于 非
(黑龍江省農(nóng)科院園藝分院,哈爾濱150069)
麗格海棠(Begoniaelatior)又名玫瑰海棠,為秋海棠科秋海棠屬的多年生草本花卉[1],當(dāng)今世界著名的盆栽花卉之一,具有極高的觀賞及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其花色鮮艷,花色品種多,不但是優(yōu)質(zhì)園林綠化用花,還是優(yōu)良的家庭用花。據(jù)調(diào)查僅黑龍江省海棠每年園林綠化用花在2000萬(wàn)盆以上,家庭用盆花每年在50萬(wàn)盆左右。具有較高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的室內(nèi)花卉,開(kāi)發(fā)前景極其廣闊[2]。
麗格海棠目前的傳統(tǒng)繁育方式是有性繁殖和無(wú)性繁殖。有性繁殖即種子播種,由于麗格海棠是雜交的產(chǎn)物,胚胎發(fā)育不完全,所以不宜發(fā)芽,開(kāi)花后結(jié)籽少,種子發(fā)芽率很低,不能保持母本的優(yōu)良特性等缺點(diǎn),一般種子播種不作為商業(yè)化生產(chǎn)的繁育手段;無(wú)性繁育即莖段扦插,麗格海棠對(duì)環(huán)境條件要求高,分蘗力弱,莖段扦插成活率與繁殖系數(shù)低, 種質(zhì)退化嚴(yán)重[3],并且長(zhǎng)期無(wú)性繁殖還會(huì)造成病毒在植物體內(nèi)傳遞累積,嚴(yán)重影響花卉產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量,很難滿足當(dāng)前花卉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的要求。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)麗格海棠不同部位外植體的研究,篩選出適合麗格海棠組織培養(yǎng)快繁的培養(yǎng)基,為建立麗格海棠再生體系奠定基礎(chǔ),提高麗格海棠商品化生產(chǎn)效率提供技術(shù)支持[4]。
本試驗(yàn)采用麗格海棠品種巴克斯(Barkos),采集地點(diǎn)為黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院智能化溫室。將采集的麗格海棠嫩葉片、葉柄、莖段放于流水下沖洗20 min,置于超凈工作臺(tái)上先用75%的酒精消毒20~30s,蒸餾水沖洗3次。再用0.1%的升汞浸泡搖勻消毒4~6min,蒸餾水沖洗3次,將消毒好的外植體放于經(jīng)過(guò)高溫滅菌的蒸餾水中并蓋好瓶蓋,然后用消過(guò)毒的解剖刀對(duì)外植體進(jìn)行切割,葉片切成1cm×1cm大小,葉柄、莖段切成1cm左右,接種到不定芽分生培養(yǎng)基上。
1.2.1 不同部位外植體的不定芽誘導(dǎo)情況。誘導(dǎo)不定芽分生的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基,含 30g/L蔗糖,7g/L瓊脂,pH=5.7,添加不同濃度的6-BA、TDZ和2.4-D,共組成6種培養(yǎng)基組合:MS+1mg/L TDZ、MS + 1mg/L TDZ+0.1mg/L 2,4-D、MS+1mg/L TDZ+0.3mg/L 2,4-D、MS+2mg/L TDZ、MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L TDZ、MS+1mg/L 6-BA+0.3mg/L TDZ,每種培養(yǎng)基分別接入不同部位外植體各30個(gè),重復(fù)3次,培養(yǎng)室溫度26±2℃,光照 1200 lx左右,每天光照 10~12h,4周后觀察其不定芽誘導(dǎo)情況。
1.2.2 不定芽的繼代增殖。將誘導(dǎo)出已分生的不定芽切下接種到繼代增殖培養(yǎng)基中,繼代增殖培養(yǎng)基為MS附加6-BA和NAA,共組成9種培養(yǎng)基,MS+1mg/L 6-BA;MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA;MS+1mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA;MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA;MS+2mg/L 6-BA;MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA;MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA;MS+mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA; MS+3mg/L 6-BA。4周繼代一次,觀察高度大于2.5cm 的不定芽增殖情況。
1.2.3 組培苗的生根。將高度大于2.5cm的組培苗切下接種到生根培養(yǎng)基中,生根培養(yǎng)基為MS附加IBA和NAA,共組成9種培養(yǎng)基,MS+0.1mg/L IBA;MS+0.1mg/L IBA+0.1mg/L NAA;MS+0.1mg/L IBA+0.3mg/L NAA;MS+0.3mg/L IBA;MS+0.3mg/L IBA+0.1mg/L NAA;MS+0.3mg/L IBA+0.3mg/L NAA;MS+0.5mg/L IBA;MS+0.5mg/L IBA+0.1mg/L NAA; MS+0.5mg/L IBA+0.3mg/L NAA。4周后觀察其生根情況。
表1 不同部位外植體的不定芽分生情況
續(xù)表1
外植體培養(yǎng)基組合污染率(%)死亡率(%)不定芽再生比率(%)MS+1mg/L TDZ+0.3mg/L 2,4-D41.235.665.2MS+2mg/L TDZ59.449.533.2MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L TDZ39.220.587.3MS+1mg/L 6-BA+0.3mg/L TDZ33.536.970.2
由表1可知,麗格海棠不同部位的外植體都有誘導(dǎo)不定芽成功的幾率。觀察表明,葉片在10d左右周圍組織開(kāi)始膨大變綠形成愈傷,在20d左右就有不定芽產(chǎn)生,其中不定芽可以從愈傷組織里產(chǎn)生也可以直接從葉片上產(chǎn)生。葉片的不定芽再生比率最高可以達(dá)到90%左右,最適宜葉片不定芽分生的培養(yǎng)基為MS+1mg/L TDZ+0.1mg/L 2,4-D或MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L TDZ;葉柄在25d左右形成愈傷組織并產(chǎn)生不定芽,葉柄在誘導(dǎo)的過(guò)程中污染率和死亡率都較高,并且不定芽再生比率較低,其中最適宜葉柄不定芽分生的培養(yǎng)基為MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L TDZ,再生率為66.2%;莖段在培養(yǎng)30d以后在綠的皮層處和邊緣處產(chǎn)生不定芽,莖段在誘導(dǎo)的過(guò)程中污染率和死亡率比前兩者都高,但是再生率高于葉柄,最適宜莖段不定芽分生的培養(yǎng)基為MS+1mg/L TDZ+0.1mg/L 2,4-D或MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L TDZ,再生率可達(dá)88.9%。綜上所述,不同部位外植體都可誘導(dǎo)出不定芽,不定芽的再生率葉片>莖段>葉柄。
將誘導(dǎo)出的不定芽切割后轉(zhuǎn)入到繼代增殖培養(yǎng)基中,30d后新的不定芽葉子膨脹展開(kāi),株高增高顯著,苗莖變粗形成小的植株。由表2可知,隨著6-BA濃度的增高不定芽分化速度加快和增殖倍數(shù)提高但6-BA濃度達(dá)到3mg/L時(shí),芽生長(zhǎng)勢(shì)減弱;隨著NAA濃度的提高易生成根,根生成后不定芽增殖速度減慢,因此,麗格海棠不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+2mg/L 6-BA+0~0.1mg/L NAA,增殖系數(shù)可達(dá)5.8。
表2 不定芽的繼代增殖
由表3得出IBA濃度的升高對(duì)麗格海棠組培苗生根有促進(jìn)作用,但I(xiàn)BA濃度達(dá)到0.3 mg/L以上,對(duì)組培苗生長(zhǎng)有抑制作用,添加0.1mg/LNAA可以促進(jìn)組培苗生長(zhǎng),但當(dāng)NAA濃度達(dá)到0.3 mg/L以上,出現(xiàn)葉片枯萎現(xiàn)象,因此,組培苗生根可選用0.1~0.3mg/L IBA,可添加0.1mg/L NAA促進(jìn)組培苗生長(zhǎng)。
表3 組培苗的生根
外植體的選擇是麗格海棠組織培養(yǎng)體系建立的關(guān)鍵。植物細(xì)胞具有全能型,所以不同部位的外植體都可能誘導(dǎo)成株,但是不同部位的的外植體再生能力上有較大的區(qū)別。本文研究表明:適宜麗格海棠葉片的不定芽再生培養(yǎng)基為MS+1mg/LTDZ+0.1mg/L2,4-D或MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LTDZ,培養(yǎng)4周后的不定芽再生率可以達(dá)到90.2%;適宜葉柄的不定芽再生培養(yǎng)基為MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LTDZ,培養(yǎng)4周后不定芽再生率可達(dá)66.2%;適宜莖段的不定芽再生培養(yǎng)基為MS+1mg/LTDZ+0.1mg/L2,4-D或MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LTDZ,再生率可達(dá)88.9%;該研究對(duì)葉片、葉柄和莖段外植體的污染率、死亡率和不定芽再生率進(jìn)行比較表明,適宜三者的不定芽培養(yǎng)基基本相同,在相同培養(yǎng)基的條件下,葉片的污染率和死亡率都較低,不定芽再生率最高;葉柄的不定芽再生率最低,一般不作為麗格海棠組織培養(yǎng)的外植體選用;莖段的污染率和死亡率最高,但是再生率高于葉柄;所以按不定芽適宜的外植體為葉片>莖段>葉柄。
將培養(yǎng)的不定芽從葉片切下接種到繼代增殖培養(yǎng)基上,最佳的不定芽繼代增殖培養(yǎng)基激素組合為MS+2mg/L 6-BA+0~0.1mg/L NAA,增殖系數(shù)可達(dá)5.8,根據(jù)具體需求可繼續(xù)進(jìn)行增殖,每4周繼代1次;將高度為2.5cm以上的組培苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上,最佳的生根培養(yǎng)基激素組合為MS + 0.1~0.3mg/L IBA,組培苗生根后且長(zhǎng)度達(dá)到5cm以上可移栽馴化。實(shí)驗(yàn)得出隨著細(xì)胞分裂素濃度的增加對(duì)不定芽再生和增殖均有促進(jìn)作用,但當(dāng)濃度超出一定范圍時(shí),對(duì)不定芽再生和增殖起到了抑制的作用;高濃度的IBA對(duì)麗格海棠組培苗的生根和生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,但是抑制了組培苗的增長(zhǎng),出現(xiàn)黃葉枯萎現(xiàn)象。因此,在生產(chǎn)中應(yīng)結(jié)合不定芽和組培苗生長(zhǎng)勢(shì)而調(diào)節(jié)激素濃度。麗格海棠組培苗葉片和莖較脆,在生根時(shí)建議切成叢狀,利于生根和馴化。