趙玥琪，郝婧瑋，王鏡哲

(牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江牡丹江157012)

川牛膝歸屬莧科多年生植物川牛膝(Radixcyathulae)的干燥根[1]。研究發(fā)現(xiàn)川牛膝中含有多種藥用成分，如皂苷類、甾酮類、多糖類、甜菜堿以及多種微量的元素[2-5]。其主要活性成分川牛膝多糖是一種高度分支的多糖，含有D-果糖、D-葡萄糖，可有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)白細(xì)胞護(hù)肝功能[6-10]，廣泛用于機(jī)體免疫調(diào)節(jié)與抗腫瘤治療。本文采用單因素實驗法，比較川牛膝多糖提取過程中，提取方式、提取溫度、提取時間、提取料液比對川牛膝多糖得率的影響，用硫酸苯酚顯色法與紫外分光光度法進(jìn)行最優(yōu)條件篩選，為后期工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)率提升提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥材。川牛膝(四川)。

1.1.2 實驗儀器。 紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，T6新世紀(jì))；臺式微量冷凍離心機(jī)(貝克曼庫爾特，Microfuge 22R)；鼓風(fēng)干燥箱(上海-恒科學(xué)儀器有限公司，DHG-9140A)；分析天平(寬多利斯科學(xué)儀器北京有限公司，BSA224S-CW)；智能控溫電熱套(金壇市榮華儀器制造有限公司，HDM-1000C)；數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司，KQ-400DB)；電熱恒溫水浴鍋(上海-恒科技有限公司，HWS28型)。

1.1.3 實驗試劑。苯酚(AR)、濃硫酸(AR)、石油醚(AR)、無水葡萄糖(AR)。

1.2 實驗方法

1.2.1 川牛膝脫脂除水除雜

稱取3份1.0g粉碎后的川牛膝，放置烘箱內(nèi)，溫度調(diào)至50℃，烘干至恒重后放于分析天平中稱量，通過公式(1-1)計算出川牛膝的含水率，為稱取5.0g絕干重提供數(shù)據(jù)。

M絕干重=M實重×(1-含水率)

(1-1)

稱取3份1.0g粉碎后川牛膝，加入20mL石油醚(AR)進(jìn)行時間為6h的脫脂，放置24h待石油醚揮發(fā)后，通過公式(1-2)計算出川牛膝含脂率。

M脫脂重=M實重×(1-含脂率)

(1-2)

對所有粉碎過的川牛膝進(jìn)行脫脂處理，防止所含脂類影響多糖實驗提取測定。

1.2.2 單因素實驗。

實驗中雖有多個(提取方式時間溫度料液比)影響因素，但在安排實驗時只考慮一個影響因素，其它因素盡量保持不變的實驗，即為單因素實驗。

本實驗中，提取方式、提取時間、提取溫度、料液比各因素間沒有交互作用，故可以采用此種方法。

1.2.3 提取方式對提取率的影響

稱取絕干重5.0g樣品，將樣品放入燒杯中加入蒸餾水，分別在超聲波震蕩器中進(jìn)行超聲波輔助提取和加熱套中進(jìn)行煎煮提取法提取?？刂破渌蛩貫椋簻囟?0℃，提取時間1h，料液比1∶10。

1.2.4 提取溫度對提取率的影響

稱取絕干重5.0g樣品，分別在溫度為20、40、60、80℃條件下采用超聲波提取法提取多糖?？刂破渌蛩貫椋禾崛r間1h，料液比1∶10。

1.2.5 提取時間對提取率的影響

稱取絕干重5.0g樣品，溫度50℃，料液比1∶10，分別在超聲波震蕩0.5、1.0、1.5、2.0h進(jìn)行取樣。

1.2.6 提取料液比對提取率的影響

稱取絕干重5.0g樣品，加入樣品與蒸餾水采用超聲波提取法進(jìn)行料液比為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22、1∶25、1∶30的多糖提取?？刂破渌蛩貫椋禾崛r間1h，提取溫度50℃。

1.2.7 單因素實驗處理

將1.2.3、1.2.4、1.2.5、1.2.6實驗所得溶液各取2mL，離心機(jī)除雜。所得樣品，采用苯酚-硫酸法使用紫外分光光度計進(jìn)行多糖含量測定。

絕干重提取率=(C樣品多糖濃度×稀釋倍數(shù)×V體積)/M絕干重

(1-3)

1.2.8 硫酸苯酚法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與測定多糖含量

稱取0.05g無水葡萄糖，加蒸餾水定容至500mL，配置為0.1g/L(0.1mg/mL)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加蒸餾水至每組2.0mL，加入5%苯酚溶液[現(xiàn)用現(xiàn)配：取苯酚(AR)0.05g至10mL的棕色容量瓶定容到10mL，放置于超聲波震蕩器中促使苯酚完全溶解]1.0mL，加入濃硫酸5.0mL，試劑添加完畢震蕩5min，室溫下靜置30min，(提前啟動紫外分光光度計預(yù)熱30min)在波長為490nm進(jìn)行測量，橫坐標(biāo)X軸指示濃度，縱坐標(biāo)Y軸指示吸光度，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.9 多糖最優(yōu)條件下水提醇沉

川牛膝多糖最佳醇沉濃度為85%[11]。將最優(yōu)條件下的提取液，離心除雜后，加入少量無水乙醇，沉降12h后再加入無水乙醇使?jié)舛冗_(dá)到85%，沉降24h后除去不容雜質(zhì)，放置在恒溫水浴鍋中，溫度設(shè)置為60℃，直至蒸干可刮下收集。

本次實驗主要研究提取過程中提取方式、溫度時間、料液比對提取率的影響，不涉及多糖醇沉的濃度篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 川牛膝脫脂除水除雜結(jié)果與分析

表1 川牛膝含水率

表2 川牛膝含脂率

由表1和表2可見，川牛膝的含水率為7.97%，含脂率為0.022%，藥材轉(zhuǎn)移過程中有損耗，得出結(jié)論含脂率不影響脫水率計算，絕干重稱取按照含水率計算。每稱取5g絕干重的川牛膝藥材，根據(jù)公式(1-1)需稱取原重為5.43g的川牛膝藥材。

為防止雜質(zhì)中極少量脂類影響實驗準(zhǔn)確度，對所有川牛膝進(jìn)行脫脂處理，待石油醚全部揮發(fā)后繼續(xù)進(jìn)行實驗。

2.2 單因素實驗與多糖含量

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作表

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度0.1mg/mL溶液各濃度吸光度數(shù)據(jù)做出圖1。

圖1 苯酚-硫酸法測葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品在490nm處的吸光度值，以濃度作為橫坐標(biāo)(X)，吸光度值作為縱坐標(biāo)(Y)繪制葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，得到線性回歸方程Y=1.2114X-0.0067 R2= 0.9976，在0.00～0.10(0.1mg/mL)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 提取方法的比較

圖2 提取方法對提取率的影響

由圖2可知在提取溫度為50℃、提取時間1h、提取料液比1∶10的情況下，超聲波提取法比煎煮法提取率更高，更適合川牛膝多糖的提取，確定后期提取溫度提取時間提取料液比時用超聲波提取法，相應(yīng)的實驗在超聲波振蕩器中進(jìn)行。超聲波會產(chǎn)生高速且強(qiáng)烈的空化效應(yīng)與振動攪拌的作用，可以破壞植物細(xì)胞壁，使溶劑快速進(jìn)入到藥材細(xì)胞中，加速溶液交換，可縮短提取時間，顯著提高提取率。

2.2.3 提取溫度的比較

由圖3可知在相同超聲波輔助、提取時間1h、提取料液比1∶10的情況下，提取溫度為60℃時提取率最高為24.6%，溫度過低細(xì)胞膜通透性較低，提取速度緩慢；溫度過高破壞川牛膝藥材中的多糖降低了提取率，故最優(yōu)提取溫度為60℃。

圖3 提取溫度對提取率的影響

2.2.4 提取時間的比較

圖4 提取時間對提取率的影響

由圖4可知在相同超聲波輔助、提取溫度50℃、提取料液比1∶10的情況下，提取時間短反應(yīng)提取不完全，導(dǎo)致提取率較低；提取時間較長時多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞提取率低且占用時間長效率低。故提取時間1.5h時提取率最高為25.4%，故最優(yōu)提取時間是1.5h。

2.2.5 提取料液比的比較

圖5 提取料液比對提取率的影響

由圖5可知在相同超聲波輔助、提取時間1h、提取溫度50℃的情況下，料液比過低時，提取出的多糖較少，在1∶20時提取率最高；料液比比例加大提取率降低。故提取料液比1∶20時提取率最高為41.5%，故最優(yōu)提取料液比為1∶20。

2.3 多糖最優(yōu)條件下水提醇沉

川牛膝多糖最佳醇沉濃度為85%[11]，將最優(yōu)條件下的提取液，提取溫度60℃提取時間1.5h提取料液比1∶20，離心除雜后，加入少量無水乙醇，沉降12h后再加入無水乙醇使?jié)舛冗_(dá)到85%，沉降24h后除去不容雜質(zhì)，放置在恒溫水浴鍋中，溫度設(shè)置為60℃，直至蒸干可刮下。經(jīng)過稱量最終得率為47.12%。

本次實驗主要研究提取過程中提取方式溫度時間料液比對提取率的影響，不涉及多糖醇沉的濃度篩選。

3 討論

3.1 溫度對實驗的影響

溫度影響分子運(yùn)動，超聲波輔助法提取時，超聲過程中，在超聲波的作用下，溫度持續(xù)上升，難以下降，實驗開始前要嚴(yán)格控制溫度，溫度穩(wěn)定后再進(jìn)行實驗。本次實驗是單因素實驗，實驗時需嚴(yán)格控制溫度，防止溫度偏差導(dǎo)致實驗失敗。

3.2 醇沉法獲取多糖工藝需改進(jìn)

醇沉過程中，溫度不宜控制，隨著溫度的升高，醇揮發(fā)的同時，多糖容易氧化，蒸干程度難以掌握。建議超聲波輔助提取法提取完成之后用真空冷凍干燥法進(jìn)行多糖收集。

3.2.1 提取溫度升高提取率下降。多糖是化學(xué)成分，隨著提取水浴溫度的升高，熱量不斷聚集導(dǎo)致分子運(yùn)動加劇，更容易進(jìn)行多糖的提取，多糖得率亦隨之增加。而溫度達(dá)到60℃以上時，隨著熱量的吸收，川牛膝多糖中某一類糖類化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞，所以川牛膝多糖提取率下降。提取溫度應(yīng)該設(shè)置在川牛膝多糖應(yīng)提糖類不被破壞的臨界溫度。

3.2.2 料液比過大過小時提取率低。料液比過低時，體積過小，多糖在提取液中有一定的溶解度，提取液體積過小，導(dǎo)致溶解出的多糖少，因此提取率比較低。料液比過高時，隨著多糖的析出，多糖濃度升高，提取液帶有極性與濃度差，因此提取液體積過大效果減弱，不能促進(jìn)多糖的析出。故應(yīng)選擇適當(dāng)料液比，滿足多糖的溶解度，利用濃度差析出更多的川牛膝多糖。

4 結(jié)論

4.1 超聲波輔助提取法的提取率較煎煮法高出一倍，且超聲波清洗儀具加熱功能，可降低成本。

4.2 提取溫度為60℃時提取率高，多糖不被破壞，且所需反應(yīng)溫度低。

4.3 提取時間為1.5h時提取率最高，耗時中等，反應(yīng)時間不長，效率高。

4.4 提取料液比為1∶20時提取率最高，提取完成后，要立即濃縮，避免后期收集多糖耗材耗時過多。

4.5 采用超聲波輔助提取法、提取溫度為60℃、提取時間為1.5h、提取料液比為1∶20時、提取率最高，為47.12%。