賴呈純 潘 紅 黃賢貴 范麗華 賴鐘雄 段長青 劉文慧

(1福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所,福建 福州 350003；2福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點實驗室,福建 福州 350003；3福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所,福建 福州 350002；4中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京 100083；5北京匯源食品飲料有限公司,北京 101305)

植物花青素生物合成需要一系列的結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用[1-2],其中類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶( UDP-glucose：flavonoid 3-O-glucosyltransferase,UFGT)是該合成途徑最后一個關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白[3],該酶可催化華翠素(delphinidin)、楊梅素(myricetin)、槲皮素(quercetin)和山奈酚(kaempferol)等進行糖基化,形成穩(wěn)定的花青素苷,進而使植物呈現(xiàn)不同的顏色[4]。 因此,UFGT 對植物花[5]、果[6-8]、莖[9]和葉[10]色澤的形成以及植物細胞中花青素苷的累積有重要的調(diào)控作用[11-12]。

不穩(wěn)定花青素轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定花青素苷的糖基化過程中,大多數(shù)植物花青素的糖基化發(fā)生在C3 羥基上,僅有小部分糖基化發(fā)生在C5 上,因此,催化花青素糖基化作用的酶有2 個類型,一個是3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucose：flavonoid 3-O-glycosyltransferase,3GT)[1,13-14],也稱UFGT,另一個為5-O-糖基轉(zhuǎn)移酶( UDP-glucose：anthocyanin 5-O-glucosyltransferase,5GT)[15-17]。 研究表明,UFGT 所催化的步驟是整個花青素生物合成途徑的關(guān)鍵點,在葡萄果實花青素的累積中起著至關(guān)重要的作用[18-19],如對不同顏色葡萄品種的研究發(fā)現(xiàn),UFGT基因僅在紅色葡萄品種轉(zhuǎn)色開始后的果皮和紅皮紅肉品種的果肉中表達,而在白色品種的果皮和果肉中均不表達,而其他與花青素合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因在紅皮品種或白皮品種中均有一定量的表達[20-22]；在葡萄細胞培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn),可以通過促進或抑制UFGT基因表達來調(diào)控細胞中花青素的累積[23-24]。 但前人對UFGT基因的研究主要集中在其對葡萄果實中花青素生物合成的作用[25-26],而對于細胞水平,尤其是不同細胞系及細胞連續(xù)培養(yǎng)的不同階段UFGT基因的表達調(diào)控模式尚鮮見報道。

本研究在已成功誘導并長期繼代保持了2 個刺葡萄愈傷組織細胞系的基礎上[27],利用該體系進行花青素合成調(diào)控研究。 從刺葡萄愈傷組織中分離編碼UFGT 蛋白的基因,并利用生物信息學的分析方法,對該基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白的理化性質(zhì)和高級結(jié)構(gòu)進行預測和解析,同時分析2 個刺葡萄愈傷組織細胞系中UFGT基因轉(zhuǎn)錄水平差異,以及其在愈傷組織培養(yǎng)過程中不同階段的表達變化,以期為從細胞水平揭示UFGT基因的功能及其調(diào)控花青素合成的機理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點實驗室誘導并長期繼代保持的2 個同質(zhì)不同型的刺葡萄愈傷組織細胞系DLR 和DLW 為試驗材料[27]。 DLR 細胞系穩(wěn)定呈紫紅色(圖1-A),具有極強的花青素和原花青素合成能力；DLW 細胞系穩(wěn)定呈淺黃綠色(圖1-B),無花青素和原花青素合成能力。 刺葡萄愈傷組織繼代培養(yǎng)20 d 后,挑取生長狀態(tài)良好的愈傷組織,轉(zhuǎn)接至新的繼代培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至第10 天開始取樣,之后每隔5 d取樣,直至培養(yǎng)取樣至第60 天,共取樣11 次,每細胞系設3 次生物學重復。 培養(yǎng)物收集后立即用液氮速凍,-80℃保存?zhèn)溆谩?培養(yǎng)室溫度為23±1℃,光照強度為3 000～4 000 lx,相對濕度為50%～60%,光周期為10 h 光照/14 h 黑暗。 以培養(yǎng)25 d 的DLR 愈傷組織為基因克隆材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA 和基因組DNA 提取 按照植物RNA提取試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)的說明書,提取刺葡萄愈傷組織25 d 培養(yǎng)物的總RNA,并按照SuperScript? ⅢFirst-Strand Synthesis System 試劑盒(Invitrogen,USA)說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA 第一鏈,參照邢桂春等[28]的RACE 技術(shù)合成基因的3′端和5′端模板,用于基因cDNA 全長克隆,接頭引物詳見表1。 按照DNA 提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]說明書提取25 d 培養(yǎng)物的基因組DNA,用于基因DNA 序列克隆。 2 個愈傷組織的11 個階段細胞培養(yǎng)物提取總RNA,并稀釋成相同濃度后,反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈,作為實時熒光定量PCR 的模板。 設3 次生物學重復。

1.2.2 刺葡萄UFGT基因的分離克隆 根據(jù)刺葡萄愈傷組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[27]所獲得的刺葡萄UFGT基因片段,設計上下游引物,以cDNA 第一鏈為模板,進行PCR 擴增。 采用25 μL 反應體系：Premix Taq (包括1.25 U Ex Taq、0.4 mmol·L-1dNTP、4 mmol·L-1Mg2+)12.5 μL,cDNA 模板(20 ng·μL-1) 1 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,加無菌ddH2O 補足至25 μL。PCR 反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸80 s,共35 個循環(huán)；72℃延伸10 min。 根據(jù)上述克隆測序獲得的UFGT基因片段設計3′端和5′端引物,并按上述反應體系和反應程序克隆獲得UFGT基因的3′端和5′端序列。 根據(jù)拼接獲得的UFGT基因cDNA 全長序列,設計UFGT基因開放閱讀框引物,用于UFGT基因cDNA 全長克隆驗證和DNA序列克隆,反應體系與上述相同,反應程序除退火溫度為60℃外,也與上述程序一致。 基因克隆所用引物詳見表1。 上述所有PCR 擴增產(chǎn)物均經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳,并回收目的條帶,連接pMD18-T 載體并送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序,獲得所擴增目的條帶序列。

1.2.3VdUFGT基因及其編碼氨基酸序列的生物信息學分析 利用Nucleotide Blast 在線分析VdUFGT基因的同源性關(guān)系。 通過DNAMAN 8.0 軟件推測出VdUFGT基因編碼蛋白的氨基酸序列,并利用在線分析 工 具 ProtParam ( http：/ /web.expasy.org/protparam/)、 TMpred ( http：/ /www.ch.embnet.org/software/TMPRED _ form.html)、 SignalP 4.1 Server(http：/ /www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、NCBI 的CDD (http：/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)等預測VdUFGT基因推導的蛋白序列的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能等。GOR4(https：/ /npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_gor4.html)預測VdUFGT 蛋白二級結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL(http：/ /swissmodel.expasy.org/interactive)預測VdUFGT 蛋白的三級結(jié)構(gòu)。VdUFGT基因編碼蛋白的多重序列比對采用MEGA 7.0 軟件[29],并通過鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,Bootstrap 值設置為1 000。

1.2.4 基因轉(zhuǎn)錄水平的分析 利用NCBI 的Primer-BLAST (http：/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/)設計特異性引物用于RT-qPCR(表1),同時以經(jīng)篩選獲得的表達穩(wěn)定性好的基因為內(nèi)參[30],不同愈傷組織細胞系以β-Tubulin、EF1-α為內(nèi)參基因；不同培養(yǎng)階段以SAND、VAG為內(nèi)參基因(表1)。 以不同細胞系、不同培養(yǎng)階段的刺葡萄愈傷組織cDNA 為模板,在Light Cycler? 480II System (Roche)系統(tǒng)進行RTqPCR 反應,采用20 μL 反應體系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×) 10 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL、cDNA(5 ng·μL-1)模板2 μL,加滅菌ddH2O補足至20 μL。 PCR 反應程序：95℃預變性10 s；95℃變性5 s,60℃退火20 s,共40 個循環(huán)；融解曲線分析從60℃15 s,上升至95℃(每秒上升0.1℃)。 每個樣品均設3 次生物學重復。 采用2-ΔΔCt法[31]分析基因相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析基因相對表達量分析,利用DPS 軟件進行差異顯著性分析。

表1 本研究所用引物序列Table1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 刺葡萄UFGT 基因全長序列的克隆與分析

利用轉(zhuǎn)錄組UFGT基因片段設計的上下游引物進行擴增,測序得到了837 bp 的堿基序列片段(圖2-A),經(jīng)Nucleotide Blast 比對分析,其與山葡萄、歐洲葡萄、圓葉葡萄、美洲葡萄等的UFGT基因堿基序列相似性均達到98%以上,表明該片段為刺葡萄的UFGT基因,并將其命名為VdUFGT,GeneBank 登錄號為KY986282。 通過對VdUFGT基因的RACE 擴增,獲得該基因的3′端堿基序列為728 bp(圖2-B),與上述VdUFGT基因片段完全重疊的有653 bp,含有TAG 終止密碼子；獲得該基因5′端堿基序列為971 bp(圖2-C),與上述VdUFGT基因片段完全重疊的有535 bp,且含有ATG 起始密碼子。 拼接獲得帶有5′-UTR和poly A 尾的全長序列為1 469 bp,并利用DNAMAN 8.0 軟件預測VdUFGT基因的開放閱讀框(open reading flame,ORF)并設計ORF 引物,經(jīng)PCR 擴增TA克隆,獲得該基因的cDNA 及DNA 的ORF 全長序列,分別為1 371 bp(圖2-D) 和1 448 bp(圖2-E)。VdUFGT基因DNA 序列包含2 個外顯子和1 個內(nèi)含子,2 個外顯子長度分別為487 bp 和884 bp,內(nèi)含子長度為77 bp。

圖2 刺葡萄愈傷組織VdUFGT 基因克隆Fig.2 Cloning of VdUFGT in callus of spine grape

2.2 刺葡萄VdUFGT 基因編碼蛋白理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)的預測分析

在線軟件ProtParam 分析表明,VdUFGT基因編碼456 個氨基酸,預測分子式C2255H3503N605O648S19,原子總數(shù)為7 030 個,分子量約為50.1 kD,理論pI 為6.03,說明其為酸性蛋白；該蛋白由20 種氨基酸組成,纈氨酸含量最豐富,為9.2%,其他氨基酸含量介于1.1%～9.0%之間,不含吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸,負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)總電荷為48,正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)總電荷數(shù)42,親水性平均系數(shù)-0.008,不穩(wěn)定系數(shù)40.68,推測是一個帶負電荷的不穩(wěn)定親水性蛋白。 在線蛋白跨膜區(qū)軟件TMpred 預測表明,VdUFGT 蛋白存在閥值超過500 的4 個由內(nèi)而外的和3 個由外而內(nèi)的跨膜區(qū)域；SignalP 4.1 Server軟件分析表明,該蛋白不具有典型的信號肽切割位點,預測VdUFGT 蛋白為膜結(jié)合蛋白。

GOR4 預測分析表明,VdUFGT 蛋白的多肽鏈中,α-螺旋(alpha helix,h)占34.65%,延伸鏈(extended strand,e)占17.32%,而不規(guī)則卷曲(random coil,c)占48.03%,是最大的結(jié)構(gòu)元件(圖3-A)。 NCBI 的CDD分析表明,VdUFGT 蛋白具有一個UDPGT 結(jié)構(gòu)域,是UDPGT 超家族(superfamily)成員,具有UDP-黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶glycosyltransferase YjiC 特征區(qū)域(圖3-B)。SWISS-MODEL 預測VdUFGT 蛋白的三級結(jié)構(gòu)(圖3-C),分析顯示VdUFGT 蛋白的空間結(jié)構(gòu)構(gòu)象較為復雜,可能與其功能相關(guān)。

2.3 UFGT 同源基因編碼蛋白的物種間系統(tǒng)進化分析

將刺葡萄VdUFGT基因編碼蛋白的氨基酸序列通過NCBI 的BlastP 進行序列比對,比對結(jié)果選取排名靠前的25 個植物的UFGT同源基因蛋白的氨基酸序列,利用Mega 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。 由圖4可知,UFGT同源基因編碼蛋白所構(gòu)建的進化關(guān)系,與植物進化的關(guān)系相一致,分成兩大分支,擬南芥和醉蝶花同在一個大的分支中,其他23 個植物在另一個大分支中,并按照科或?qū)龠M一步分類；其中,6 個葡萄屬植物,包括刺葡萄(Vitis davidii)、美洲葡萄(Vitis labrusca)、圓葉葡萄(Vitis rotundifolia)、歐洲葡萄(Vitis vinifera)、歐美雜種葡萄(Vitis labrusca×Vitis vinifera)、山葡萄(Vitis amurensis)在同一個分支中,本試驗克隆獲得的刺葡萄VdUFGT基因編碼的蛋白處在該分支的上端,表明刺葡萄在進化上可能屬于較原始的類型。

圖3 刺葡萄VdUFGT 蛋白氨基酸序列的結(jié)構(gòu)預測分析Fig.3 The structure prediction of amino acid sequence of VdUFGT protein

2.4 刺葡萄VdUFGT 基因的表達分析

2.4.1 2 個細胞系中VdUFGT基因的轉(zhuǎn)錄水平分析 前期研究發(fā)現(xiàn)DLR 和DLW 2 個愈傷組織細胞系合成花青素和原花青素的能力存在較大差異,DLR 細胞系具有很強的花青素和原花青素合成能力,而DLW細胞系沒有花青素和原花青素合成能力[27]。 由圖5可知,2 個細胞系VdUFGT基因相對表達量在不同培養(yǎng)時間均存在極顯著差異,培養(yǎng)25 d 和35 d DLR 細胞系VdUFGT基因的表達量分別較DLW 高79 倍和14 倍以上,表明DLR 細胞系和DLW 細胞系花青素和原花青素合成能力的差異,在VdUFGT基因的轉(zhuǎn)錄水平上得到了充分體現(xiàn)。 進一步說明VdUFGT基因在刺葡萄細胞中花青素合成中具有重要作用,其表達變化是與其功能相適應的。

2.4.2 刺葡萄愈傷組織不同培養(yǎng)階段VdUFGT基因的相對表達變化趨勢 RT-qPCR 檢測結(jié)果表明,在DLR 愈傷組織培養(yǎng)過程中,VdUFGT基因表達水平變化幅度大且較復雜,有2 個明顯的表達峰值,分別出現(xiàn)在刺葡萄愈傷組織快速生長的中期和衰老的初期,具體的變化趨勢為10～15 d 表達水平較低,15 ～20 d 時表達水平快速上調(diào),20～25 d 表達水平急劇增加,到25 d 時達到整個培養(yǎng)過程的最高值,且顯著高于其他培養(yǎng)時間,之后急劇下調(diào),30～45 d 表達水平變化較為平緩,45～50 d 時又快速上調(diào),形成第2 個高峰,50 d 時相對表達量為2.34,50 d 后又快速下調(diào),55 ～60 d 表達水平略為上調(diào)。 DLR 愈傷組織有極強的花青素和原花青素合成能力,VdUFGT 是其合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶,其復雜的變化趨勢,可能與其行使的功能相適應。 DLW 愈傷組織細胞系幾乎不合成花青素和原花青素,與此相適應的是VdUFGT表達水平雖然也呈現(xiàn)起伏變化,培養(yǎng)過程部分階段表達量也存在顯著性差異,但其與DLR 相比變化幅度不大,整個培養(yǎng)過程其相對表達量維持在0.48 ～1.68 之間(圖6)。

3 討論

葡萄果實中花青素的含量是葡萄外觀品質(zhì)的重要指標,也決定了其加工品質(zhì)[32-33]。 近年來隨著人們對葡萄多酚類物質(zhì)(包括花青素)關(guān)注,大量的研究者對葡萄果實花青素生物合成進行了相關(guān)研究[34-35]。 葡萄果實中花青素的生物合成代謝途徑受一系列結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子催化和調(diào)控[3,32],在這些結(jié)構(gòu)基因中,UFGT基因編碼的酶在花青素合成代謝最后階段起關(guān)鍵的催化作用,將花青素糖基化,形成穩(wěn)定的花青素苷,從而顯示不同的色澤[4]。 研究表明,UFGT基因在葡萄花青素生物合成中的表達存在品種特異性,如在紅高葡萄芽變株系中UFGT轉(zhuǎn)錄水平較高,導致果皮中花青素含量增加[26]；刺葡萄轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),UFGT基因在黑色品種中高水平表達,而在白色刺葡萄品種中不表達[22]。 本研究結(jié)果表明,VdUFGT基因在紅色刺葡萄愈傷組織中表達水平極高,而在白色刺葡萄愈傷組織中僅有微量表達,這與前人研究一致,但由于紅色愈傷組織和白色愈傷組織均來源于同一刺葡萄的幼胚,其VdUFGT基因的表達模式可能與葡萄品種間UFGT差異表達的模式有一定的差異。 此外,本研究的白色刺葡萄愈傷組織VdUFGT基因有轉(zhuǎn)錄,只是轉(zhuǎn)錄水平極低,與前人白色葡萄品種檢測不到UFGT基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)論不一致[21-22],這種差異是否存在新的機制還有待進一步研究。

圖4 UFGT 同源基因編碼蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic tree of proteins encoding from UFGT homologous genes

圖5 不同刺葡萄愈傷組織細胞系中VdUFGT 的表達分析Fig.5 Expression of VdUFGT in different cell lines of spine grape callus

圖6 刺葡萄愈傷組織不同培養(yǎng)階段VdUFGT 的表達分析Fig.6 Expression of VdUFGT at different culture stages during the culture of spine grape callus

葡萄果實發(fā)育是一個復雜的過程,尤其是其進入葡萄漿果著色成熟期,是葡萄果實色澤形成的關(guān)鍵時期[36]。 研究表明,葡萄中UFGT基因受諸多理化因子的調(diào)控,如葡萄細胞培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)基中添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)可以促進UFGT的表達,使花青素含量增加[23],而添加eutypine 會抑制UFGT基因轉(zhuǎn)錄,從而使細胞中花青素累積量下降[33]；脫落酸能強化UFGT的表達而加速葡萄果實轉(zhuǎn)色[37-38]；夜間光照處理可改變UFGT的表達而顯著影響葡萄果皮花青素苷的生物合成[39]；有機質(zhì)能促進UFGT基因表達而提高葡萄果皮花色苷含量[40]；果膠寡糖能使UGFT持續(xù)高水平表達從而增加葡萄果皮花青素的含量[41]；蔗糖可作為信號分子促進UFGT基因的表達,增加葡萄果皮中花青素含量[42]。本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)接后的刺葡萄紅色愈傷組織會褪色,且隨后愈傷組織基本處于無色狀態(tài),培養(yǎng)15 d 后顏色才開始慢慢出現(xiàn),培養(yǎng)20 d 后愈傷組織顏色持續(xù)加深,25 d 后愈傷組織顏色快速加深,這種變化情況與其VdUFGT基因轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢基本一致,表明可通過外源理化因子的作用來提高刺葡萄細胞中花青素的含量。 此外,本研究還發(fā)現(xiàn),刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)45～55 d 時,VdUFGT基因轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)突然升高又迅速下降的現(xiàn)象,這可能是因為細胞進入衰老初期,有一個類似氧化脅迫的過程,推測其是一種抵御衰老氧化脅迫的機制,但準確的結(jié)論還需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究從刺葡萄愈傷組織中分離獲得VdUFGT的cDNA 和DNA 全長序列分別為1 371 bp 和1 448 bp,DNA 序列含有1 個長度為77 bp 的內(nèi)含子。 生物信息學分析表明,VdUFGT基因編碼一個酸性、帶負電荷的不穩(wěn)定親水蛋白,屬于UDPGT 超家族成員；由UFGT同源基因編碼蛋白所構(gòu)建的進化關(guān)系,與植物真實進化的關(guān)系相一致,刺葡萄與美洲葡萄的親緣關(guān)系較近,進化上可能屬于較原始的類型。 紅色刺葡萄愈傷組織的VdUFGT基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于白色刺葡萄愈傷組織的轉(zhuǎn)錄水平；在刺葡萄愈傷組織的連續(xù)培養(yǎng)過程中,VdUFGT對紅色愈傷組織細胞培養(yǎng)物中的花青素合成有重要的調(diào)控作用,這種調(diào)控作用主要發(fā)生在刺葡萄愈傷組織培養(yǎng)的細胞快速生長的中期和細胞衰老的初期。 本研究結(jié)果為刺葡萄細胞培養(yǎng)生產(chǎn)花青素的合成調(diào)控研究提供了理論依據(jù)。