陳 政，李佩洪，龔 霞，唐 偉，吳銀明

(四川省植物工程研究院， 四川 資中 641200)

花椒為蕓香科花椒屬落葉灌木或小喬木，是我國(guó)栽培歷史悠久的食用調(diào)味、香料、油料及藥材等多用途經(jīng)濟(jì)樹(shù)種[1]，中國(guó)是世界花椒第一生產(chǎn)大國(guó)，有39種14變種[2]。四川漢源、茂縣，陜西韓城、鳳縣，重慶江津、甘肅武都，山東萊蕪、沂源，河北涉縣、平山等地均為我國(guó)花椒著名產(chǎn)區(qū)[3-7]。四川是全國(guó)花椒主產(chǎn)區(qū)，截至2017年底，花椒種植面積293 300 hm2，年產(chǎn)量67 900 t，約占全國(guó)總產(chǎn)量的17. 9%；產(chǎn)值62. 7億元，其中干、鮮果收入53億元，加工產(chǎn)值9. 7億元[8]。實(shí)生花椒樹(shù)3年開(kāi)始掛果，5～6 a進(jìn)入盛果期，一般能維持30～50 a?；ń窐?shù)具有生長(zhǎng)快、結(jié)實(shí)早、用途廣、適應(yīng)性強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)、能保持水土、栽培管理簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，深受廣大群眾歡迎?；ń纷鳛橹匾慕?jīng)濟(jì)林木之一，已經(jīng)廣泛種植于山區(qū)，已成為當(dāng)?shù)乩习傩盏闹匾?jīng)濟(jì)收入來(lái)源之一。但因栽培管理方式原始粗放，椒樹(shù)樹(shù)勢(shì)衰弱，病蟲(chóng)害種類多且危害嚴(yán)重，花椒產(chǎn)量大幅下降。2014-2016年對(duì)四川省各花椒主產(chǎn)區(qū)的椒園進(jìn)行走訪調(diào)查，發(fā)現(xiàn)部分主枝和枝條均健康的椒樹(shù)在掛果期突然萎蔫死亡，田間管理粗放的椒園，萎蔫或死亡現(xiàn)象尤為明顯。椒樹(shù)萎蔫的具體癥狀為：椒樹(shù)主枝健康，地上部分葉片變小，并且發(fā)黃發(fā)白，果實(shí)較小，葉片變小變黃，根皮與木質(zhì)部易脫離，部分木質(zhì)部呈黑色。為此，我們采集萎蔫植株和健康植株周圍土壤，并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，比較分析其土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和差異，以期找到花椒植株健康生長(zhǎng)最佳的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，預(yù)防植株萎蔫。

1 研究地概況與研究方法

1.1 研究地概況

試驗(yàn)地為漢源縣清溪鎮(zhèn)新黎村花椒廣場(chǎng)某一椒園。清溪鎮(zhèn)位于漢源縣城北39 km，為大相嶺山脈西南麓的高山河谷地帶，地勢(shì)西北高，東南低，海拔1 600～2 900 m，屬于北溫帶與季風(fēng)帶之間的亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候，冬暖夏熱，四季分明。四周環(huán)山，谷深嶺高，高地寒冷，河谷炎熱，雨量偏少且不均，氣候垂直變化十分顯著。年均降水量600 mm左右，年平均氣溫11.5 ℃，無(wú)霜期300 d，日照時(shí)數(shù)1 475.8 h。土壤情況：土壤較疏松、黑色壤質(zhì)土、肥力中等。栽種模式：花椒間作李樹(shù)。土壤理化特性：含水量為21.68%，pH值為7.44，比重為2.008 g·cm-3，容重為1.190 5 g·cm-3，有機(jī)質(zhì)為22.53 g·kg-1、銨態(tài)氮為244.5 mg·kg-1、速效磷為139.7 mg·kg-1，速效鉀297.45 mg·kg-1。樣品采集時(shí)間：2015年8月3日。

1.2 土壤樣品采集

利用土壤取樣器，隨機(jī)選取萎蔫或健康椒樹(shù)，以其為圓心在半徑為30 cm的圓周上采集8～10個(gè)、深20～30 cm的原狀土樣并混合為一個(gè)土樣(1～2 kg)，共采集6個(gè)土壤樣品(萎蔫或枯死植株3個(gè)，編號(hào)為HY1、HY2、HY3；健康植株3個(gè)，編號(hào)為HY4、HY5、HY6)。將6個(gè)樣品混勻，稱取10 g，無(wú)菌袋裝送至專業(yè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行宏基因組DNA提取，PCR擴(kuò)增及l(fā)lluminaHiseq高通量測(cè)序等處理。

1.3 土壤中微生物種類分析

利用llluminaHiseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)萎蔫或枯死的椒園土壤微生物種類進(jìn)行分析，主要步驟是通過(guò)直接提取土壤微生物的DNA，經(jīng)純化處理后，利用引物擴(kuò)增基因，再進(jìn)行OTU聚類；為得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在各個(gè)水平(genus，species)統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成。再與16 s細(xì)菌和古菌核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)、Unite(Release 6.0，http://unite.ut.ee/index.php)真菌數(shù)據(jù)庫(kù)、FGR(Functional Genomics Resources)功能基因組資源、RDP(Release11，http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp，GeneBank(Release7.3，http://fungene.cme.msu.edu/)功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)等進(jìn)行土壤微生物分類分析。

1.4 不同土壤中微生物群落比較

采用Heatmap比較分析6個(gè)土壤樣品的微生物在species分類水平上群落組成的相似性和差異性。Heatmap可以用顏色變化來(lái)反映二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)信息，它可以直觀地將數(shù)據(jù)值的大小以定義的顏色深淺表示出來(lái)。常根據(jù)需要將數(shù)據(jù)進(jìn)行物種或樣本間豐度相似性聚類，將聚類后數(shù)據(jù)表示在heatmap圖上，可將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過(guò)顏色梯度及相似程度來(lái)反映多個(gè)樣本在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。軟件及算法：R語(yǔ)言vegan包，vegdist和hclust進(jìn)行距離計(jì)算和聚類分析；距離算法：Bray-Curtis，聚類方法：complete。圖中顏色梯度可自定為兩種或兩種以上顏色漸變色。

2 結(jié)果與分析

比較分析漢源樣地健康植株周圍土壤微生物和萎蔫植株周圍土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組分，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌類微生物差異(圖1)。萎蔫植株周圍土壤樣品HY1、HY2、HY3中unculturedXanthobacteraceaeblastochiorissp.、unculturedSphiongomonaskaistobactersp.、Anaerolinecoeae、unculturedGemmatimonadaceaegemmatimonadales、uncultured 0319-6A21、Subgroup-2、A0839、GR-WP33-30的豐度明顯高于HY4、HY5、HY6健康植株周圍土壤；HY1、HY2、HY3中Bacillus、Lactococcuslactissubsp.、unculturedNitrosomonadaceaeburkholderiaceae的豐度明顯低于HY4、HY5、HY6健康植株周圍土壤。

比較分析漢源樣地健康植株周圍土壤微生物和萎蔫植株周圍土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組分，發(fā)現(xiàn)真菌類微生物差異(圖2)。萎蔫植株周圍土壤HY1、HY2、HY3中Ceratobasidium、Ilyonectria

圖1 樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成圖(heatmap)

圖2 樣品真菌群落結(jié)構(gòu)組成圖(heatmap)

morspanacis、Ilyonectriaanthuriicola、Ilyonectriarobusta、Cryptococcuspodzolicus的豐度明顯高于HY4、HY5、HY6健康植株周圍土壤中的；萎蔫植株周圍土壤中的HY1、HY2、HY3中Penicillium、Cryptocossusterricola、Glomeraceae、Minimedusasp.、Chaetomiumsp.、Mortierellaindohii、Cryptococcuscerealis、Fusariumoaysporumfsp.的豐度明顯低于HY4、HY5、HY6健康植株周圍土壤。

3 討論

(1)采用llluminaHiseq高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)出了一種鐮刀菌即尖胞鐮刀菌，其它種類的鐮刀菌只鑒定到屬這一水平。尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporium)是一種世界性分布的土傳病原真菌，主要危害葫蘆科(Cucurbitaceae)植物、香蕉(Musanana)、番茄[9](Lycopersiconesculentum)、茄子(Solanummelongena)、辣椒(Capsicumannuum)和棉花(Gossypiumspp.)等高經(jīng)濟(jì)價(jià)值作物。尖孢鐮刀菌的防控十分困難，主要是因?yàn)樗嗽谒拗髦参镏写婊钔猓谕寥兰翱諝庵写婊?0 a以上仍表現(xiàn)出很強(qiáng)的致病性[10]。健康植株附近的(HY4、HY5、HY6)土樣中尖孢鐮刀菌的豐度大于萎蔫植株附近土樣?？梢?jiàn)，尖孢鐮刀菌不是引起花椒植株萎蔫的病原菌。

(2)采用llluminaHiseq高通量測(cè)序技術(shù)分類分析感病植株和健康植株周圍土壤的微生物菌落結(jié)構(gòu)特征和差異，土壤微生物群落組分及微生物菌種間相互作用，及土壤微生物對(duì)花椒植株萎蔫的影響。從分析結(jié)果可以看出，萎蔫植株周圍土壤中芽孢桿菌(Bacillus)明顯低于健康植株周圍土壤，可從健康植株周圍土壤分離純化芽孢桿菌菌株，篩選部分優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌菌株，再將優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌制成菌液或菌肥澆灌于萎蔫植株周圍土壤，根據(jù)萎蔫植株的后續(xù)長(zhǎng)勢(shì)初步判斷施用專用型芽孢桿菌菌肥能否預(yù)防植株萎蔫。李姝江[11]等人對(duì)花椒根腐病生防芽孢桿菌進(jìn)行分離、篩 選、定殖和防效評(píng)價(jià),在分 離 獲 得 的20株 芽 孢 桿 菌 中，編號(hào)為B3的菌株拮抗作用最強(qiáng)，突變菌株B3無(wú)論預(yù)防還是治療試驗(yàn)，均能發(fā)揮很好的效果，并優(yōu)于原始菌株和化學(xué)農(nóng)藥雙效靈。

(3)花椒為淺根系植物，其根系主要分布在20～50 cm土壤中，故本試驗(yàn)中采集20～30 cm土壤樣品中已包含其根際土壤，即土壤樣品中的微生物不僅含有根際土壤微生物，還含有根部周圍的土壤微生物。土壤樣品為混合樣品，故未對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行單獨(dú)分類和分析。

(4)除土壤因素引起花椒植株萎蔫外，還有病蟲(chóng)害也會(huì)引起植株萎蔫，如花椒黃葉病，其表現(xiàn)癥狀為個(gè)別葉脈綠色、葉片變黃、葉緣發(fā)白，嚴(yán)重時(shí)葉緣焦枯，黃葉病是缺鋅、缺鐵的表現(xiàn)，可通過(guò)施用專用型生物菌肥補(bǔ)充鋅、鐵等元素，使葉片恢復(fù)正常。此外，還有蟲(chóng)害也可引起花椒植株萎蔫，天牛科2～3齡幼蟲(chóng)鉆食樹(shù)干，咬食樹(shù)皮，樹(shù)干被鉆食成許多洞孔，傷處流出牛皮膠液，可引起樹(shù)干干枯死亡[12]。檢查樹(shù)干上有無(wú)洞孔或牛皮膠液，可初判是否由蛀干害蟲(chóng)引起植株萎蔫。連續(xù)干旱亦可引起花椒植株萎蔫，干旱脅迫引起成片植株出現(xiàn)萎蔫，發(fā)現(xiàn)嫩梢開(kāi)始萎蔫時(shí)，可通過(guò)灌水來(lái)驗(yàn)證，若灌水后植株恢復(fù)正常生長(zhǎng)則是干旱引起的萎蔫，反之則不是。