石 楊, 邵小光

(大連市婦女兒童醫(yī)療中心, 生殖與遺傳研究醫(yī)學(xué)中心, 遼寧 大連 116037)

生殖是生物體的最基本特征之一,是物種得以延續(xù)和進(jìn)化的保證。聯(lián)合國(guó)特別規(guī)劃署曾在20世紀(jì)末提出,21世紀(jì)將成為人類(lèi)“生殖健康”世紀(jì),并向全世界人民發(fā)出增加對(duì)生殖健康問(wèn)題關(guān)注度的號(hào)召。我國(guó)作為世界上最大的人口大國(guó),近年來(lái)也在逐步增強(qiáng)對(duì)生殖問(wèn)題研究的投入,特別是在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。我國(guó)育齡人口不孕不育率已高達(dá)15%～20%，不孕夫婦約2 000萬(wàn)[1],而且不能生育的夫妻呈年輕化趨勢(shì),就診年齡最小23歲,最大40歲。目前,不孕不育和出生缺陷是生殖領(lǐng)域的重大問(wèn)題。

微流控技術(shù)是20世紀(jì)90年代初期隨電子和光刻等高技術(shù)的發(fā)展而誕生的。隨著微加工、微電子技術(shù)的發(fā)展,微流控芯片系統(tǒng)也得到了迅猛發(fā)展,技術(shù)也逐漸成熟,目前已經(jīng)由微流控芯片制作的操控階段向追求合理應(yīng)用和廣大市場(chǎng)需求的生產(chǎn)化階段轉(zhuǎn)變,其應(yīng)用領(lǐng)域包括化學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、醫(yī)學(xué)等,其研究對(duì)象包括小分子、蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞、組織、器官和模式生物等,顯示出了強(qiáng)大的發(fā)展前景和應(yīng)用潛力[2-6]。在生殖生育研究中,微流控研究剛剛起步,微流控技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì):微管道的形狀和尺寸可以靈活設(shè)計(jì),從而更好地模擬生理環(huán)境;微流控芯片對(duì)樣品的消耗量低,可減少樣品需求量,適用于臨床樣本研究;微流控技術(shù)可以集成多個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟，具有很高的集成性。

綜上,微流控技術(shù)已被應(yīng)用到精子活力評(píng)價(jià)與篩選、精子的化學(xué)趨向性篩選、卵丘細(xì)胞去除、透明帶移除、卵細(xì)胞定位與篩選、受精過(guò)程、早期胚胎培養(yǎng)以及生殖器官模擬等各個(gè)方面[7]。

1 微流控技術(shù)與精子篩選

1.1 微流控技術(shù)與精子活力評(píng)價(jià)

利用微流控裝置對(duì)精子活力進(jìn)行篩選和評(píng)價(jià)的方法包括:微管道篩選、介電電泳力篩選以及層流效應(yīng)篩選。Kricka等[8]制作的以硅和玻璃為材料的微管道芯片,用于人精子計(jì)數(shù)及活力測(cè)定,開(kāi)創(chuàng)了在微流控芯片上進(jìn)行精子活力的評(píng)價(jià)技術(shù)。1997年,Kricka等[9]對(duì)其所設(shè)計(jì)的芯片進(jìn)行了改進(jìn),利用彎曲的通道芯片評(píng)價(jià)精子活力,通過(guò)微管道得到的結(jié)果與馬克勒室檢測(cè)得到的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)兩種方法所得的精子活力分級(jí)結(jié)果具有良好的相關(guān)性。Fuhr等[10]利用高頻電場(chǎng)對(duì)人的單個(gè)精子實(shí)現(xiàn)了捕獲、定位和篩選。Schuster等[11]利用層流效應(yīng)篩選活力精子,經(jīng)過(guò)篩選精子活力由44%±4.5%提高到98%±0.4%(p<0.05),精子的正常形態(tài)率由10%±1.05%提高到22%±3.3%(p<0.05);然而這項(xiàng)技術(shù)的缺陷在于精子的回收率不高(目前進(jìn)樣口僅能進(jìn)樣40～50 μL液體,而30 min內(nèi)只能回收10～20 μL精液)。微流控精子分析可與計(jì)算機(jī)輔助精子分析(CASA)方法結(jié)合對(duì)斑馬魚(yú)精子進(jìn)行準(zhǔn)確和快速的分析,能夠快速激活精子并持續(xù)測(cè)量其運(yùn)動(dòng)能力,將有助于提高精子研究的重現(xiàn)性,并有助于精子庫(kù)的開(kāi)發(fā)[12],說(shuō)明微流控分析技術(shù)可與其他分析技術(shù)結(jié)合發(fā)揮更高的效能。

1.2 微流控技術(shù)精子趨化性評(píng)價(jià)

Koyama等[13]采用聚二甲基硅氧烷-玻璃復(fù)合結(jié)構(gòu)的微流控芯片評(píng)價(jià)了小鼠精子在卵巢提取液中的趨化作用。該芯片具有3個(gè)對(duì)稱(chēng)的進(jìn)樣通道和3個(gè)對(duì)稱(chēng)的出樣通道,在一側(cè)進(jìn)樣管道通入卵巢提取液,另一側(cè)通入空白緩沖液,中間管道通入小鼠精液,在中間匯合處可形成化學(xué)梯度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明具有化學(xué)趨向性的精子約占精子總數(shù)的7%左右。

1.3 微流控技術(shù)精子趨溫性評(píng)價(jià)

2003年,Bahat等[14]證明了哺乳動(dòng)物精子趨溫性的存在。Li等[15]利用不等溫的微流控芯片儲(chǔ)液池,通過(guò)研究不同溫度范圍(34.0～35.3 ℃、35.0～36.3 ℃、36.0～37.3 ℃和37.0～38.3 ℃)內(nèi)的精子反應(yīng),發(fā)現(xiàn)只有5.7%～10.6%的精子顯示出了熱反應(yīng)。

2 微流控技術(shù)用于卵細(xì)胞研究

2.1 微流控技術(shù)健康卵細(xì)胞篩選

臨床上對(duì)健康卵母細(xì)胞的篩選主要依靠形態(tài)學(xué)上的判斷,標(biāo)準(zhǔn)是透明帶完整、卵細(xì)胞飽滿(mǎn)、細(xì)胞質(zhì)透明,這樣的方法對(duì)人的依賴(lài)度較高。為了避免人為影響,Choi等[16]利用正向介電泳,應(yīng)用卵細(xì)胞膜的特性對(duì)卵細(xì)胞進(jìn)行篩選,證實(shí)移動(dòng)的卵細(xì)胞比不移動(dòng)的卵細(xì)胞具有更好的發(fā)育潛能,具有高囊胚形成率(23.8% vs 10.7%,p<0.05)和低多精入卵現(xiàn)象(31.1% vs 42.9%,p<0.05)。這項(xiàng)技術(shù)可能為未來(lái)自動(dòng)化挑選卵細(xì)胞、提高準(zhǔn)備率,克服人為誤差提供理論參考。

2.2 微流控技術(shù)顆粒細(xì)胞去除

卵丘細(xì)胞是聚集在卵細(xì)胞周?chē)念w粒細(xì)胞,與卵細(xì)胞共同組成了卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)。在進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)等操作時(shí),需要去除卵丘細(xì)胞獲得裸卵,以利于精子穿刺入卵。傳統(tǒng)去除卵丘細(xì)胞的方法包括物理去除法和化學(xué)去除法。物理去除法又包括吹吸法和渦旋振蕩法,即通過(guò)用吸管反復(fù)吹打卵丘細(xì)胞或使用渦旋振蕩器產(chǎn)生機(jī)械力,使卵丘細(xì)胞脫落;而化學(xué)去除法是將COC放置在透明質(zhì)酸酶溶液中消化而使卵丘細(xì)胞從卵細(xì)胞周?chē)怆x出來(lái)。微流控芯片可以結(jié)合上述兩種方法,在流體中實(shí)現(xiàn)卵丘細(xì)胞的去除。Zeringue等[17]利用兩條呈90°、寬度小于卵細(xì)胞直徑的細(xì)微通道去除卵丘細(xì)胞,當(dāng)COC進(jìn)樣到主管道后,在小管道施加負(fù)壓,卵丘細(xì)胞就會(huì)被逐漸吸走,而卵細(xì)胞保留在主管道中。這種方法和傳統(tǒng)的渦旋振蕩法相比,具有更高的效率和更小的傷害。

2.3 微流控技術(shù)卵細(xì)胞的體外成熟

與傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)方法相比,施加微流體更有利于卵細(xì)胞的成熟,可能原因是構(gòu)建的微環(huán)境與生理環(huán)境更為接近。因此,Waiters等[18]以聚二甲基硅氧烷(PDMS)為材料制作了微流控裝置,用來(lái)培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),常規(guī)方法的樣品用量需500 μL,微流控通道方法的樣品用量?jī)H需8 μL,但結(jié)果沒(méi)有顯著性差異,兩種方法卵母細(xì)胞的成熟率分別為51%和61%。隨后,Hester等[19]報(bào)道了在PDMS和硼硅酸鹽雜合材料的微管道中培養(yǎng)成熟豬卵母細(xì)胞用于體外受精,結(jié)果表明,卵裂至2-細(xì)胞期的百分率(67%)與對(duì)照組(49%)相比顯著升高。Zhao等[20]報(bào)道了一種新型的夾層結(jié)構(gòu)微流體芯片用于表征卵母細(xì)胞膜傳輸特性,可以進(jìn)行溶液置換,對(duì)溫度具有良好控制能力,可以準(zhǔn)確表征卵母細(xì)胞膜的溫度依賴(lài)性和滲透性。

3 微流控技術(shù)體外受精

1995年,美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)的Kricka等[21]首次在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)了體外受精。他應(yīng)用微加工方法在玻璃基底上刻蝕引導(dǎo)精子的管道、卵細(xì)胞受精池和精子進(jìn)樣池。彎曲管道對(duì)精子具有篩選作用,只有活力較強(qiáng)并且可以靈活轉(zhuǎn)彎的精子才能穿越管道,最終到達(dá)卵細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)了小鼠的體外受精。然而由于精子進(jìn)樣量少,受精率比常規(guī)體外受精(IVF)方法略低(48%,常規(guī)方法65%～80%)。Suh等[22]用比傳統(tǒng)方法更少的精液實(shí)現(xiàn)了微流控技術(shù)的體外受精,當(dāng)精液含量降低至2×104～8×104個(gè)/mL時(shí),受精率提高,以此說(shuō)明微流控技術(shù)在體外受精研究中的優(yōu)越性。Cheng等[23]利用4×4的微流控陣列裝置整合了包括卵母細(xì)胞的定位、精子篩選、受精和胚胎培養(yǎng)等試管授精所有步驟,結(jié)果表明通過(guò)篩選通道,小鼠的精子活性從60.8提高到96.1。Ferraz等[24]利用3D打印技術(shù)將極化和分化的牛輸卵管上皮細(xì)胞制成管狀模擬輸卵管,適用于活體成像并支持體外受精。

4 微流控技術(shù)用于胚胎操作

4.1 微流控技術(shù)透明帶移除

透明帶去除對(duì)于嵌合體產(chǎn)生或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備具有重要的意義,目前常規(guī)的做法是采用化學(xué)移除法,將受精卵放入酸性裂解液中,直至看到透明帶開(kāi)始降解,立即將受精卵取出放入培養(yǎng)基完成透明帶去除。Zeringue等[25]設(shè)計(jì)了一種用以去除透明帶的微流控芯片,用兩個(gè)交叉的微管道形成一個(gè)“T”形結(jié)構(gòu),將受精卵限制在主管道的狹窄區(qū)域,然后在橫斷的管道中通入裂解液,通過(guò)微小的負(fù)壓將一小部分裂解液吸入主管道,不斷沖洗胚胎，將透明帶移除干凈,V形的狹窄區(qū)可將裸露的胚胎引導(dǎo)在一起,有利于產(chǎn)生嵌合體。

4.2 微流控技術(shù)早期胚胎培養(yǎng)

常規(guī)的體外培養(yǎng)方式通常在微升到毫升的體積內(nèi)單個(gè)或成組培養(yǎng)胚胎,這和體內(nèi)的環(huán)境不同(輸卵管液常為數(shù)微升或更少),而微管道的優(yōu)勢(shì)在于每個(gè)胚胎的需要量小于1 μL[26]。有研究[27]證實(shí),在小體積里成組培養(yǎng)胚胎可能更有利于胚胎發(fā)育并使總細(xì)胞數(shù)增多,這是因?yàn)榕咛ギa(chǎn)生的旁分泌和自分泌產(chǎn)物能夠?qū)ψ陨砗椭車(chē)咛テ鸬酱碳ぷ饔?促進(jìn)胚胎的自身發(fā)育。但是在小體積內(nèi)同時(shí)培養(yǎng)過(guò)多胚胎也不利于胚胎發(fā)育,原因是在培養(yǎng)過(guò)程中代謝產(chǎn)生的有害產(chǎn)物會(huì)對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生不良影響。有研究[28]表明,每個(gè)胚胎對(duì)應(yīng)0.5～2 μL培養(yǎng)液是較為合適的比例。Raty等[29]研究了不同的管道材料(硅、PDMS和硼硅酸鹽)對(duì)胚胎培養(yǎng)的影響,通過(guò)和傳統(tǒng)培養(yǎng)皿IVF組比較,發(fā)現(xiàn)硅-硼硅酸鹽管道以及PDMS-硼硅酸鹽管道均能更快地發(fā)生卵裂并產(chǎn)生更多囊胚,囊胚退化率更低,顯示了微管道在胚胎培養(yǎng)方面的優(yōu)越性。胚胎培養(yǎng)中另一個(gè)重要問(wèn)題是靜態(tài)培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)孰優(yōu)孰劣。在生理環(huán)境下,由于輸卵管的不斷收縮,胚胎在發(fā)育過(guò)程中應(yīng)該是動(dòng)態(tài)的過(guò)程,而采用傳統(tǒng)的微滴培養(yǎng)法,胚胎一直處于靜止的狀態(tài)。

利用微流體可以使胚胎處于持續(xù)流動(dòng)的流體環(huán)境中。Hickman等[30]比較了不同微流體環(huán)境下小鼠胚胎的發(fā)育狀況。結(jié)果顯示,流速為0.1 mL/h時(shí)微管道中桑椹胚、囊胚形成率與對(duì)照組類(lèi)似,而當(dāng)施以連續(xù)流體時(shí),桑椹胚、囊胚形成率反而下降。Huang等[31]發(fā)明了一種更接近發(fā)育中胚胎所在的體內(nèi)微環(huán)境的裝置,開(kāi)發(fā)了一種數(shù)字化的微流體裝置。該微流控電潤(rùn)濕設(shè)備被用來(lái)模擬胚胎發(fā)育過(guò)程中體內(nèi)的流體流動(dòng),與傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)相比,小鼠胚胎卵裂的發(fā)生率明顯高于傳統(tǒng)的靜態(tài)培養(yǎng)模式。目前對(duì)于動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的研究尚無(wú)統(tǒng)一明確的結(jié)論。

圖 1 睪丸組織培養(yǎng)微流控芯片的示意圖[34]Fig. 1 Schematic diagrams of the microfluidic chip used to culture testicular tissue[34]

5 微流控芯片技術(shù)用于生殖微環(huán)境與器官構(gòu)建

人體芯片,就目前的研究水平而言,更確切地說(shuō)是芯片仿真人體器官系統(tǒng)(organ-on-a-chip systems),也稱(chēng)為器官芯片(organs-on-chips)[32],是一種利用微加工技術(shù),在微流控芯片上制造出能夠模擬人類(lèi)器官主要功能的仿生系統(tǒng)[33]。經(jīng)過(guò)近幾年來(lái)的快速發(fā)展,研究人員已經(jīng)在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)了眾多人體器官的構(gòu)建,如芯片肝、芯片肺、芯片腸、芯片腎、芯片血管、芯片心臟以及多器官芯片等。然而在生殖器官與微環(huán)境中,器官芯片的研究才剛剛起步,目前生殖系統(tǒng)的微流控技術(shù)體外構(gòu)建分為男性生殖微系統(tǒng)和女性生殖微系統(tǒng)。

5.1 男性生殖微系統(tǒng)構(gòu)建

Komeya等[34]在2016年報(bào)道了利用PDMS夾多孔膜芯片,體外模擬鼠睪丸組織,裝入的老鼠睪丸組織碎片成功地維持了精子形成和睪丸激素的分泌。如圖1所示,裝置中培養(yǎng)的睪丸組織成功地維持了6個(gè)月的精子形成,產(chǎn)生的精子可以通過(guò)微授精產(chǎn)生健康的后代。此外,通過(guò)促黃體激素刺激睪丸組織可以持續(xù)產(chǎn)生睪酮。

5.2 女性生殖微系統(tǒng)構(gòu)建

5.2.1胎盤(pán)組織

Blundell等[35]利用半透膜隔開(kāi)的芯片共培養(yǎng)了人的滋養(yǎng)細(xì)胞BeWo和絨毛內(nèi)皮細(xì)胞(見(jiàn)圖2a)。培養(yǎng)的滋養(yǎng)層在動(dòng)態(tài)流動(dòng)條件下形成致密微絨毛,并表達(dá)了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,即生理膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,模擬了葡萄糖的生理轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。另一研究組[36]實(shí)現(xiàn)人滋養(yǎng)細(xì)胞株JEG-3和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng),該項(xiàng)工作研究了葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)功能(見(jiàn)圖2b)。體外微流控胎盤(pán)模型可以為研究復(fù)雜胎盤(pán)組織的微環(huán)境提供新的方法,并為開(kāi)發(fā)以安全測(cè)試孕前的藥物篩選、細(xì)菌感染和毒性作用提供有效平臺(tái)[37-39]。

圖 2 微流控芯片構(gòu)建胎盤(pán)組織的示意圖Fig. 2 Schematic diagrams of the microfluidic chip used to construct placental tissue a. microengineered system for placenta[35]; b. a placenta-on-a-chip microdevice[36].

圖 3 微流控芯片構(gòu)建子宮微環(huán)境的示意圖Fig. 3 Schematic diagrams of the microfluidic chip for construction of uterus microenvironment a. model for simulating the interaction between endometrial stromal cells (ESCs) and human peritoneal mesothelial cells (HPMCs)[40]; b. characterization of co-culture of endometrial stromal fibroblasts (stroma) and human peritoneal mesothelial cells (HUVECs) in the two-chamber device[41].

5.2.2子宮微環(huán)境

2012年，Chen等[40]報(bào)道了使用微流體通道與印章法培養(yǎng)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(ESCs)和人類(lèi)腹膜間細(xì)胞(HPMC)來(lái)模擬腹膜后子宮內(nèi)膜異位癥的病理生理微環(huán)境。研究在正常和病理狀態(tài)下實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)ESCs和HPMC之間的相互作用(見(jiàn)圖3a)。Gnecco等[41]設(shè)計(jì)并開(kāi)發(fā)了一個(gè)雙室微流體裝置,該裝置利用樹(shù)脂多孔膜,可以長(zhǎng)期聯(lián)合培養(yǎng)人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(見(jiàn)圖3b),從而體外構(gòu)建子宮微環(huán)境。該報(bào)道檢測(cè)和分析了子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在類(lèi)固醇調(diào)節(jié)作用下的相互作用。研究結(jié)果表明,基質(zhì)細(xì)胞分化成功能性蛻膜細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)了剪切應(yīng)力可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞骨架排列和緊密連接的形成;子宮內(nèi)膜血管間質(zhì)瘤模型可持續(xù)4周對(duì)類(lèi)固醇響應(yīng)。這些數(shù)據(jù)表明,腹膜生理學(xué)可能對(duì)子宮內(nèi)膜異位有重要作用。

5.2.3卵巢微環(huán)境

2017年,Xiao等[42]展示了一種多器官微流體系統(tǒng)(見(jiàn)圖4)。該系統(tǒng)在28 d產(chǎn)生小的卵巢卵泡,并調(diào)控女性生殖系統(tǒng)月經(jīng)周期激素,為月經(jīng)周期的激素信號(hào)和懷孕等的內(nèi)分泌循環(huán)研究提供平臺(tái),可用于藥物發(fā)現(xiàn)和毒理學(xué)等研究。Choi等[43]利用海藻酸鹽和膠原蛋白合成具有卵巢皮質(zhì)和髓組織的卵巢微組織,并將其應(yīng)用于早期的二級(jí)前卵泡的微型化3D培養(yǎng)。該研究開(kāi)發(fā)的仿生卵巢微組織和微流體技術(shù),對(duì)于改善體外培養(yǎng)的卵泡質(zhì)量,以及了解卵泡發(fā)育和排卵機(jī)制具有十分重要的意義,同時(shí)有助于尋找因卵巢功能紊亂而導(dǎo)致不孕的治療方法。Nagashima等[44]利用灌流微流控系統(tǒng)體外培養(yǎng)家貓和狗卵巢皮質(zhì)內(nèi)或卵巢皮質(zhì)外分離的卵泡,該系統(tǒng)是對(duì)大型哺乳動(dòng)物(如貓、狗)卵巢體外培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)的重要探索,在生育保存、生殖毒理學(xué)和瀕危哺乳動(dòng)物保護(hù)等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖 4 微流控芯片卵巢組織構(gòu)建的示意圖Fig. 4 Schematic diagrams of the microfluidic chip used to construct ovarian tissue a. multiple unit microfluidic platforms (MFP) systems[42]; b. microfluidic platform supported follicle maturation and hormone secretion in the solo-MFP system[43].

6 結(jié)論與展望

微生殖技術(shù),包括微流控芯片和器官芯片,是通過(guò)廣泛的基礎(chǔ)科學(xué)和生物工程技術(shù)的結(jié)合而形成的。更好、更快、更準(zhǔn)確,更“微觀”的技術(shù)是各個(gè)領(lǐng)域迫切的現(xiàn)實(shí)需求,而微生殖技術(shù)在生殖系統(tǒng)研究中才剛剛起步。在未來(lái),研究人員可以通過(guò)整合不同組織(例如生殖系統(tǒng)器官、胎盤(pán))或不同細(xì)胞類(lèi)型(例如配子、腫瘤細(xì)胞)、結(jié)合生物因子(例如激素和信號(hào)分子)、利用分析化驗(yàn)和技術(shù)(例如微型攝像頭、質(zhì)譜分析等等)等多因素來(lái)研究生殖系統(tǒng)與疾病。微流控技術(shù)有望應(yīng)用在輔助生殖、藥物測(cè)試和醫(yī)療診斷上,對(duì)生殖系統(tǒng)與疾病的研究具有無(wú)限潛能。