喬永剛 陳 亮 崔芬芬 曹亞萍 王勇飛 宋 蕓

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太谷 030801)

低溫是限制植物生長(zhǎng)和發(fā)育的主要環(huán)境因子之一。 植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成了一系列復(fù)雜而高效的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),以抵御外界低溫脅迫[1]。 大量研究表明,植物在抵御逆境脅迫時(shí),包括AP2/ERF、MYB、bHLH、NAC、ZFP、WRKY、VOZ、CAMTA、EIN3 等轉(zhuǎn)錄因子起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用[2-5]。 轉(zhuǎn)錄因子是一類和啟動(dòng)子順式作用元件特異性結(jié)合的蛋白,可以與其他蛋白發(fā)生相互作用,進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá),引起植物對(duì)外界環(huán)境做出應(yīng)答反應(yīng)[2]。 1994年Jofuku 等[6]從擬南芥中成功分離出第1 個(gè)AP2 轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)一步分析表明其包含2 個(gè)可以與DNA 結(jié)合的AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域。 不同植物所含有的AP2 轉(zhuǎn)錄因子基因家族的數(shù)量存在差異,如擬南芥中有147 個(gè),水稻有164 個(gè),玉米167 個(gè),小麥117 個(gè),楊樹200 個(gè),葡萄有132 個(gè),而大麥和蘋果中分別只有53 和58 個(gè)[7-10]。

AP2 轉(zhuǎn)錄因子基因家族除參與生物和非生物脅迫過程、植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等,一些AP2 家族成員還是各種逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的連接因子[11]。 AP2/ERF家族蛋白主要的結(jié)構(gòu)特征是含有1 個(gè)或2 個(gè)AP2 結(jié)構(gòu)域,每個(gè)結(jié)構(gòu)域約含60 ～70 個(gè)氨基酸殘基[12]。 根據(jù)AP2 家族蛋白結(jié)構(gòu)域中特征元件的種類和數(shù)量不同可將其分為3 類,第Ⅰ類含有2 個(gè)AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域的AP2 家族,在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要的作用[13-15]。 第Ⅱ類含有1 個(gè)AP2/ERF 和1 個(gè)B3 結(jié)構(gòu)域的RAV 家族,在植物抵御生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[16-17]。 第Ⅲ類含有1 個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的ERF 家族,ERF 家族又可以分為2 個(gè)亞家族,即CBF/DREB 和ERF 亞家族,CBF/DREB 亞家族可以識(shí)別冷誘導(dǎo)響應(yīng)元件(DRE/CRT),在植物調(diào)節(jié)抗逆方面起著非常重要的作用[18]；而ERF 亞家族與DREB 亞家族的主要區(qū)別在于AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域的第14 和第19 位氨基酸殘基不同,DREB 分別為纈氨酸和谷氨酸,ERF 則分別為丙氨酸和天冬氨酸[19]。

金銀花(Lonicera japonicaThunb.)為忍冬科忍冬屬植物,以干燥花蕾或帶初開的花入藥,具有清熱解毒、增強(qiáng)人體免疫等功效,是我國(guó)重要的中藥資源[20]。目前有關(guān)金銀花AP2 基因家族的研究尚未見報(bào)道。本研究對(duì)低溫脅迫下的金銀花進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,通過Trinity 組裝得到相應(yīng)的Unigenes,挖掘出AP2 轉(zhuǎn)錄因子家族基因,對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、磷酸化位點(diǎn)分析、motif 分類并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以期為金銀花AP2 基因家族的功能研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金銀花(品種為大毛花)種苗來源于山東省平邑縣,種植于山西省太谷縣山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藥用植物研究園,分別取4℃低溫脅迫0、3、12 和48 h的葉片為試驗(yàn)材料,樣品迅速置于液氮中,并將其送至北京百邁客生物公司,提取總RNA 后構(gòu)建cDNA 文庫(kù),利用Illumina HiSeq 2500 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。 對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、去接頭和低質(zhì)量值數(shù)據(jù)后,用Trinity 軟件進(jìn)行序列組裝并獲得Unigene 序列。 從擬南芥轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)下載AP2 轉(zhuǎn)錄因子序列,利用BioEdit 對(duì)本地金銀花低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST 比對(duì),篩選出金銀花AP2 基因并利用SMART 和Pfam 驗(yàn)證,剔除不完整的基因[21]。

1.2 金銀花AP2 基因家族的生物信息學(xué)分析

對(duì)篩選出的AP2 轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列,利用在線Expasy 生物信息學(xué)工具對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)分析；利用SubLoc v1.0 進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；利用NetPhos 在線工具進(jìn)行潛在的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析。 利用MEME在線工具對(duì)34 個(gè)AP2 基因家族蛋白進(jìn)行motif 預(yù)測(cè)；利用MEGA7 軟件對(duì)34 個(gè)蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)并分類并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,每個(gè)計(jì)算點(diǎn)計(jì)算1 000 次。

1.3 RNA 提取、cDNA 合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證

按照植物RNA 提取試劑盒(北京華越洋生物技術(shù)有限公司)說明書提取金銀花根、莖和葉樣品的RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照SYBRPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,擴(kuò)增程序詳見表1；每個(gè)樣品均設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù),以山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院藥用植物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室篩選的ACT2/7 和c49672.graph_c0 為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,采用2-△△Ct法[22-23]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。 所用引物詳見表2。

表1 RT-qPCR 反應(yīng)程序Table1 RT-qPCR protocol

表2 候選內(nèi)參基因引物信息Table2 Information of candidate reference gene

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析,采用Origin 8.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花AP2 基因家族理化性質(zhì)分析

對(duì)篩選出34 個(gè)具有完整AP2 結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,利用Expasy 對(duì)AP2 基因家族編碼的氨基酸進(jìn)行理化性質(zhì)分析。 由表3可知,34 個(gè)AP2 基因編碼蛋白的氨基酸數(shù)量為74 ～887 個(gè)；pI 大小為4.74 ～10.54,表明不同的AP2 蛋白在不同的微環(huán)境中的生物學(xué)功能存在差異；除AP2_10 為穩(wěn)定蛋白外,其余均屬于不穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定指數(shù)小于40 為穩(wěn)定蛋白,大于40 為不穩(wěn)定蛋白)；34 個(gè)AP2 蛋白的脂肪系數(shù)為42.30～98.03；34 個(gè)AP2 基因編碼的蛋白的平均親疏水性均小于0,均屬于親水性蛋白。

2.2 金銀花AP2 基因家族亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用SubLoc v1.0 對(duì)金銀花AP2 基因家族進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),結(jié)果顯示金銀花AP2 基因家族蛋白除AP2_24 和AP2_28 定位于葉綠體外,其余主要定位于細(xì)胞核,這符合其作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因表達(dá)的特性[24]。 然而AP2_15、AP2_17、AP2_30 和AP2_33在線粒體中也有分布,AP2_34 在葉綠體中同樣有分布,說明不同AP2 家族成員在逆境環(huán)境下于不同細(xì)胞器中發(fā)揮著不同的作用。

2.3 金銀花AP2 蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

蛋白的磷酸化在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著關(guān)鍵作用[25]。 利用NetPhos 對(duì)34 個(gè)金銀花AP2 蛋白的磷酸化位點(diǎn)分析,由表4可知,除AP2_1、AP2_5、AP2_7、AP2_14 和AP2_28 沒有酪氨酸(Try)磷酸化位點(diǎn)外,其他金銀花AP2 蛋白均具有絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Try)磷酸化位點(diǎn),且除AP2_16 和AP2_31 外,磷酸化位點(diǎn)數(shù)依次為絲氨酸＞蘇氨酸＞酪氨酸。

表4 AP2 蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Table4 Phosphorylation site prediction of AP2 protein

2.4 金銀花AP2 基因家族蛋白基序及分類

利用MEME 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)金銀花AP2 基因家族蛋白進(jìn)行序列分析,結(jié)果顯示,34 個(gè)金銀花AP2 基因含有不同數(shù)目的保守motif 結(jié)構(gòu),AP2 家族蛋白包含2 個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,RAYD 和YRG,與前人研究一致[26]。motif 1 為RAYD,motif 2 為YRG,而motif 3 則同時(shí)包含RAYD 和YRG。 每個(gè)AP2 基因家族的成員都含有數(shù)量不等的RAYD 和YRG,且不同的AP2 基因家族之間的保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸存在變異(圖1、圖2)。

2.5 金銀花AP2 家族的同源性分析

運(yùn)用MEGA7 軟件對(duì)篩選的34 個(gè)金銀花AP2 轉(zhuǎn)錄因子和擬南芥的AP2、ERF 以及RAV 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行序列同源比對(duì),并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。 由圖3可知,金銀花AP2_10 與擬南芥RAV 家族聚為一類,為RAV 家族；AP2_7、AP2_24 和AP2_30 分別與DREB 的A5、A1和A4 亞族聚為一類；AP2_4、AP2_15、AP2_16、AP2_17、AP2_18、AP2_21、AP2_25、AP2_27、AP2_33 和AP2_34 聚為一類為AP2 家族成員；AP2_12、AP2_16、AP2_6 和AP2_11 與ERF 的B6 亞族聚為一類,AP2_20 與ERF 的B4 亞族聚為一類,AP2_23、AP2_3、AP2_8 和AP2_5 與ERF 的B1 亞族聚為一類,AP2_2、AP2_9、AP2_13、AP2_14、AP2_21、AP2_22、AP2_28、AP2_29、AP2_31 和AP2_32 與擬南芥ERF 的B3 亞族聚為一類；AP2_26 單獨(dú)聚為一枝,推測(cè)其可能是金銀花中特有的轉(zhuǎn)錄因子。

2.6 DREB 和RAV 基因家族在低溫脅迫下的表達(dá)分析

圖1 AP2 蛋白的基序Fig.1 The motif of AP2 protein

圖2 AP2 結(jié)構(gòu)域的基序Fig.2 The motif of AP2 domain

分析聚類結(jié)果檢測(cè)到的3 個(gè)DREB(AP2_7、AP2_24、AP2_30)基因和1 個(gè)RAV(AP2_10)基因在4℃低溫下處理不同時(shí)間的表達(dá)情況。 由圖4可知,不同低溫處理時(shí)間下的不同組織中的表達(dá)水平存在明顯差異,DREB基因家族在葉中的表達(dá)量明顯高于根和莖,且均在低溫處理3 h 后表達(dá)量達(dá)到最高值。 隨著低溫脅迫時(shí)間的增加,DREB基因在根、莖、葉中的表達(dá)量整體上均呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)。 而RAV基因在低溫處理3 h 后在根中的表達(dá)量極顯著高于其他處理,且明顯高于莖和葉中的表達(dá)量,隨著低溫脅迫時(shí)間的增加,根、莖、葉中的表達(dá)量整體均呈先升高后降低的趨勢(shì)。 綜上,轉(zhuǎn)錄因子在低溫脅迫初期開始發(fā)揮作用,可能對(duì)低溫的響應(yīng)起著關(guān)鍵的作用。

3 討論

研究表明,AP2 轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物基因組中,調(diào)控植物器官的生長(zhǎng)發(fā)育[27-28]、脅迫響應(yīng)[29-31],以及藥用植物活性成分的生物合成[32-33]等。 目前,關(guān)于金銀花AP2 轉(zhuǎn)錄因子家族的功能研究尚未報(bào)道,隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析金銀花AP2 基因家族已成為可能。

本研究從金銀花中篩選了34 個(gè)AP2 轉(zhuǎn)錄因子,數(shù)量明顯高于葡萄(20 個(gè))[34],但遠(yuǎn)低于水稻(164)[8]、擬南芥(147)[8]和楊柳(173 個(gè))[35]等,表明AP2 轉(zhuǎn)錄因子在不同的物種進(jìn)化過程中存在一定的擴(kuò)張或收縮。 蛋白基序分析發(fā)現(xiàn),不同類型的AP2 轉(zhuǎn)錄因子包含的保守基序存在差異,但均包含YRG 和RAYD 兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,這與擬南芥[36]、水稻[37]AP2轉(zhuǎn)錄因子家族的研究結(jié)果一致,表明AP2 轉(zhuǎn)錄因子家族在物種進(jìn)化過程中高度保守,但保守的氨基酸中存在較大的變異,可能是植物在進(jìn)化過程中為了適應(yīng)環(huán)境而產(chǎn)生的。

圖3 金銀花AP2 家族與擬南芥蛋白序列進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of AP2 family in Lonicera japonica Thunb.and Arabidopsis thaliana protein sequences

同源比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),金銀花中的AP2_7、AP2_24 和AP2_30 與擬南芥的DREB A5、DREB A1、DREB A4 親緣關(guān)系較近。 在擬南芥中發(fā)現(xiàn)ERF105(屬于DREB A4)能夠響應(yīng)低溫脅迫[38]。 通過RT-qPCR 發(fā)現(xiàn),金銀花的AP2_7、AP2_24 和AP2_30在低溫脅迫下高表達(dá),且葉中的表達(dá)量明顯高于莖和根,推測(cè)其可能介導(dǎo)葉的抗低溫表達(dá)。 金銀花AP2_10轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥RAV1 親緣關(guān)系較近。 已有研究表明,擬南芥RAV1 能有直接調(diào)控ABI基因,進(jìn)而在ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要功能[39]。 RT-qPCR 結(jié)果顯示,金銀花AP2_10 在低溫脅迫下3 h 時(shí)表達(dá)量顯著增加,且在根中的表達(dá)水平明顯高于莖和葉,推測(cè)其可能介導(dǎo)了根的抗低溫表達(dá)。 本研究還發(fā)現(xiàn),金銀花AP2_26 未與擬南芥的任何一類聚為一簇,推測(cè)其可能是金銀花中特有的一類AP2 轉(zhuǎn)錄因子,其功能有待進(jìn)一步研究。 表明,同一亞家族的金銀花的AP2 基因具有相對(duì)一致的表達(dá)模式,系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系相近的蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)保守且存在差異,但其所發(fā)揮的生物學(xué)功能基本相似。

圖4 低溫脅迫下金銀花AP2 基因的表達(dá)水平Fig.4 Expression level of AP2 gene in Lonicera japonica Thunb.under low temperature stress

本研究從金銀花中篩選出34 個(gè)AP2 轉(zhuǎn)錄因子,理化性質(zhì)研究結(jié)果表明,不同的AP2 轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白的理化性質(zhì)存在一定的差異,說明其發(fā)揮的生物學(xué)作用也不相同。 亞細(xì)胞預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,基本所有的AP2 轉(zhuǎn)錄因子均定位在細(xì)胞核中,這符合其作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因表達(dá)的特性,但AP2_24 和AP2_28定位于葉綠體中,其具體功能還有待進(jìn)一步研究；磷酸化位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn),不同的AP2 的磷酸化位點(diǎn)的個(gè)數(shù)以及類型存在較大的差異,說明不同的AP2 在植物面對(duì)非生物逆境脅迫時(shí),參與了不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；對(duì)金銀花AP2 轉(zhuǎn)錄因子的保守基序分析顯示,所有的AP2均含有其保守的功能結(jié)構(gòu)域YRG 和RAYD,但其保守的氨基酸中存在較大的變異,其原因可能是植物在進(jìn)化過程中為了適應(yīng)環(huán)境脅迫；對(duì)所有的AP2 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)其與許多模式植物一樣含有AP2 家族的4 個(gè)亞家族,而DREB主要參與低溫逆境脅迫響應(yīng),RAV在低溫、高溫和干旱條件下誘導(dǎo)表達(dá),因此,對(duì)篩選出的DREB和RAV家族的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫初期,這兩類轉(zhuǎn)錄因子就開始大量表達(dá),其在不同的組織器官中表達(dá)量存在差異,DERB集中在葉中表達(dá),RAV集中在根中表達(dá),但其表達(dá)模式基本相同,推測(cè)其可能參與了金銀花的低溫響應(yīng)。 綜上所述,同一亞家族的AP2 基因具有相對(duì)一致的時(shí)空表達(dá)模式,系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系相近的蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)保守且存在差異,但其發(fā)揮的生物學(xué)功能相似。

4 結(jié)論

本研究利用金銀花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共篩選了34 個(gè)AP2 轉(zhuǎn)錄因子。 系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析表明,金銀花AP2轉(zhuǎn)錄因子家族未能包含擬南芥所有類型的AP2,同時(shí)也存在1 個(gè)AP2(AP2_26)未能與擬南芥中的AP2 聚成一簇,表明金銀花AP2 轉(zhuǎn)錄因子家族在進(jìn)化過程中存在基因的擴(kuò)張和缺失現(xiàn)象。 4 個(gè)AP2 基因在根、莖和葉中的表達(dá)分析結(jié)果顯示,AP2_7、AP2_24 和AP2_30 在葉中高表達(dá),AP2_10 在莖中高表達(dá),但其均可能受低溫誘導(dǎo)表達(dá)。 本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究金銀花AP2 轉(zhuǎn)錄因子的功能奠定了理論基礎(chǔ)。