王俊虎, 喬勇升, 王 建, 朱 淵

(泰州市食品藥品檢驗所, 江蘇 泰州 225300)

六神曲又名神曲、六曲,始載于唐《藥性論》,為復方天然發(fā)酵曲劑[1,2],由苦杏仁、青蒿、蒼耳草、辣蓼、赤小豆按照一定的比例混合,再加入面粉和麥麩后經(jīng)發(fā)酵而成[3]。六神曲的主要功效為健脾和胃、消食調(diào)中,為中醫(yī)臨床上最常用的消食藥物之一,主要含有酶類、揮發(fā)油、麥焦甾醇、酵母菌等,臨床療效確切[4]。因六神曲采用傳統(tǒng)工藝經(jīng)發(fā)酵制成,所以在發(fā)酵過程中可能會引入雜菌,王秋紅等[5]對六神曲發(fā)酵微生物進行分離和鑒定,確定其含有黃曲霉菌等3種真菌,另有文獻[6]報道在六神曲中檢測到生物毒素黃曲霉毒素和雜色曲霉素,而關于六神曲中米酵菌酸(bongkrekic acid)殘留的研究鮮有報道。

米酵菌酸是由椰毒假單胞菌米面亞種產(chǎn)生的一種脂肪酸代謝產(chǎn)物,它最早由荷蘭學者于20世紀30年代在研究食物中毒時發(fā)現(xiàn)[7],米酵菌酸的分子式為C28H38O7,相對分子質量為486.6[8]。研究表明,米酵菌酸會抑制線粒體腺嘌呤核苷酸轉移酶(ANT)的活性,從而抑制線粒體中ATP的合成,導致細胞凋亡、損傷[9,10]。食用含有米酵菌酸的食物會引起肝臟、腦部和腎臟細胞損傷,嚴重的甚至會導致人體死亡[11]。發(fā)酵米面制品、變質銀耳和發(fā)酵的椰子及其制品容易被椰毒假單胞菌污染,產(chǎn)生米酵菌酸,誤食含有米酵菌酸的食物很容易導致食物中毒[12,13]。2015年在莫桑比克一個村莊的婚禮上爆發(fā)了群體性食物中毒事件,事件導致75人死亡,177人住院,有關機構在婚禮上的一種椰子制品食物中發(fā)現(xiàn)了相當含量的米酵菌酸[12]。2014年云南省文山縣發(fā)生了一起因食用自制吊漿粑湯圓而導致的食物中毒事件,事件共造成6人死亡,事后調(diào)查發(fā)現(xiàn)該食物中毒事件是由椰毒假單胞菌亞種唐菖蒲伯克霍爾德菌污染吊漿粑產(chǎn)生大量米酵菌酸所致[14]。

目前米酵菌酸的檢測方法主要有薄層色譜法、紫外分光光度法、液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質譜法[15,16]。其中薄層色譜法步驟復雜,靈敏度低,不適合大批量樣品的檢測;紫外分光光度法專屬性差,靈敏度低;液相色譜法分析時間長,靈敏度較低;超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法前處理簡單,分析時間短,專屬性好,靈敏度高,適合大批量樣品的快速檢測。當前文獻[12-16]關于米酵菌酸的檢測多集中在食品中,比如發(fā)酵米面制品和銀耳等,并沒有相關文獻介紹中藥六神曲中米酵菌酸的檢測方法,更沒有文獻報道六神曲中存在米酵菌酸殘留的現(xiàn)象。而六神曲制備工藝中最關鍵的步驟是藥材混合后加入面粉和麥麩發(fā)酵,發(fā)酵過程中面粉和麥麩很有可能被椰毒假單胞菌污染,進而產(chǎn)生米酵菌酸。發(fā)酵米面和銀耳僅含有一種物質,基質相對單一。六神曲的組方中共有6種藥材,與發(fā)酵米面和銀耳相比含有的化學成分更多,基質更為復雜。因此亟須建立一種高效、靈敏、快速的檢測方法確認六神曲中是否存在米酵菌酸殘留。因此本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法快速測定六神曲中的米酵菌酸,為六神曲中米酵菌酸殘留的日常監(jiān)管和風險監(jiān)控提供研究基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters UPLC Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀,含有超高效液相色譜儀、電噴霧電離(ESI)源和三重四極桿質量分析器(美國沃特世公司); AE-200型萬分之一和XS105DU型十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司); SK5200HP型超聲波提取器(上海科導公司); MILLI-Q超純水制備儀(美國密理博公司)。

米酵菌酸標準品(純度為95%,批號:CDAF-B6179)購自美國Sigma公司;甲醇和乙腈(色譜純)購自美國默克公司;甲酸(質譜純)購自美國Anaquachemical Supply公司;水為Milli-Q制備的超純水;Oasis MAX陰離子固相萃取小柱購自美國Waters公司;六神曲樣品購自本地中藥材市場。

1.2 標準溶液配制

取米酵菌酸標準品10.56 mg,用甲醇配制成100 μg/mL的標準儲備液,于-20 ℃棕色試劑瓶中避光保存。取適量米酵菌酸標準儲備液,用乙腈-含0.1%(體積分數(shù))甲酸的10 mmoL/L甲酸銨溶液(50∶50, v/v)進行稀釋,配制成質量濃度分別為0.5、1、5、10、50、100 μg/L的系列標準溶液;分別取適量米酵菌酸標準儲備液用六神曲空白提取液進行稀釋,配制成質量濃度分別為0.5、1、5、10、50、100 μg/L的系列基質標準溶液。

1.3 實驗條件

1.3.1樣品前處理

準確稱取已粉碎均質后的六神曲供試品(2.00±0.02) g,置于50 mL具塞錐形瓶中,加入甲醇20 mL,超聲30 min,再用氨水調(diào)節(jié)pH值至8,過濾,取續(xù)濾液10 mL,上Oasis MAX強陰離子交換固相萃取柱(預先分別用5 mL甲醇和5 mL水活化),依次用5 mL水和5 mL甲醇淋洗,抽干,最后用8 mL含2%(體積分數(shù))甲酸的甲醇洗脫柱子,洗脫液于50 ℃旋轉蒸發(fā)儀下蒸干,用乙腈-含0.1%(體積分數(shù))甲酸的10 mmoL/L甲酸銨溶液(50∶50, v/v)復溶,并定容至2 mL,再經(jīng)過0.22 μm有機微孔濾膜過濾,待上機檢測。

1.3.2液相色譜條件

色譜柱:Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:35 ℃;流動相A:乙腈;流動相B:含0.1%(體積分數(shù))甲酸的10 mmoL/L甲酸銨溶液;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～0.3 min, 50%A; 0.3～1.0 min, 50%A～90%A; 1.0～1.9 min, 90%A; 1.9～2.0 min, 90%A～50%A; 2.0～4.0 min, 50%A。進樣體積:10 μL。

1.3.3質譜條件

離子源:ESI源;離子模式:負離子模式;離子源溫度:150 ℃;掃描方式:多反應監(jiān)測(MRM)模式;毛細管電壓:3.0 kV;錐孔電壓:20 V;脫溶劑氣溫度:350 ℃;脫溶劑氣流速:650 L/h。米酵菌酸的其他質譜參數(shù)見表1。

表 1 米酵菌酸的質譜參數(shù)Table 1 MS parameters of bongkrekic acid

* Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1質譜條件的優(yōu)化

米酵菌酸的分子式為C28H38O7,相對分子質量為486.6[8]。實驗過程中,對米酵菌酸標準溶液同時進行正離子和負離子模式全掃描,正離子模式下準分子離子峰[M+H]+的m/z為487.5;負離子模式下準分子離子峰[M-H]-的m/z為485.4,且負離子模式下的響應值更高,所以實驗采用負離子模式電離。在ESI-模式下,選擇m/z為485.4的離子作為母離子,進行子離子全掃描,得到米酵菌酸的二級質譜圖。如圖1所示,米酵菌酸在碰撞室中主要碎裂成m/z為441.4、397.3、379.3、365.3、347.3和321.4的碎片,推測其可能的裂解途徑見圖2。將一定濃度的米酵菌酸標準溶液通過灌注模式直接進質譜儀分析,通過調(diào)諧質譜參數(shù)得到最佳響應值后選擇485.4/441.4、485.4/397.3、485.4/365.3、485.4/321.4離子對作為MRM檢測離子對,其中485.4/441.4的離子對響應值最高,故將其作為定量離子對,其余作為定性離子對。

圖 1 米酵菌酸的二級質譜圖Fig. 1 MS/MS spectrum of bongkrekic acid

2.1.2色譜條件的優(yōu)化

米酵菌酸為長鏈脂肪酸類化合物,本身含有3個羧酸基團,因此其在色譜柱中的保留行為受溶液pH值的影響較大。理論上，在堿性條件下，米酵菌酸極性增大,在色譜柱上的保留能力減弱；酸性條件下其保留能力增強。實驗分別考察了乙腈-10 mmoL/L甲酸銨體系、乙腈-0.1%(體積分數(shù))甲酸水體系、乙腈-含0.1%(體積分數(shù))甲酸的10 mmoL/L甲酸銨溶液體系和乙腈-氨水溶液(pH=8)體系進行梯度洗脫時的分離效果。結果表明，采用乙腈-含0.1%(體積分數(shù))甲酸的10 mmoL/L甲酸銨溶液體系時，米酵菌酸能得到良好的峰形、最佳的分離效果和穩(wěn)定的響應值;采用乙腈-氨水溶液(pH=8)時的響應值最高,但峰形較差,且保留時間過短。同時分別對有機相進行考察,在甲醇條件下,米酵菌酸峰形較差,且色譜柱壓力過高。因此實驗選擇乙腈-含0.1%(體積分數(shù))甲酸的10 mmoL/L甲酸銨溶液作為流動相進行梯度洗脫。

圖 2 米酵菌酸的質譜特征性裂解途徑Fig. 2 Typical MS fragmentation pathway of bongkrekic acid

圖 3 標準品和陽性樣品(shenqu5)的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of a standard sample and the positive sample (shenqu5)

實驗同時考察了Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和Waters HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)的分離效果。在乙腈-含0.1%(體積分數(shù))甲酸的10 mmoL/L甲酸銨溶液作為流動相的條件下,通過調(diào)節(jié)梯度洗脫程序、流速等色譜參數(shù)來確定最佳色譜條件。結果顯示,米酵菌酸在Waters HSS T3色譜柱上能夠得到最佳的分離效果和穩(wěn)定的響應值,因此最終選擇Waters HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)分離標準品和樣品溶液。

標準品和陽性樣品(樣品編號:shenqu5)的色譜圖見圖3。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

米酵菌酸為有機酸,為了得到最好的提取凈化效果和良好的回收率,最適宜采用陰離子固相萃取小柱處理樣品。實驗考察了采用MAX強陰離子交換萃取小柱和WAX弱陰離子交換萃取小柱時米酵菌酸的回收率。取陰性六神曲樣品,加入一定量的米酵菌酸標準品,分別用MAX和WAX小柱按照1.3.1節(jié)所述處理樣品。實驗結果顯示,MAX萃取柱能夠很好地吸附米酵菌酸,在5 mL水和5 mL甲醇洗脫液中均檢測不到米酵菌酸,僅在2%(體積分數(shù))甲酸甲醇洗脫液中檢測到米酵菌酸,其回收率大于80%; WAX萃取柱對于米酵菌酸的吸附效果較差,在5 mL水和5 mL甲醇洗脫液中均能檢測到米酵菌酸,米酵菌酸的回收率僅為50%。故實驗最終采用MAX強陰離子固相萃取小柱處理樣品。

2.3 基質效應的考察

六神曲為六種中藥材經(jīng)過發(fā)酵制成的曲劑中藥,成分較為復雜,有可能對質譜離子化產(chǎn)生影響,為了保證實驗的準確性,需要考察六神曲中米酵菌酸測定的基質效應。使用流動相配制質量濃度為0.5、1、5、10、50、100 μg/L的標準工作溶液。使用檢測結果為陰性的六神曲樣品制備空白基質提取液,通過空白基質提取液制備相同濃度的基質標準工作液。分別進樣測定標準工作液和基質標準工作液,以質量濃度為橫坐標,相應的峰面積為縱坐繪制標準曲線和基質標準曲線。本文參照凌阿茹等[17]的描述,用信號增強或抑制的程度(SSE)來評價基質效應,計算公式如下:

S1和S2分別為基質標準曲線和溶劑標準曲線的斜率。SSE值在80%～120%范圍內(nèi)為正常值;當SSE高于120%時,表示存在信號增強效應;當SSE低于80%時,表示存在信號抑制效應[18]。經(jīng)過測定,六神曲中米酵菌酸的基質效應為91.4%,在正常范圍內(nèi),不存在增強和抑制效應,因此實驗采用溶劑標準曲線來進行定量分析。

2.4 方法學考察

2.4.1線性關系、檢出限和定量限

取質量濃度分別為0.5、1、5、10、50、100 μg/L的系列溶劑標準溶液,按照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)實驗條件進行分析,以米酵菌酸的峰面積為縱坐標(Y)、相應的質量濃度為橫坐標(X, μg/L)繪制標準曲線(見表2)。用空白基質溶液稀釋米酵菌酸標準溶液,然后按1.3節(jié)條件進行測定,以信噪比(S/N)為3和10時的含量分別確定米酵菌酸的檢測限(LOD)和定量限(LOQ),結果見表2。

由表2可知,米酵菌酸在0.5～100 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好,相關系數(shù)(R2)>0.99。米酵菌酸在六神曲中的檢出限為0.4 μg/kg,定量限為1.2 μg/kg,說明方法靈敏度高,可適于六神曲樣品中米酵菌酸的檢測。

表 2 米酵菌酸的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equation, linear range, correlation coefficient (R2), LOD and LOQ of bongkrekic acid

表 3 米酵菌酸的加標回收率和日內(nèi)、日間精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries, precisions of intra-day and inter-day of bongkrekic acid (n=6)

2.4.2回收率與精密度

精密稱取陰性樣品2 g,在其中加入米酵菌酸標準品適量,按照1.3節(jié)描述制備供試品溶液,并進行儀器測定,用外標法計算回收率,結果見表3。對加標水平分別為1.2、20.0、100.0 μg/kg的樣品連續(xù)測定6次,連續(xù)測定3 d,計算方法的日內(nèi)和日間精密度。

結果表明，米酵菌酸的加標回收率為80.6%～85.3%,日內(nèi)和日間精密度分別為4.2%～6.8%和8.2%～13.2%。說明本方法回收率好,準確性高。

2.5 實際樣品分析

應用本方法對購自市場上的10批六神曲樣品進行檢測,10批樣品中只有4批樣品未檢出米酵菌酸,6批樣品為陽性結果,檢出了米酵菌酸,其含量最高達到了108.4 μg/kg,最低為8.9 μg/kg。

3 結論

本文建立了六神曲中米酵菌酸殘留的檢測方法。本方法快速、簡便,準確性高,可適用于六神曲中米酵菌酸殘留的風險監(jiān)控。實際樣品測定中,揭示了六神曲中存在生物毒素米酵菌酸污染的現(xiàn)狀,為中藥材和相關保健食品的安全性控制提供了研究基礎,建議有關部門加強相應的監(jiān)管工作。