陳興連, 林 濤, 劉興勇, 梅文泉, 楊東順, 李彥剛, 李茂萱, 汪祿祥

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所, 云南 昆明 650224; 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(昆明), 云南 昆明 650224)

磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類、孔雀石綠等藥物具有消毒、殺菌等功效,常作為殺菌劑和抗寄生蟲藥廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中,在預(yù)防、控制和治療水產(chǎn)生物病蟲害、促進(jìn)養(yǎng)殖對象健康生長、滿足人類對動物性食品需求等方面做出了巨大貢獻(xiàn)[1-3]。但研究[1,4]證明,磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類抗生素蓄積于體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性菌株,使得可利用、有效的抗生素越來越少,也會使肌體產(chǎn)生過敏反應(yīng)、激素障礙變態(tài)反應(yīng)?？兹甘G在生物體內(nèi)代謝降解為隱色孔雀石綠,二者均為三苯甲烷類藥物,長期食用含有孔雀石綠及代謝物殘留的水產(chǎn)品容易引起肝、心臟、腎、眼睛、血液、皮膚等臟器和組織慢性中毒[5],且三苯甲烷類及某些抗生素還具有較強的致癌、致畸、致突變的嚴(yán)重危害。我國農(nóng)業(yè)部235號文件[6]將氯霉素、孔雀石綠列為禁用藥物,不得在動物性食品中檢出,而甲砜霉素、氟甲砜霉素、磺胺類、喹諾酮類雖然可以合理使用,但也規(guī)定了休藥期和最大殘留限量,磺胺類藥物在肌肉組織中的總量不得超過100 μg/kg,恩諾沙星與環(huán)丙沙星之和不得超過100 μg/kg,諾氟沙星不得超過2.0 μg/kg,甲砜霉素不得超過50 μg/kg,氟甲砜霉素不得超過1 000 μg/kg。由于少數(shù)人因個人私利驅(qū)使,不遵守休藥期,擅自加大用藥量或其他有效替代藥較少等,導(dǎo)致這些獸藥在水產(chǎn)品中的殘留時有發(fā)生[7,8]。因此,這些藥物近年來被列為水產(chǎn)品質(zhì)量安全的重點監(jiān)控項目。

目前,檢測磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類、孔雀石綠及隱色孔雀石綠的方法有酶聯(lián)免疫法[9,10]、生物法[11]、氣相色譜法[12]、高效液相色譜法[13,14]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[15-18]等。生物法及酶聯(lián)免疫法雖有前處理簡單、測定速度快等特點,但前者特異性差,易受其他結(jié)構(gòu)類似藥物的干擾,且靈敏度不高;后者靈敏度雖高,但檢測結(jié)果存在假陽性[15];高效液相色譜法、氣相色譜法靈敏度低,選擇性差,目標(biāo)物需衍生化反應(yīng),且多為分類檢測,前處理復(fù)雜、耗時,檢測周期長,成本高,遠(yuǎn)不能滿足快速發(fā)展的檢測需要。近年來,HPLC-MS/MS由于其重現(xiàn)性好,抗干擾能力強,準(zhǔn)確性和靈敏度高,檢出限低,能在短時間內(nèi)同時將多種目標(biāo)物快速分離和檢測,越來越廣泛地被應(yīng)用于多獸藥殘留的分析中[19-21]。然而,大部分國家標(biāo)準(zhǔn)[16,17]、農(nóng)業(yè)部公告[18]等的前處理方法無法實現(xiàn)性質(zhì)迥異的多類獸藥于一個提取體系、凈化體系中完成,因此,HPLC-MS/MS的優(yōu)勢得不到充分發(fā)揮,嚴(yán)重制約了獸藥檢測技術(shù)的發(fā)展。分散固相萃取(DSPE)技術(shù)是一種凈化農(nóng)、獸藥殘留較為簡單,便捷、適用范圍較廣的樣品凈化技術(shù),將DSPE與HPLC-MS/MS相結(jié)合,能夠解決同一樣品中多類獸藥分類凈化,再分別用不同方法測定的問題[22]。由于水產(chǎn)品例行監(jiān)測項目包含孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氯霉素類、磺胺類、喹諾酮類20種獸藥,若按標(biāo)準(zhǔn)及公告方法,應(yīng)分為3類進(jìn)行前處理及上機測定,需耗費大量時間、人力、物力、財力,而同時測定水產(chǎn)品中這20種藥物殘留還鮮有報道。因此,本文以魚和蝦為研究對象,利用超高效液相色譜-三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀,采用分散固相萃取凈化技術(shù),通過優(yōu)化提取條件、凈化條件、液相色譜條件、質(zhì)譜條件等,實現(xiàn)了魚和蝦中4類20種獸藥的同時測定,為水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險監(jiān)測及隱患排查提供高效、便捷、低成本的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1290超高效液相色譜儀(美國Agilent公司); ZORBAX RRHD C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美國Agilent公司); QTRAP 5500三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司);渦旋振蕩器(美國Thermo Scientific公司); AE 100電子分析天平(瑞士MettlerToledo公司); TGL-15 B型高速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國海道爾夫公司)。

磺胺二甲異噁唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁林、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲噻噁唑、恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(10 mg/L),孔雀石綠、隱色孔雀石綠溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(100 mg/L), 孔雀石綠-D5(氘代孔雀石綠)、隱色孔雀石綠-D6(氘代隱色孔雀石綠)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(50 mg/L), 恩諾沙星-D5(氘代恩諾沙星)、諾氟沙星-D5(氘代諾氟沙星)、環(huán)丙沙星-D8(氘代環(huán)丙沙星)、磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3(氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶)、磺胺間二甲氧嘧啶-D6(氘代磺胺間二甲氧嘧啶)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(5 mg/L),氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(100 mg/L), 氯霉素-D5(氘代氯霉素)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(5 mg/L)(均購于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心,北京);氨水(分析純,含量25%～28%,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司);甲醇、乙腈(均為色譜純,德國Merck公司);甲酸(色譜純,美國Sigma公司);乙酸銨、氯化鈉(均為分析純,上海國藥集團(tuán));磷酸氫二鉀(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司);純凈水(杭州娃哈哈公司); PSA(N-丙基乙二胺)、C18填料(均為50 μm,中國迪馬科技)。

1.2 溶液配制

利用甲醇將各種獸藥溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)分別稀釋為1.0及0.5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,避光于4 ℃下保存。系列標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇配制,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液:取22.82 g三水合磷酸氫二鉀溶于純凈水中,定容至100 mL。

1.0 mol/L氨水溶液:稱取6.80 g氨水,溶于純凈水中,定容至100 mL。

1.3 分析條件

1.3.1色譜條件

此條件適用于氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素。流動相B為甲醇,A為水;流速:0.2 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:2.0 μL;梯度洗脫程序:0～3.00 min, 95%A～5%A; 3.00～6.00 min, 5%A; 6.00～6.50 min, 5%～95%A; 6.50～8.50 min, 95%A。

此條件適用于磺胺類、喹諾酮類、孔雀石綠和隱色孔雀石綠。流動相B為乙腈,A為0.5 mmoL/L乙酸銨水溶液(含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸);流速:0.2 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:2.0 μL;梯度洗脫程序:0～3.00 min, 95%A～70%A; 3.00～4.00 min, 70%～60%A; 4.00～6.00 min, 60%A～5%A; 6.00～8.00 min, 5%A; 8.00～8.20 min, 5%A～90%A; 8.20～10.00 min, 95%A。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源:ESI源;GS1(噴霧氣): 55 L/min; GS2(輔助加熱氣): 55 L/min;氣簾氣:35 L/min;輔助加熱氣溫度:550 ℃。氯霉素類藥物為負(fù)離子模式掃描;噴霧電壓:-4 500 V;監(jiān)測模式:-MRM。磺胺類、喹諾酮類、孔雀石綠、隱色孔雀石綠為正離子模式掃描;噴霧電壓:5 500 V;監(jiān)測模式:+MRM。

1.4 樣品前處理

從農(nóng)貿(mào)市場購買草魚、鯉魚、羅非魚、鳙魚和對蝦等鮮活水產(chǎn)品,取魚可食用部分用組織搗碎機均質(zhì)混勻;將蝦去頭、去殼,用組織搗碎機均質(zhì)混勻,分別裝入聚乙烯瓶中于-18 ℃冷凍保存,測定前解凍樣品,稱取5.00 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入5.0 mL磷酸氫二鉀溶液,渦旋15 s將樣品分散后再加入3～5 g氯化鈉和12.5 mL乙腈,渦旋提取5～8 min,超聲8 min,以5 000 r/min的速度離心3 min后將上清液轉(zhuǎn)移至150 mL圓底燒瓶中,再加12.5 mL乙腈重復(fù)提取一次,兩次提取液合并,于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至近干,加入1.0 mL甲醇復(fù)溶后轉(zhuǎn)移至10.0 mL離心管中,分別加入30 mg C18和50 mg PSA填料,渦旋30 s,取上清液過0.22 μm有機相濾膜,待上機分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件的選擇

用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對1.1節(jié)中20種獸藥殘留檢測的文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)較多,但是不同廠家生產(chǎn)的質(zhì)譜儀及相同廠家生產(chǎn)的不同型號的質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)不同,得到的碎片離子響應(yīng)強度及電壓不同。在質(zhì)譜分析中,對于化合物的電離影響較大的主要是去簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE)。本研究在標(biāo)準(zhǔn)[16-18]的基礎(chǔ)上,采用0.5 mg/L的20種獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及8種混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液,通過針泵以流動注射的方式進(jìn)樣,為每個待測藥物選取響應(yīng)最高的兩對離子對及相應(yīng)的解簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)作為最終的質(zhì)譜采集參數(shù),并根據(jù)各離子的響應(yīng)高度確定定量與定性離子,相關(guān)參數(shù)見表1。

表 1 20種獸藥標(biāo)準(zhǔn)及8種同位素內(nèi)標(biāo)的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters for the 20 veterinary drug standards and 8 isotope internal standards

* Quantitative ion.

2.1.2色譜分離條件的選擇

4類獸藥的極性差異較大,同類化合物又因結(jié)構(gòu)相似不易分離,尤其是其中同分異構(gòu)體的分離,且喹諾酮結(jié)構(gòu)中含羧基及酮羰基,極易與Fe3+、Al3+、Ca2+等金屬離子形成配合物,造成峰拖尾、展寬、保留時間漂移等現(xiàn)象,這些都是藥物多殘留同時分析中色譜分離條件優(yōu)化的難點[23]。為使20種藥物均達(dá)到最佳的分離效果,本試驗以例行監(jiān)測抽取數(shù)量較多的鯉魚、草魚、羅非魚、鳙魚和對蝦為研究對象,將20種獸藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及8種內(nèi)標(biāo)溶液加入5種樣品基質(zhì)中處理后上機測定,分別比較甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液(含0.5 mmol/L乙酸銨)、乙腈-0.1%甲酸水溶液(含0.5 mmol/L乙酸銨)對色譜分離和質(zhì)譜靈敏度的影響,結(jié)果如下。

圖 1 環(huán)丙沙星-D8在不同流動相中的色譜圖Fig. 1 Chromatogram of ciprofloxacin-D8 in different mobile phases

(1)對于磺胺類、喹諾酮類、孔雀石綠及隱色孔雀石綠,無論流動相為甲醇還是乙腈,靈敏度均高于標(biāo)準(zhǔn)[16-18],但以甲醇為流動相時,樣品中環(huán)丙沙星內(nèi)標(biāo)物峰受雜質(zhì)干擾較大,因此影響環(huán)丙沙星內(nèi)標(biāo)法定量結(jié)果的準(zhǔn)確性;而當(dāng)換為乙腈時,干擾雜質(zhì)峰與目標(biāo)物峰能達(dá)到基線分離,如圖1所示,所以選乙腈為流動相;而對于氯霉素類,甲醇做流動相時,3種藥物響應(yīng)都比乙腈高,在設(shè)定的梯度條件下也均能達(dá)到基線分離且目標(biāo)物峰不受雜質(zhì)干擾,因此流動相選擇甲醇。

圖 2 20種獸藥的MRM總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion current chromatogram of the 20 veterinary drugs obtained by MRM a. sulfonamides, quinolones, malachite green and leucomalachite green; b. chloramphenicols.

(2)對于磺胺類、喹諾酮類、孔雀石綠及隱色孔雀石綠,水相中加入甲酸時,分析物的峰形尖銳,靈敏度顯著提高。經(jīng)對甲酸的添加濃度反復(fù)試驗,最終選擇含0.1%甲酸的水溶液作為水相,可以獲得較好的效果。原因可能是這3類藥物均呈弱堿性,加入酸可促使目標(biāo)化合物帶電,提高待測物在電噴霧離子源中的正離子化效率,促進(jìn)[M+H]+峰的形成,因此提高了質(zhì)譜響應(yīng)。含0.1%甲酸的水溶液中再加入乙酸銨后,大多藥物響應(yīng)值進(jìn)一步增高,藥物的峰形也得到不同程度改善,可能是乙酸銨的加入抑制了[M+Na]+峰形成,再次提高了質(zhì)譜響應(yīng);此外流動相的pH值對峰形有較大影響,而不同的樣品基質(zhì)酸堿度不同,pH也不同,在流動相中加入乙酸銨還可緩沖pH值的變化,因而改變了不同基質(zhì)樣品中藥物的峰形。氯霉素類藥物用純水做流動相時共流出物較少,避免了樣品中干擾雜質(zhì)對藥物離子化的抑制,所以響應(yīng)更高[24]。因此,本試驗中磺胺類、喹諾酮類、孔雀石綠、隱色孔雀石綠最終采用乙腈-0.5 mmoL/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)為流動相,氯霉素類最終采用甲醇-水為流動相,20種藥物的MRM總離子流圖見圖2。在圖2a中,雖然保留時間相近的藥物存在色譜峰重疊的現(xiàn)象,但由于這些藥物的監(jiān)測離子不同,提取離子后的峰不受干擾,故不會對其定性、定量結(jié)果產(chǎn)生影響。

2.2 前處理條件優(yōu)化

2.2.1提取溶劑

選擇陰性魚、蝦樣品為實驗材料,考察了乙腈、乙酸乙酯2種提取溶劑對20種藥物的提取效果。結(jié)果表明,乙酸乙酯對部分藥物提取效果較差,且樣品中的蛋白質(zhì)、脂肪、色素等干擾物易溶于乙酸乙酯,造成基質(zhì)效應(yīng)較強,干擾嚴(yán)重,也不利于后續(xù)凈化。而乙腈對組織滲透力強,對目標(biāo)物提取效果好,且沉淀蛋白質(zhì)及脂肪能力強,共提物少,基質(zhì)效應(yīng)相對較弱[25,26],因此本試驗選取乙腈作為提取溶劑。

2.2.2樣品分散試劑及加入體積

魚、蝦均為高蛋白質(zhì)樣品,加入乙腈后由于蛋白質(zhì)變性,樣品脫水,導(dǎo)致大量樣品迅速結(jié)塊,從而影響獸藥的提取效率。因此,本試驗首先于5種樣品基質(zhì)中分別加入5.0 mL水、5.0 mL(1.0 mol/L)磷酸氫二鉀溶液、5.0 mL(1.0 mol/L)氨水,渦旋將樣品分散后再加入25.0 mL乙腈,考察各類獸藥的提取效果。結(jié)果表明,由于水或堿溶液的加入,樣品結(jié)塊現(xiàn)象得以消除,但加入堿溶液的樣品渦旋后分散效果更好,且大多獸藥回收率也高于加水的樣品,其中加1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液的樣品獸藥回收率最高?？赡艿脑蚴撬哂辛己玫慕M織滲透性,渦旋后能起到勻漿的效果,所以樣品不再結(jié)塊。此外,堿再促使樣品發(fā)生水解,因此,加堿溶液的樣品分散性更好,與有機溶劑接觸面積更大,對藥物提取更加充分;堿還能促進(jìn)藥物與結(jié)合蛋白質(zhì)解離,從而使二者提取效率高于加水的樣品。其中帶多電荷陰離子鹽的解離效果好于單電荷陰離子鹽,因此加磷酸氫二鉀溶液的樣品回收率高于加氨水的樣品,表2為以鯉魚為例的試驗結(jié)果。

表 2 加入水、1.0 mol/L氨水溶液和1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液對鯉魚中20種獸藥提取率的影響Table 2 Effects of the addition of water, 1.0 mol/L ammonia solution and 1.0 mol/L hydrogen dipotassium phosphate solution on the extraction rates of 20 veterinary drugs in the carp

其次,還考察了加入1.0、3.0、5.0、7.0和9.0 mL 1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液對20種獸藥回收率的影響。結(jié)果表明,當(dāng)加入1.0和3.0 mL磷酸氫二鉀溶液時,樣品勻漿效果較差,尤其是對蝦,渦旋后仍難以將樣品完全分散開來;當(dāng)加入量為5.0 mL時,5種樣品均能均勻分散,不同樣品中各種獸藥的提取效率也達(dá)到最高,隨著磷酸氫二鉀溶液加入量的增加,環(huán)丙沙星、孔雀石綠等的提取效率逐漸降低,因此本試驗選擇加入5.0 mL 1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液為樣品分散劑。

2.2.3萃取鹽

為使樣品充分分散而加入了磷酸氫二鉀溶液,由此將大量水帶入提取液中,若不將這些水分離,將嚴(yán)重影響萃取液的濃縮效率。于是在樣品中加入鹽以將水吸附或使水與乙腈分層后再取乙腈層濃縮,這樣可大大縮短提取液濃縮時間。據(jù)于此,考察了無水硫酸鎂、無水硫酸鈉和氯化鈉的除水效果及其對獸藥回收率的影響。通過樣品加標(biāo)試驗發(fā)現(xiàn),使用無水硫酸鎂或無水硫酸鈉時,乙腈和水不分層,提取液濃縮到最后仍余下部分水,但加大鹽的用量時諾氟沙星、環(huán)丙沙星等藥物易被吸附,且被提取出的大量雜質(zhì)也仍留于乙腈中,在濃縮的過程中,若壓力控制不合適,被提取出的雜質(zhì)會促使提取液產(chǎn)生大量泡沫而噴出濃縮瓶外。而加入氯化鈉使水相達(dá)到飽和后再離心,水與乙腈分層明顯,上層乙腈濃縮時所需時間大大縮短,大部分獸藥的回收率也優(yōu)于使用無水硫酸鎂和無水硫酸鈉,且氯化鈉對藥物沒有明顯的吸附現(xiàn)象;此外,由于氯化鈉的鹽析作用還促使水相中的獸藥分配到有機相中,同時有機相中的蛋白質(zhì)等大量雜質(zhì)沉淀于水相,從而使藥物與大量雜質(zhì)分離,提取液濃縮過程中不易產(chǎn)生大量泡沫而溢出瓶外,提高了濃縮時的效率,還大大減少了提取液損失,因而降低了方法的檢出限,因此選擇于樣品中加入約3～5 g氯化鈉,使水相達(dá)到飽和即可。

2.2.4提取試劑加入量及提取次數(shù)

在前幾步試驗的基礎(chǔ)上,先于各個樣品中加入5.0 mL(1.0 mol/L)磷酸氫二鉀溶液將樣品分散后,再加提取試劑以考察乙腈加入量及提取次數(shù)對各類藥物回收率的影響。先以5.0、10.0、15.0、20.0、25.0和30.0 mL乙腈分別對各樣品中的獸藥進(jìn)行提取。結(jié)果表明,隨著乙腈加入體積增加,各個樣品中藥物回收率也隨之增加,當(dāng)加入量為25.0及30.0 mL時,20種獸藥回收率均達(dá)到最高,但環(huán)丙沙星最高回收率不足50.0%,當(dāng)提取劑為30 mL時,萃取雜質(zhì)較多,干擾較大。試驗中又將樣品離心后的下層水相過膜測定,發(fā)現(xiàn)下層水相中含有約40.0%的環(huán)丙沙星,于是將25.0 mL提取試劑分為兩次萃取,每次使用12.5 mL,此時環(huán)丙沙星回收率提高到80.0%以上,其余藥物在平行樣中的測定結(jié)果也更加接近,所以選擇每次使用12.5 mL乙腈提取兩次。

2.2.5凈化材料

首先將提取液濃縮、定容后直接進(jìn)樣分析,結(jié)果表明,部分藥物在不同樣品基質(zhì)中的平均回收率差異較大,且有部分基質(zhì)中磺胺噻唑、磺胺甲噻噁唑、恩諾沙星等藥物超出70.0%～120%的范圍。其原因可能是存在一定的基質(zhì)增強或減弱效應(yīng),且不同的樣品基質(zhì)增強或減弱的程度不同,同時蝦、鳙魚等樣品提取液濃縮后顏色相對較深,易對儀器造成污染。由于魚和蝦中的干擾物主要是脂肪、蛋白質(zhì)、色素等,而PSA對樣品中的一些強極性雜質(zhì)、脂肪酸、色素等具有良好的凈化效果,C18粉對樣品中的蛋白質(zhì)和脂類成分有較好的吸附效果[27]。為使樣品中的雜質(zhì)得到有效去除的同時各樣品中20種獸藥的回收率也達(dá)到最高,將PSA與C18共80 mg分別以6∶2、5∶3、4∶4、3∶5、2∶6的質(zhì)量比用于提取液的凈化。結(jié)果表明,不同的質(zhì)量比對雜質(zhì)去除效果不同,各藥物的回收率也不同,當(dāng)PSA與C18質(zhì)量比為5∶3時,各樣品中獸藥回收率最高,且20種藥物均在70.0%～120%(見表3)。因此,選質(zhì)量比為5∶3的PSA與C18共80 mg作為本試驗的凈化材料。

表 3 魚、蝦樣品提取液凈化前、后20種獸藥的回收率Table 3 Recoveries of the 20 veterinary drugs in the extracted solutions of fish and shrimp samples before (BP) and after (AP) purification

2.2.6加入獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液與加入提取試劑間隔時間

按以往慣例,做質(zhì)控樣回收率時,常將標(biāo)準(zhǔn)溶液及相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)溶液加入基質(zhì)中放置約10 min后再加入提取試劑進(jìn)行前處理,但本試驗的20種獸藥中孔雀石綠按此間隔時間在5種基質(zhì)中的回收率都只有35.0%～50.0%,通過比較藥物標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)回收率發(fā)現(xiàn),二者的提取效率不同,因此又考察了樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液與加入提取試劑時間間隔為15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、12 h和24 h時孔雀石綠的回收率。結(jié)果表明,間隔時間越長,孔雀石綠內(nèi)標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)提取效率越接近,所以內(nèi)標(biāo)法定量時的回收率越高。當(dāng)間隔時間為4 h及以上時,回收率達(dá)到最高,且平行樣相對標(biāo)準(zhǔn)偏差最小,為盡量縮短樣品前處理時間,本試驗選擇向基質(zhì)中加入獸藥標(biāo)準(zhǔn)及內(nèi)標(biāo)溶液與加入提取試劑時間間隔為4 h。

2.3 線性范圍和檢出限

根據(jù)各獸藥在儀器上的響應(yīng)值,將20種獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成不同的濃度,以定量離子的峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸,同時用上述魚和蝦陰性樣品為基質(zhì),進(jìn)行檢出限和定量限的考察,以3倍和10倍信噪比來確定20種藥物的檢出限和定量限。如表4所示,20種獸藥在0.2～300.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系較好(相關(guān)系數(shù)R2>0.99),檢出限、定量限均比標(biāo)準(zhǔn)及公告[16-18]方法低,能滿足水產(chǎn)品中多種獸藥殘留的測定需求。

2.4 回收率和精密度

分別以1倍、5倍和20倍20種獸藥的定量限作為添加濃度加入魚和蝦5種陰性樣品中進(jìn)行回收率試驗,每個樣品基質(zhì)做6次平行試驗,計算其平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表5。4類獸藥的平均回收率為72.5%～118%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～9.8%,符合獸藥殘留測定對回收率(70.0%～120%)及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(≤10%)的要求。

表 4 20種獸藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限及所對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物Table 4 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs), limits of quantitation (LOQs) and the corresponding internal standards of the 20 veterinary drugs

y: peak area ratio of analyte to the internal standard;x: mass concentration of analyte, μg/L.

表 5 20種獸藥在5種樣品中3個添加水平下的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 5 Spiked recoveries and RSDs of the 20 veterinary drugs spiked in five samples at three levels (n=6)

2.5 實際樣品檢測

為驗證本方法的可靠性,同時了解市場上水產(chǎn)品中獸藥殘留情況,采用本研究建立的檢測方法對市售的5個魚樣品(鯉魚、草魚、鯽魚、鯽魚和羅非魚)和1個對蝦進(jìn)行了檢測,并對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。其中羅非魚檢出恩諾沙星,含量為4.83 μg/kg;鯉魚檢出恩諾沙星,含量為2.16 μg/kg。將上述6個樣品分別用標(biāo)準(zhǔn)[16-18]進(jìn)行再次測定,定性結(jié)果與本文建立的方法相同,羅非魚中恩諾沙星含量為4.91 μg/kg,鯉魚中恩諾沙星為2.09 μg/kg,可見兩種方法的測定結(jié)果非常接近,表明本法可用于魚、蝦中獸藥殘留的定性篩查及定量測定。

3 結(jié)論

本文建立了分散固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中磺胺類、喹諾酮類、孔雀石綠及隱色孔雀石綠、氯霉素類藥物殘留的方法。該方法高效、簡單、靈敏,適用于魚和蝦中多獸藥殘留的快速測定。與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)及農(nóng)業(yè)部公告相比,該方法能實現(xiàn)不同性質(zhì)的多類獸藥殘留同時檢測,大大縮短了檢測周期,節(jié)約了檢測成本,為相關(guān)的檢測機構(gòu)提供了有力的技術(shù)支持。