(jìn)行定量。本方法靈敏度高、選擇性好,篩查分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠,自動(dòng)化程度高,可滿足同時(shí)定性和定量的需求,適用于保健食品中減肥類藥物的非法添加檢測,已用于日常檢測工作中,為監(jiān)管減肥類非法添加提供了有力的技術(shù)支持。