王琴 盧建遠 字向東

（西南民族大學動物科學國家民委重點實驗室，成都 610041）

光周期的變化在調節(jié)脊椎動物繁殖方面起著關鍵的作用。長日照（白天長度＞12 h）繁殖動物一般在春季或夏季繁殖，如鳥類和小型嚙齒類動物，而有蹄類哺乳動物等短日照（白天長度＜12 h）的繁殖動物往往將其繁殖季節(jié)限制在前一個秋季［1］。甲狀腺激素（Thyroid hormone，TH）通過TH中Ⅱ型脫碘酶（Type Ⅱ iodothyronine deiodinase gene，DIO2）和Ⅲ型脫碘酶（Type Ⅲ iodothyronine deiodinase gene，DIO3）基因表達的相互調節(jié)來指導季節(jié)性繁殖，該基因表達在中腦基底下丘腦（Medio-basal hypothalamus，MBH）的室管膜區(qū)中的瞳孔內［2］。研究表明，日本鵪鶉垂體結節(jié)部（Pars tuberalis，PT）分泌的促甲狀腺激素（Thyroid stimulating hormone，TSH）是DIO2、DIO3基因表達的主要光周期依賴性上游調節(jié)物［3］。長日照會誘導PT的TSH生成，增加DIO2表達并抑制DIO3表達，從而提高MBH中的TH信號［4］，光周期信號級聯(lián)轉導通過作用于下丘腦-垂體-性腺（Hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG）軸調節(jié)DIO2、DIO3基因的表達，進而調節(jié)脊椎動物的生殖活動［5］。從眼部輸入的光信號可通過晝夜節(jié)律起搏器，視交叉上核傳輸到松果體，根據季節(jié)性信號通過DIO2、DIO3基因轉化為褪黑素分泌模式，TSH在管腔中分泌受到褪黑激素分泌的調節(jié)，導致下丘腦室管膜細胞中DIO2、DIO3基因表達模式的變化，并沿HPG軸誘導神經內分泌級聯(lián)轉導［6］。因此，TSHB-DIO2/DIO3逆向調控通路在哺乳動物季節(jié)性繁殖調節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。

牦牛（Bos grunniens）是我國青藏高原及其周邊地區(qū)的珍稀畜種，是世界畜種中分布區(qū)域極少的家畜之一［7］，屬于季節(jié)性繁殖動物。但其繁殖性能較低，產犢間隔長，多為三年二胎或三年一胎［8］。為探索TSHB-DIO2/DIO3 逆向調控通路在牦牛季節(jié)性發(fā)情的調控機制及其在HPG軸上的表達變化，本研究以TSHB、DIO2、DIO3基因為研究對象，選取處于發(fā)情期的健康成年母牦牛的下丘腦、垂體、子宮、輸卵管、卵巢等組織作為試驗材料，對TSHB、DIO2、DIO3基因克隆測序及生物信息學分析，進而通過qPCR技術檢測其在HPG軸的表達情況，并進行表達差異性分析，旨為研究牦牛 TSHB-DIO2/DIO3逆向調控機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與組織的采集 發(fā)育良好且處于發(fā)情期的健康成年母牦牛5頭，采自四川成都青白江唐家寺屠宰場。屠宰后立即采集牦牛下丘腦、垂體、子宮、輸卵管、卵巢新鮮組織剪碎，用無菌生理鹽水清洗，置于不含RNase 的離心管中，錫箔紙密封后立即投入液氮罐并送至實驗室，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器、試劑 PCR儀（Biometra），熒光定 量 PCR儀（Bio-Rad），Trizol試 劑（Invitrogen），反轉錄試劑盒（MBI），熒光定量試劑盒與pMD-19T載體購自大連寶生物工程公司；Taq聚合酶和感受態(tài)細胞E.coliDH5α購自天根生化科技有限公司；AxyPrepTM DNA Gel Extraction Ki康寧生命科學（吳江）有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因克隆 選用Trizol法提取牦牛各組織總RNA，用紫外分光光度計檢測總RNA濃度和純度，將A260/A280在1.8-2.1之間的RNA，用反轉錄試劑盒合成cDNA。根據GenBank上普通牛TSHB基因序列（NM_174205.1）、DIO2基因序列（AY858551.2）和牛DIO3基因序列（AY858552.1），用Primer Premier5.0設計PCR克隆引物（表1），PCR擴增總體系為10 μL，上下游引物（10 mmol/L）各 1 μL，2×Long Taq PCR Mix 5 μL，cDNA模板1 μL和2 μL ddH2O。擴增條件：95℃預變性3 min，95℃變性 30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸 80 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min，擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行膠回收，將目的片段與pMD19-T載體連接后，轉化到DH5α 感受態(tài)細胞中，均勻涂布到含有0.1%氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落進行目的基因檢測，送至成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。

1.2.2 牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因生物信息學分析 通過NCBI中BLAST在線比對工具檢索TSHB、DIO2、DIO3基因的核苷酸序列，Megalign軟件進行同源性比對并構建進化樹。通過開放閱讀框（ORF）預測目的基因氨基酸序列，利用ProtParam程序分析蛋白的主要結構及理化參數，ProtScal程序分析疏水性，SOPMA程序預測蛋白二級結構。

1.2.3 qPCR檢測組織TSHB、DIO2、DIO3基因表達 根據已克隆出的牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因序列設計實時熒光定量PCR引物（表2），內參基因選用GAPDH，檢測各基因表達量。反應總體系為20 μL ：Green Supermix 10 μL、上下游引物各 0.5 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 8 μL。反應條件為：預變性95℃ 2 min；變性95℃ 10 s，退火 58℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，40個循環(huán)，每個樣品重復檢測3次。

表1 引物序列、退火溫度及產物長度

表2 定量PCR引物序列及產物長度

1.2.4 統(tǒng)計分析 運用SPSS軟件對實驗數據進行分析，以垂體的Ct值為參考對牦牛各組織的差異定量分析，采用比較閾值法（2-ΔΔCt法）進行相對定量分析，通過LSD法進行其差異性分析。

2 結果

2.1 牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因的克隆

PCR擴增獲得417 bp、951 bp、874 bp大小的條帶（圖1），經NCBI ORF在線程序比對分析，獲得TSHB基因的CDS區(qū) 417 bp，編碼139個氨基酸；DIO2基因的CDS區(qū)為951 bp，編碼132個氨基酸；DIO3基因CDS區(qū)為874 bp，編碼278個氨基酸。將cDNA序列和推導的氨基酸序列通過BankIt提交NCBI，登錄號分別為MH598976、MH598977和MH598978。

2.2 牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因生物信息學分析

圖 1 牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因擴增結果

ProtParam結果表明，牦牛TSHB、DIO2、DIO3蛋 白 的 分 子 式 分 別 為 C700H1071N173O200S21、C648H1036N172O191S6和C1407H2178N398O408S13，相對分子量分別為15783.50、14484.75和31613.97，理論等電點分別為8.19、6.26和6.07，在哺乳動物網織紅細胞中半衰期均為30 h，不穩(wěn)定參數分別為46.33、50.10和59.00，三者均屬于不穩(wěn)定蛋白；脂溶性系數依次為63.88、104.77、84.86，ProtScal分析其疏水性平均值為0.066、0.173、-0.304，預測TSHB和DIO2蛋白為疏水性蛋白，DIO3蛋白為親水性蛋白；TMPRED分析3個蛋白均無跨膜結構；SOPMA分析二級結構：TSHB主要由無規(guī)卷曲組成，占53.96%，并含有α-螺旋，β-折疊和延伸鏈；DIO2二級結構主要由α-螺旋組成，占44.70%，并含有延伸鏈和無規(guī)卷曲；DIO3二級結構主要由α-螺旋組成，占46.76%，并含有延伸鏈、β-折疊和無規(guī)卷曲。

2.3 同源性比較

通過NCBI中BLAST在線比對工具對來自其他物種的TSHB、DIO2、DIO3基因的核苷酸序列進行比較和搜索，Megalign軟件同源性比對：牦牛TSHB基因同源性與各物種都很近，均在90%以上，其中與普通牛（Bos taurus）最近，達98.8%，說明該基因具有高度保守性；牦牛DIO2基因與普通牛同源性最高，達99.7%，牦牛DIO3基因也與普通牛的同源性最高達99.8%，山羊（Capra hircus）97.5%。

Megalign軟件構建TSHB、DIO2、DIO3基因物種進化樹，結果如圖2-圖4，其中牦牛的序列前用▲表示，可見牦牛TSHB基因，普通牛（NM_174205.1）和牦牛聚為一類，再與綿羊（X90775.1）、山羊（NM_001287576.1）聚為一類，與物種進化一致；牦牛DIO2基因，普通牛（AY858551.2）和牦牛聚為一類，再與綿羊（GQ468498.1）、山羊（XM_018053898.1）聚為一類；牦牛DIO3基因和普通牛（AY858552.1）聚為一類，再與山羊（KJ184352.1）、綿羊（AY656759.1）聚為一類，與其遺傳進化規(guī)律相符。

圖 2 TSHB基因核苷酸進化樹分析

圖 3 DIO2基因核苷酸進化樹分析

圖 4 DIO3基因核苷酸進化樹分析

2.4 TSHB、DIO2、DIO3基因的表達水平

實時熒光定量PCR檢測TSHB、DIO2、DIO3基因在牦牛各組織中的表達情況，結果如圖5-7，TSHB基因在垂體組織中的表達水平高于其他組織，差異極顯著（P＜0.01）；在下丘腦、卵巢、子宮和輸卵管中表達水平較低；DIO2基因在各組織中均有表達，在子宮的表達水平高于其他組織，差異極顯著（P＜0.01），卵巢的表達水平顯著高于垂體、下丘腦和輸卵管（P＜0.05）；DIO3基因在子宮組織未檢測到表達，卵巢組織表達水平高于垂體、下丘腦和輸卵管，差異極顯著（P＜0.01）。

圖 5 TSHB基因在垂體、下丘腦、卵巢、子宮和輸卵管組織的表達水平

圖 6 DIO2基因在垂體、下丘腦、卵巢、子宮和輸卵管組織的表達水平

圖7 DIO3基因在垂體、下丘腦、卵巢、子宮和輸卵管組織的表達水平

3 討論

研究表明，TSH亞基基因TSHB在垂體TH中的表達主要通過甲狀腺激素脫碘酶基因DIO2、DIO3和下丘腦PT促甲狀腺激素釋放激素來調節(jié)［9］。本研究克隆了牦牛TSHB基因，編碼區(qū)cDNA序列長417 bp，編碼 138 個氨基酸，與山羊［10］、綿羊［9］等物種一致；測序結果經生物信息學分析可知，TSHB蛋白為不穩(wěn)定疏水性蛋白，無跨膜結構，二級結構主要由延伸鏈和無規(guī)卷曲組成；通過同源比對，牦牛TSHB基因與其他8個物種的同源性均在90%以上，其中與普通牛的最近，高達98.8%，說明該基因具有高度保守性；進化樹結果表明，牦牛和普通牛、山羊、綿羊有著最近的分子進化關系，該結論和山羊的研究一致［9］。目前對綿羊［9］、山羊［10］、大鼠［11］、小鼠［12］等動物的研究表明TSHB基因主要在垂體中表達，這與本研究TSHB基因在牦牛HPG軸的表達情況一致，表明TSHB基因在牦牛HPG軸組織中發(fā)揮重要作用，該基因在垂體的高表達量與牦牛的季節(jié)性繁殖密切相關。

DIO2和DIO3基因表達的變化與動物繁殖狀態(tài)的季節(jié)性變換顯著相關，通過去碘作用，DIO2可以將四碘甲狀腺原氨酸（Thyroxine，T4）轉化為生物活性更強的三碘甲狀腺原氨酸（Triiodothyronine，T3），而DIO3將催化T4和T3分別轉化為其生物活性代謝物三碘甲狀腺原氨酸和二碘甲狀腺原氨酸［13］。通過調節(jié)TH水平，DIO2和DIO3基因在許多物種的光周期反應相關的季節(jié)性繁殖調節(jié)中發(fā)揮重要作用。本研究克隆了牦牛DIO2基因，獲得了951 bp的cDNA，編碼132個氨基酸和一個終止密碼子（TGA）；測序結果經生物信息學分析可知，DIO2為不穩(wěn)定疏水性蛋白，無跨膜結構，二級結構主要由α-螺旋組成；DIO2是一種硒蛋白，其SeCys（U）殘基的活性位點由TGA編碼［14］，SeCys殘基上的硒氫基團參與機體的激素調節(jié)、細胞信號轉導等生命過程［15］，提示可能與DIO2、DIO3相互轉化相關。對牦牛DIO2基因進行同源性比對同時構建進化樹發(fā)現，該基因與普通牛同源性最高，符合進化關系。研究發(fā)現嚙齒動物DIO2基因主要表達于下丘腦［16-17］，小腦［18］、甲 狀 腺［19］、以及睪丸等組織［20］，同時有研究表明，DIO2在包括人類在內的多種動物中均可表達［18-21］，這可能與甲狀腺激素功能廣泛有關。本研究還發(fā)現，該基因在牦牛5個組織均有表達，但表達量存在差異，這與前述各種動物DIO2廣泛表達相似，也與在山羊各組織的表達水平研究一致［22］。目前對DIO2基因組織表達主要集中在嚙齒動物和鳥類的下丘腦、小腦、甲狀腺、睪丸、子宮。本研究首次對牦牛HPG軸組織進行檢測，發(fā)現該基因在HPG軸廣泛表達，其中在子宮的表達量高于其他組織。Detti等［21］對人類子宮內膜的研究發(fā)現，DIO2基因在誘導排卵的婦女子宮內膜早期蛻膜分化過程中的表達量顯著低于發(fā)育正常的子宮內膜，推測DIO2基因可能對牦牛子宮也具有調控作用。

本研究克隆了牦牛的DIO3基因，獲得873 bp的cDNA，編碼278個氨基酸和一個終止子（TAA）；生物信息學分析結果表明，DIO3蛋白為不具有跨膜結構的不穩(wěn)定親水蛋白，二級結構主要由α-螺旋組成。研究發(fā)現，DIO3 基因在大鼠小腦［23］、大腦皮層［24］和海馬［25］及心肌細胞［26］中表達，還有研究發(fā)現DIO3在早期妊娠小鼠子宮內膜、鳥類［18-19］和綿羊［16］下丘腦以及人的胎盤均有表達［27-28］。本研究通過qPCR方法檢測發(fā)現，DIO3主要表達于牦牛HPG軸上卵巢、垂體和輸卵管組織，且卵巢組織表達量高于其他組織。在下丘腦和子宮中僅有微弱表達，該結論和DIO3基因在季節(jié)性發(fā)情的遼寧青山羊組織表達中保持一致［22］，表明DIO3基因在牦牛HPG軸組織中發(fā)揮重要作用。以上研究表明，DIO2、DIO3基因在調節(jié)季節(jié)性繁殖活動中發(fā)揮重要作用。

4 結論

本研究成功克隆出牦牛TSHB、DIO2、DIO3基因cDNA序列，片段大小分別為417 bp、951 bp和874 bp，編碼139、132和278個氨基酸。TSHB基因在垂體中的表達量高于下丘腦、卵巢、輸卵管和子宮；DIO2基因在檢測組織中均有表達，并且在子宮中的表達量高于其他4個組織；DIO3基因在子宮組織中未檢出，卵巢組織的表達量高于垂體、下丘腦和輸卵管。