心肌短時(shí)間缺血致其無法得到充足的營養(yǎng)，再通后會(huì)造成心肌一定程度損傷，稱為急性心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。MIRI常伴炎癥反應(yīng)，血中炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等大量釋放，介導(dǎo)心肌氧化損傷，使損傷惡化加重。NF-κBp65是細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在炎癥因子的刺激下，NF-κBp65通常依賴經(jīng)典信號(hào)途徑被活化，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法復(fù)制大鼠心肌缺血模型，觀察雙參通脈顆粒對(duì)心功能的保護(hù)作用，探討其對(duì)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α及心肌組織NF-κBp65蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 雙參通脈顆粒(ginseng and salvia granules for promoting blood flow，GSG)為遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，合心爽(鹽酸地爾硫卓片，diltiazem hydrochloride，DH)購自天津田邊制藥有限公司，IL-1β檢測試劑盒、IL-6檢測試劑盒、TNF-α檢測試劑盒購自凱基生物有限公司，NF-κBp65抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 5234R型高速離心機(jī)(德國Eppdendorf公司)，BB23型培養(yǎng)箱(美國PE公司)，ROTEAN電泳系統(tǒng)(美國Bio公司)，冰凍切片機(jī)OM3123型(瑞典Bio公司)，恒溫恒濕箱(上?？萍忌锕?，Leica圖像分析儀(德國Leica公司)。

1.3 心肌缺血模型的復(fù)制 SD大鼠40只，2.5%戊巴比妥腹腔內(nèi)注射麻醉，成功后，取大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，氣管切開插管，小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，調(diào)節(jié)參數(shù)：頻率85次/min、潮氣量18 mL、呼吸比1∶1，于術(shù)中記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部、心前區(qū)剪毛，碘伏消毒術(shù)野，心前區(qū)胸骨左側(cè)第3肋間切口，逐層鈍性分離皮下組織，沿肋間剪開肌肉，分離肋骨，暴露心包，大鼠呼氣末破入胸膜，進(jìn)入心包，小心剪開心包膜，暴露心臟，左右各上一眼科用小拉鉤使心臟暴露充分，找到左心耳，于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界處下方確定結(jié)扎位置，以6-0號(hào)帶線縫合針在冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)下方2 mm處結(jié)扎，進(jìn)針深度約2 mm，心電圖(ECG)監(jiān)測到ST段抬高0.2 mV即為造模成功，持續(xù)30 min后打開結(jié)扎線，再灌注120 min，胸腔放置引流管，逐層縫合肋骨、肌肉，關(guān)閉胸腔，抽出胸腔積氣積液，拔出引流管。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥 健康成年SD大鼠，體重280～300 g，隨機(jī)分為4組，每組10只。假手術(shù)組(sham operation group，Sham組)只開胸不結(jié)扎，生理鹽水灌胃，1次/日，連續(xù)4周；模型組(MIRI組)開胸結(jié)扎LAD 30 min，再灌注120 min，生理鹽水灌胃，1次/日，連續(xù)4周；合心爽治療組(DH組)：開胸結(jié)扎LAD 30 min，再灌注120 min，合心爽灌胃，4.23 mg/kg，1次/日，連續(xù)4周；雙參通脈顆粒治療組(GSG組)開胸結(jié)扎LAD 30 min，再灌注120 min，雙參通脈顆粒灌胃，按大鼠體表面積給藥，相當(dāng)于生藥量11 g/kg，1次/日，連續(xù)4周。

1.5 血流動(dòng)力學(xué)測定 取材前，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，左心導(dǎo)管插管至左心室，由 ALC-MPA 多導(dǎo)生物信號(hào)分析系統(tǒng)記錄血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括左室收縮壓(LVSP)、左室舒張壓(LVDP)、心率(HR)。

1.6 取材方法 經(jīng)腹主動(dòng)脈負(fù)壓采血2～10 mL，低溫離心，試管編號(hào)后，留存?zhèn)溆?；取左室中部連續(xù)2塊厚2～3 mm 心肌組織，浸泡于4%多聚甲醛中，病理學(xué)觀察；剩余缺血區(qū)心肌組織置于-80 ℃冰箱中保存待測。

1.7 實(shí)驗(yàn)前后大鼠心率變化測定 將大鼠麻醉后仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，按照右上肢紅色，右下肢黑色，左上肢黃色，左下肢綠色的順序，將肢導(dǎo)聯(lián)的電極針插入動(dòng)物四肢的皮下(注意不要插入四肢肌肉)，連接好導(dǎo)聯(lián)線至心電圖機(jī)，即可進(jìn)行心電圖的記錄。全程記錄各組大鼠一般狀態(tài)及心率變化，并判定造模是否成功。

1.8 心肌組織病理變化觀察 組織標(biāo)本固定于4%多聚甲醛中，觀察時(shí)各級(jí)乙醇脫水，石蠟固定，進(jìn)行常規(guī)切片，再于二甲苯、各級(jí)乙醇中脫水，蘇木精-伊紅(HE)染色，二甲苯透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察左心室組織學(xué)改變。

1.9 血清IL-1β、IL-6、TNF-α測定 經(jīng)腹主動(dòng)脈負(fù)壓采血 2～10 mL，3 000 r/min離心取血清，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量，按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.10 心肌組織NF-κBp65蛋白表達(dá) 提取總蛋白，加液氮研磨，加RIPA裂解液，漩渦混勻，放置 1 h ，4 ℃，13 000 r/min離心 20 min，檢測蛋白濃度，計(jì)算所需蛋白上樣量，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后，電壓100 V，恒壓轉(zhuǎn)膜90 min，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，牛奶封閉1 h，PBST溶液洗膜3次，每次7 min，加入一抗，孵育4 h，PBST 洗膜 3次，每次7 min。加入溶有鼠或兔二抗的牛奶，室溫孵育 1 h，PBST 洗膜3次，每次10 min，加顯色液顯色，暗室中顯影。ImageJ軟件進(jìn)行western蛋白定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)(見表1)

組別只數(shù)LVSP(mmHg)LVDP(mmHg)HR(次/min)Sham組10124.84±6.14 6.34±1.4821.63±5.32 MIRI組1096.32±6.191)14.16±2.041)40.07±7.981)DH組 10110.36±4.012)10.78±1.372)19.08±4.312)GSG組10130.57±1.082)3)7.16±1.972)3)13.25±3.642)3)F值5.6482.3493.241P<0.01<0.01<0.01

注：1 mmHg=0.133 kPa。與Sham組比較，1)P<0.05；與MIRI組比較，2)P<0.05；與DH組比較，3)P<0.05

2.2 造模前后大鼠心電圖變化(見圖1)

A為術(shù)前；B為術(shù)后

2.3 各組大鼠心肌病理變化 Sham組：心肌細(xì)胞排列緊密、規(guī)整、間隙小，未發(fā)現(xiàn)有明顯水腫區(qū)域存在，肌纖維無明顯扭曲。心肌細(xì)胞膜完整、界限清晰、細(xì)胞核位置居中，細(xì)胞間隙無紅細(xì)胞出現(xiàn)，炎癥浸潤。MIRI組：肌纖維扭曲紊亂，亦有部分纖維斷裂；細(xì)胞腫脹變大，組織間隙增寬，水腫現(xiàn)象明顯，炎細(xì)胞浸潤布滿視野；細(xì)胞間隙可見大量紅細(xì)胞存在，出血情況嚴(yán)重；細(xì)胞核散亂無規(guī)律。DH組：炎細(xì)胞浸潤明顯，紅細(xì)胞滲出較多，然而細(xì)胞間的水腫情況有所好轉(zhuǎn)，肌纖維斷裂現(xiàn)象較少。GSG組：與MIRI組比較損傷顯著降低，顯微鏡下觀察時(shí)細(xì)胞邊界清晰、輪廓完整，組織間隙仍有不同程度水腫，但整體較輕，紅細(xì)胞滲出不多。詳見圖2。

圖2 心肌組織病理改變(HE染色，×200)

2.4 血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量變化(見表2)

組別只數(shù)IL-1βIL-6TNF-α(×103)Sham組10184.35±4.64124.03±6.101.53±0.25MIRI組10286.52±6.191)164.37±1.361)1.94±0.361)DH組 10195.21±3.122)139.15±4.132)1.26±0.122)GSG組10164.27±1.052)3)104.13±4.652)3)1.01±0.142)3)F值6.3142.2472.014P<0.01<0.01<0.01

與Sham組比較，1)P<0.05；與MIRI組比較，2)P<0.05；與DH組比較，3)P<0.05

2.5 心肌組織NF-κBp65蛋白表達(dá) 與Sham組(0.92±0.06)比較，MIRI組(1.63±0.07)NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與MIRI組比較，DH組(1.53±0.13)NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)；與DH組比較，GSG組(1.13±0.37)NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)。詳見圖3。

圖3 心肌組織NF-κBp65蛋白表達(dá)變化

3 討 論

在心肌缺血再灌注損傷病理過程中，炎性介質(zhì)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)起到了至關(guān)重要的作用，中性粒細(xì)胞釋放炎癥物質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞黏附分子表達(dá)，促使粒細(xì)胞進(jìn)入缺血區(qū)，加重氧化損傷[1-2]。心肌缺血氧化損傷可促進(jìn)氧自由基的產(chǎn)生,刺激組織釋放炎性介質(zhì)，如IL-1β、IL-6、TNF-α等[3]，引發(fā)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，放大炎癥信號(hào)，組織中NF-κBp65蛋白表達(dá)增加。MIRI是系統(tǒng)炎癥與局部炎癥共同作用的結(jié)果[4-7]。NF-κB是一種具有調(diào)控細(xì)胞因子、化學(xué)因子功能的核轉(zhuǎn)錄因子，其對(duì)炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及細(xì)胞凋亡均有調(diào)節(jié)作用，是參與MIRI細(xì)胞氧化損傷的主要作用靶點(diǎn)[8]。NF-κB的異常激活與心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

GSG由中藥人參、丹參、黃芪、麥冬、川芎、當(dāng)歸6味藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)的功效。人參，五加科植物人參的干燥根，味甘苦、性平，歸肺、脾、心經(jīng)，具有大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺、生津安神等功效?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)人參皂苷對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈縮窄所致的心肌肥厚有抑制作用，其機(jī)制可能與干預(yù)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[9]。丹參，唇形科植物鼠尾草丹參的干燥根及根莖，具有活血調(diào)經(jīng)、涼血消癰等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明丹參具有抗血小板聚集、降低血液黏度、調(diào)節(jié)凝血系統(tǒng)的功能，是一種安全可靠的治療心血管疾病的天然中藥[10]。黃芪，豆科多年生草本植物膜莢黃芪和蒙古黃芪的根，味甘，性微溫，具有補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表、托毒生肌的功效。黃芪皂苷可通過抑制心肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶增強(qiáng)心肌收縮力，改善心室構(gòu)型和射血功能，改善心肌營養(yǎng)，降低心肌耗氧量，并可穩(wěn)定細(xì)胞膜，從而減輕心肌細(xì)胞損傷[11]。麥冬，百合科植物麥冬的干燥塊根，味甘、微苦，微寒，歸心、肺、胃經(jīng)，具有養(yǎng)陰生津、潤肺清心的功效。麥冬總皂苷對(duì)心肌細(xì)胞缺氧再灌注損傷具有保護(hù)作用[12]。川芎，傘形科藁本屬川芎的根莖，性溫味辛，歸肝膽經(jīng)，為血中氣藥，行氣活血，開郁止痛。川芎嗪可以通過抑制NF-κB信號(hào)通路，來改善由血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)介導(dǎo)的新生小鼠心肌細(xì)胞肥大[13]。當(dāng)歸，傘形科植物當(dāng)歸的根，性溫味甘辛，歸心肝脾經(jīng)，具有補(bǔ)血和血、調(diào)經(jīng)止痛、潤燥滑腸的功效。當(dāng)歸提取液高劑量(80 mg/kg)條件下對(duì)血栓的形成有拮抗作用，阿魏酸及多種氨基酸具有抗心律失常、擴(kuò)張血管、減少細(xì)胞凋亡等多種藥理作用[14]。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)GSG組IL-1β、IL-6、TNF-α濃度明顯減少，表明GSG能有效降低心肌IL-1β、IL-6、TNF-α濃度，減輕炎癥反應(yīng)，減輕心肌缺血再灌注損傷。GSG組心肌組織NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯降低，表明GSG可能通過調(diào)節(jié)NF-κB抑制心肌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是MIRI的重要損傷因素，本實(shí)驗(yàn)表明GSG能減輕心肌炎癥反應(yīng)，降低心肌細(xì)胞凋亡，減輕氧化損傷，其機(jī)制可能與降低IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性介質(zhì)，抑制NF-κBp65蛋白表達(dá)有關(guān)。