方開星 姜曉輝 秦丹丹 李紅建 黃華林 潘晨東 李 波 吳華玲

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所/廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點實驗室,廣東 廣州 510640)

氨基酸是茶樹中一類重要的化學物質(zhì)。 茶樹中存在28 種氨基酸,且一般以茶樹的特征性組分茶氨酸含量最多,約占游離氨基酸的30%～70%[1]。 氨基酸總量對茶葉的滋味、香氣、湯色、葉底等具有影響[2-4],與茶葉品質(zhì)呈顯著正相關(guān)[5]。 此外,大量研究表明,茶氨酸具有鎮(zhèn)靜、安神、保護神經(jīng)、降血壓、降血脂、抗腫瘤、肝保護、增強免疫等功能[6-11]。 因此,高氨基酸和高茶氨酸茶樹新品種選育是茶樹遺傳改良的重要方向。

一般認為茶樹一芽二葉氨基酸總量大于5%為高氨基酸資源[12],茶氨酸含量大于3%為高茶氨酸資源[13]。 近年來,諸多研究者以高氨基酸和高茶氨酸含量為參考指標對國內(nèi)茶葉資源進行了廣泛篩選,獲得了一大批高氨基酸茶樹種質(zhì)。 如趙洋等[14]對湖南湘西保靖縣葫蘆鎮(zhèn)黃金村的一個高氨基酸茶樹群體共76 份資源進行氨基酸含量測定,獲得36 份高氨基酸茶樹資源,1 份高茶氨酸茶樹資源,并選育了黃金茶1號、黃金茶2 號和黃金茶168 號這3 個高氨基酸茶樹新品種。 金孝芳等[15]對湖北的茶樹資源進行篩選獲得了E1 和20-2-1 這2 個高氨基酸茶樹資源。 此外,一些黃化和白化變異品種具有高氨基酸特性,根據(jù)其受環(huán)境影響又可分為光照敏感突變型茶樹(如黃金芽、白雞冠和中黃1 號等)和溫度敏感突變型茶樹(如安吉白茶)[16-17]。 由于高氨基酸茶樹資源在不同地理環(huán)境條件下含量存在差異且大部分具有高氨基酸,因此在華南地區(qū)篩選綜合性狀優(yōu)良的高氨基酸茶樹資源具有重要意義。

廣東省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所茶樹資源與育種團隊一直致力于茶樹種質(zhì)資源收集、保存、鑒評與新品種選育研究,建有“廣東省茶樹種質(zhì)資源庫”,現(xiàn)保存國內(nèi)外茶樹種質(zhì)資源共1 800 余份,涵蓋大葉、中葉、小葉、喬木、小喬木、灌木等多種類型。 為充分利用這些資源,從中篩選出高氨基酸和高茶氨酸茶樹種質(zhì),本研究對收集保存的218 份茶樹核心材料的氨基酸含量和茶氨酸含量進行測定,以期為優(yōu)良高氨基酸和高茶氨酸茶樹新品種選育及其形成機理研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所廣東省茶樹資源庫的218 份茶樹資源[包括茶及其變種(阿薩姆變種、白毛茶變種和毛葉茶變種)]為研究對象。

1.2 氨基酸標準曲線繪制

準確稱量0.2 g 谷氨酸粉末,溶解于70 mL 水中,并在100 mL 容量瓶中定容,配置成2 mg·mL-1的谷氨酸母液。 用移液管分別吸取0.25、0.375、0.5、0.625、0.75、1、1.25、2.5、3.75 mL 的母液于5 mL 容量瓶中,定容配置成濃度分別為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、1.00、1.50 mg·mL-1的工作液。

谷氨酸溶液經(jīng)0.22 μm 濾膜抽濾后,分別取0.5 mL pH 值8.0 的磷酸緩沖液及0.5 mL 2%茚三酮溶液于10 mL 的離心管中混勻,然后置于100℃水浴鍋中加熱15 min,期間每隔3 min 混勻一次。 加熱結(jié)束后取出,在室溫下冷卻。 定容至10 mL 后,取250 μL 于96 孔酶標板上,并檢測吸光度值。 通過吸光度值推算氨基酸含量。 每個樣品設(shè)4 次重復。

1.3 茶氨酸標準曲線繪制

準確稱量茶氨酸0.2 g 溶解于80 mL 水中,并用容量瓶定容到100 mL,配置成2 mg·mL-1的母液,分別取0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.200、0.250、0.500、0.750 mL,用水稀釋定容至100 mL,制備成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、1.00、1.50 mg·mL-1的工作液。

茶氨酸檢測之前根據(jù)安捷倫公司氨基酸衍生試劑包中提供的方法進行鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)柱前衍生。 流動相A 為40 mmol·L-1Na2HPO4(pH 值8.0)；流動相B 為乙睛∶甲醇∶水(45 ∶45 ∶10,v ∶v ∶v)的混合物。 流速為2 mL·min-1,檢測波長為338 nm。 梯度洗脫程序詳見表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Program of gradient elution

1.4 樣品制備

春季采集218 份茶樹種質(zhì)資源新梢一芽二葉,采用蒸氣殺青、烘箱干燥固樣,并用YM203 磨碎機(奧克斯,中國)進行研磨,過0.1 mm 孔徑篩,備用。 準確稱量0.1 g 樣品于10 mL 玻璃離心管中,用移液管加入10 mL 100℃的超純水并密封。 混勻后置于100℃水浴鍋中加熱45 min,每隔10 min 混勻一次。 每個樣品設(shè)3 次生物學重復。 冷卻后用5417R 離心機(Eppendorf,德國)低速離心后抽濾。 參照1.2 和1.3 進行樣品氨基酸和茶氨酸含量的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 218 份茶樹資源一芽二葉氨基酸含量測定

將10 個不同梯度濃度的谷氨酸經(jīng)顯色反應后冷卻,定容,取250 μL 于96 孔板中。 利用酶標儀測定吸光值,繪制標準曲線,標準曲線公式為y=0.601 8x+0.149 2,其中x為氨基酸濃度,y為吸光度值(圖1)。通過推算,氨基酸干物質(zhì)含量=(OD 值×10-1.492)/0.6018×100%。 將218 份種質(zhì)資源的樣品與茚三酮溶液反應后,加入到96 孔板中,每列2 個樣品,每個樣品4 個重復,不同樣品在96 孔板中顯色存在差異,表明不同資源的氨基酸含量不同,顏色越深氨基酸含量越高(圖2,因種質(zhì)樣品較多,故僅隨機選取的23 份種質(zhì)樣品顯色示意圖)。 利用酶標儀對96 孔板進行吸光度測定,結(jié)合標準曲線進行換算,獲得不同茶樹種質(zhì)氨基酸含量(表2)。 結(jié)果表明,218 份資源一芽二葉氨基酸含量介于1.50%～8.98%之間,呈正態(tài)分布(圖3),其中氨基酸含量介于3.00%～5.00%之間的樣品有118 個,占樣品數(shù)的54.1%,氨基酸含量介于2.00%～6.00%的樣品有191 個,占樣品數(shù)的87.6%。 氨基酸總量≥5.00%的高氨基酸茶樹資源有55 個,占總量的25.2%,其中含量分布介于5%～6%的資源有37個,占總樣品數(shù)的17.0%；含量分布介于6%～7%的資源有14 個,占總樣品數(shù)的6.4%；含量＞7%的資源有4個,占總樣品數(shù)的1.8%,含量介于7%～8%的資源有1個,含量介于8%～9%的資源3 個(表2)。

圖1 氨基酸標準曲線Fig.1 Standard curve of amino acid

表2 218份茶樹種質(zhì)氨基酸和茶氨酸含量Tbale 2 Content of amino acid and theanine in 218 tea germplasms

表2 (續(xù))

表2 (續(xù))

表2 (續(xù))

表2 (續(xù))

圖2 氨基酸顯色反應Fig.2 Chromogenic reaction of amino acid

2.2 218 份茶樹資源一芽二葉茶氨酸含量分析

利用高效液相色譜儀對不同濃度的茶氨酸工作液進行檢測(圖4),根據(jù)檢測結(jié)果繪制標準曲線。 通過換算可得茶樹茶氨酸含量=峰面積/52.36×100%。 同時,對218 份茶樹資源一芽二葉茶氨酸含量進行測定,檢測結(jié)果表明,218 份茶樹樣品的茶氨酸介于0%～4.03%之間(表2),呈正態(tài)分布(圖5)。 茶氨酸含量主要分布于1%～2%之間,呈中等水平,該區(qū)間樣品數(shù)共111 個,占總樣品數(shù)的50.9%,茶氨酸≥3%的樣品有13 個,占樣品總數(shù)6.0%,分別為凌云11 號(3.83%)、凌云6 號(4.03%)、短節(jié)白毫(4.01%)、廣寧大葉青心4 號(3.88%)、云南大葉(3.64%)、凌云10 號(3.44%)、云魂(3.38%)、鳳慶1 號(3.37%)、肯尼亞12 號(3.37%)、凌云18 號(3.16%)、黃奇(3.12%)、惠陽小葉1號(3.04%)和凌云4號(3.02%)。 此外,MY355、D4、D29 和B22 這4 份毛葉茶資源無茶氨酸,占樣品總數(shù)的1.8%(表2)。

圖3 218 份茶樹資源氨基酸含量正態(tài)分布圖Fig.3 Normal distribution of amino acid contents of 218 tea germplasms

2.3 218 份茶樹資源一芽二葉茶氨酸/氨基酸含量的比值

對218 份茶樹資源一芽二葉茶氨酸與氨基酸含量的比值進行分析,結(jié)果表明,茶氨酸與氨基酸含量的比值在0～0.78 之間(表2),呈正態(tài)分布(圖6)。 茶氨酸與氨基酸含量的比值主要分布于0.2 ～0.5 之間,該區(qū)間樣品數(shù)155 個,占總樣品數(shù)的71.1%。 茶氨酸與氨基酸含量的比值＞0.6 的樣品有10 個,占樣品總數(shù)的4.6%,分別為廣寧大葉青心4 號(0.78)、惠陽小葉2號(0.78)、新選2 號(0.77)、凌云16 號(0.73)、凌云10 號(0.73)、紅葉22 號(0.64)、優(yōu)選10 號(0.62)、紅葉4 號(0.61)、丹霞1 號(0.61) 和新選11 號(0.61)。 對218 個樣品的氨基酸和茶氨酸含量進行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)茶葉中的茶氨酸與氨基酸含量相關(guān)性系數(shù)達0.752,R2為0.564,呈極顯著正相關(guān)。

圖4 高效液相色譜法測定茶葉中茶氨酸含量Fig.4 Theanine contents of tea germplasms determinated by HPLC

圖5 218 份資源茶氨酸含量正態(tài)分布圖Fig.5 Normal distribution of theanine contents of 218 tea germplasms

圖6 218 份茶樹資源茶氨酸與氨基酸含量比值的正態(tài)分布圖Fig.6 Normal distribution of ratio value of theanine content to amino acid content of 218 tea germplasms

3 討論

氨基酸含量是影響茶樹品種成茶品質(zhì)的重要參考因子,氨基酸尤其是茶氨酸與綠茶品質(zhì)呈顯著正相關(guān)[18-19]。 高氨基酸和高茶氨酸茶樹資源在自然界分布較少,從中選育獲得綜合性狀好的品種更少,安吉白茶是目前報道最多、應用范圍最廣的高氨基酸茶樹品種,由于其鮮爽甘醇的優(yōu)異品質(zhì),其推廣應用極大帶動了茶葉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,取得了較好的經(jīng)濟和社會效益[20]。 但由于氨基酸和茶氨酸含量是由多基因控制的數(shù)量性狀,受光照、溫度及土壤養(yǎng)分等環(huán)境影響較大,同一品種在不同地方其含量存在差異[21-22]。 廣東地處熱帶與亞熱帶交融區(qū),溫度相對較高,低于19℃的時間短,不利于溫度敏感型的安吉白茶形成高氨基酸特性[23],因此安吉白茶不適合在以廣東為代表的華南地區(qū)種植。 為選育適合廣東乃至華南茶區(qū)種植的高茶氨酸茶樹品種,本研究通過對保存于廣東省茶樹種質(zhì)資源庫的218 份核心種質(zhì)進行氨基酸及茶氨酸檢測,共獲得了55 份高氨基酸茶樹資源和13 份高茶氨酸資源。

游離氨基酸是一種含氮化學物質(zhì)[24-25],國標法利用茚三酮顯色結(jié)合分光光度計法對樣品氨基酸含量進行測定[26],測定樣品用量較大(蒸青樣3 g)。 當分析的茶樹種質(zhì)資源數(shù)量較多時,利用國標法進行氨基酸測定非常耗時,且某些稀有種質(zhì)由于可用于分析的樣品有限,而無法進行氨基酸檢測。 而本研究創(chuàng)新開發(fā)的基于茚三酮顯色結(jié)合酶標儀的微量法可以快速對樣品進行檢測[27]。 檢測結(jié)果顯示茶氨酸與氨基酸含量的比值介于0～0.78 之間,且主要分布于0.2 ～0.5 之間,這與前人研究發(fā)現(xiàn)茶葉中茶氨酸含量約占游離總氨基酸的30%～70%存在差別[28],其原因可能是本研究采用茚三酮顯色法測定總游離氨基酸含量值偏大的緣故。 相關(guān)性研究表明,茶氨酸與氨基酸含量的相關(guān)系數(shù)為0.752,呈極顯著正相關(guān),因此在大規(guī)模的資源篩選時,可先根據(jù)各資源已知的氨基酸總量推測其茶氨酸大概的含量,縮小資源篩選范圍,再采用液相色譜進行茶氨酸精確測定,快速定向選育出高茶氨酸種質(zhì)。

茶葉中游離氨基酸多達28 種[29],其共同決定了茶葉中總氨基酸含量。 不同的茶樹種質(zhì)體內(nèi)的氨基酸的種類及含量存在較大差異。 如尹杰等[30]對貴州名茶的氨基酸組成及含量進行研究發(fā)現(xiàn),貴州各種名茶除茶氨酸外還存在其他含量突出的氨基酸,如都勻毛尖的酪氨酸、丙氨酸、谷氨酸含量較高；遵義毛峰的苯丙氨酸、胱氨酸含量高；湄江翠片的谷氨酸；山京翠芽的賴氨酸和羊艾毛峰的天冬氨酸含量較高。 上述結(jié)果表明,不同品種氨基酸種類和含量的差異影響了氨基酸的總量,同時也造成了茶葉香氣和滋味的不同。 對于本研究篩選出高茶氨酸茶樹種質(zhì),今后將有必要進一步跟蹤測定各氨基酸組分含量。

作為茶葉中最重要的氨基酸,茶氨酸是茶葉次生代謝物的重點研究對象[31]。 茶氨酸的代謝通路基本已經(jīng)探明[32-35],但是有關(guān)茶樹形成高茶氨酸的調(diào)控機制的研究尚鮮見報道。 目前已報道的主要是以低溫敏感型和光照敏感型資源為材料通過多組學技術(shù)手段,對其高茶氨酸形成的機制進行解析[36-37]。 正常的茶樹品種受溫度和光照的影響較低溫敏感型和光照敏感型資源小,可能從其他途徑調(diào)控高茶氨酸的形成[38]。本研究篩選了多份高茶氨酸及低茶氨酸茶樹資源,為茶樹高茶氨酸形成的調(diào)控機理研究提供了豐富的材料。 隨著茶樹基因的公布[39-40],可充分利用茶氨酸特異資源開展數(shù)量性狀位點(quantitative trait locus,QTL)定位、關(guān)聯(lián)分析及多組學技術(shù)獲得與其相關(guān)的分子標記、基因、蛋白及特征代謝物,解析其高含量形成的機理。

4 結(jié)論

本研究對218 份茶樹資源春季一芽二葉氨基酸及茶氨酸含量進行測定,篩選獲得了55 份高氨基酸茶樹資源,13 份高茶氨酸茶樹資源和4 份無茶氨酸茶樹資源。 本研究為高氨基酸總量及高茶氨酸含量茶樹新品種選育、茶氨酸合成機理研究提供了材料基礎(chǔ)。