周先容,趙 欣，龍興瑤,母健菲,潘妍霓,騫 宇,*

(1.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系,重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心, 重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心,功能性食品研發(fā)重慶市工程實驗室,重慶 400067; 2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715)

普洱茶原產(chǎn)地為云南,是以云南大葉種茶制成的曬青毛茶為原料,經(jīng)加工而成的各種云南茶葉的統(tǒng)稱,按生產(chǎn)方式可分為生普洱茶和普洱熟茶,其中生普洱茶未經(jīng)人工“發(fā)酵”、“渥堆”等處理,而是以自然陳放的方式制成[1-2]。茶多酚是茶葉中的重要活性成分,它對機體具有較多的生理作用,目前對茶多酚體外抗氧化的研究較為多見,侯冬巖等[3]研究了紅茶茶多酚的體外抗氧化性能,結(jié)果表明紅茶具有較高的茶多酚含量和較強的抗氧化能力;劉佳等[4]研究結(jié)果表明,苦丁茶多酚對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除能力較強,說明苦丁茶多酚具有較強的抗氧化作用。除了研究茶多酚的體外抗氧化效果,茶多酚的體內(nèi)生理作用研究也備受關(guān)注。趙欣等[5]通過動物實驗研究表明,苦丁茶多酚提取物對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有較好的改善作用;張曉夢[6]通過藥理實驗證明鷓鴣茶多酚對大鼠體重、子宮指數(shù)、SOD、MDA、ALP及雌二醇等指標均有影響,說明鷓鴣茶多酚具有防治去勢大鼠骨質(zhì)疏松的作用;熊昌云[7]研究證明普洱茶對營養(yǎng)性肥胖大鼠具有顯著的降脂減肥效果,且存在劑量效應(yīng)。Lagha等[8]研究表明茶多酚可以抑制具核梭桿菌引起的人類單核細胞U937中NF-KB的激活,抑制巨噬細胞分泌細胞因子,進而表明茶多酚可以用來預(yù)防牙周炎以及炎癥性腸道疾病。綠茶多酚能抑制皮膚分泌黑色素、抗皺、抗氧化以及阻止紫外線引起的皮膚免疫抑制,從而有效減緩皮膚的光老化[9]。普洱茶作為聞名中外的中國名茶,同樣含有豐富的茶多酚物質(zhì),目前對普洱茶多酚的研究多集中于體外抗氧化、減肥、預(yù)防肝損傷和成分變化等方面[10-12],關(guān)于普洱茶多酚抑制酒精性胃損傷的研究并不多見。

據(jù)資料顯示,每年中國人均酒精攝入量為10.61 L,其中男性的攝入量更是高達13.68 L[13]。然而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明[14],飲酒人群的胃腸道疾病發(fā)生率明顯高于非飲酒人群。經(jīng)常攝入高濃度的酒精會導(dǎo)致胃黏膜變薄,并致使其上皮細胞壞死脫落,微血管內(nèi)皮損傷、栓塞,組織缺血缺氧壞死,從而引起胃黏膜糜爛甚至潰瘍形成,誘發(fā)胃十二指腸黏膜損傷及相關(guān)性胃病[15]。普洱茶中豐富的茶多酚、水溶性纖維和果膠有利于腸道中益生菌的繁殖與生長,對腸道中微環(huán)境的構(gòu)建起到很好的促進作用,而且對腸道粘膜萎縮有抑制作用,保護腸粘膜的屏障功能及保護肝臟等[16]。目前關(guān)于茶多酚對小鼠胃黏膜損傷的報道較為少見,目前還未見關(guān)于不同年份生普洱茶多酚抑制小鼠胃損傷的研究。故本實驗旨在研究不同年份生普洱茶多酚的體外抗氧化效果及其對小鼠酒精性胃損傷的抑制作用,結(jié)合體外試驗和體內(nèi)試驗來共同評價生普洱茶多酚的保健功效,為生普洱茶的深入開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ),為其營養(yǎng)價值的評價提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普洱茶 選用2008年、2012年、2016年老班章生茶,購于昆明市西山區(qū)祥潤茶廠生產(chǎn);沒食子酸、福林—酚試劑、ABTS 都萊生物-中國生化試劑網(wǎng);DPPH 南京化成工業(yè)株式會社;過硫酸鉀、鐵氰化鉀 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒 南京建成生物研究所;DNase/Rnase-Free Water 北京索萊寶科技有限公司;Trizol試劑、SYBR Select Master Mix和RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit 美國Life techmologies公司;RT-qPCR引物環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS) 重慶茂百科技有限公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純;清潔級雄性昆明小鼠 50只,6周齡,購于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,在溫度(22±4) ℃、濕度50%±20%下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

PHS-3E pH計 上海雷磁儀器廠;Q5200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;MJ-WBL2501B多功能電動攪拌機 臨沂市盛隆電器廠;HHW21.600AII水浴鍋 太原市晉冀通實驗儀器設(shè)備有限公司;DLSB-5/10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;Vavioskan lux多功能微孔板讀數(shù)儀 賽默飛世爾科技有限公司;多功能酶標儀、StepOnePlus Real-Time PCR System 美國Thermo Fisher Scientific公司;UPH-II-20T優(yōu)普純水/超純水制造系統(tǒng) 四川優(yōu)普超純科技有限公司;Bioprep-24生物樣品均質(zhì)儀、Icen-24R臺式高速冷凍離心機、Nano-300微量分光光度計 杭州奧盛儀器有限公司;BX43正置顯微鏡 日本奧林巴斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生普洱茶多酚物質(zhì)的提取 采用多功能電動攪拌機將生普洱茶進行粉碎,然后分別稱取2008年、2012年及2016年的生普洱茶粉末100 g至250 mL燒杯中,加入300 mL 45%乙醇溶液,90 ℃下水浴浸提30 min,以同樣條件再次浸提一次,合并2次浸提液,調(diào)節(jié)pH至6.0,然后加入AlCl3和ZnCl2混合沉淀劑進行沉淀,接著在3000 r/min條件下對混合液離心10 min,棄去上清液并在沉淀中加入200 mL 12%的鹽酸再次于3000 r/min離心10 min,收集上清液。分別2次加入200 mL乙酸乙酯對分離出的上清液進行萃取。最后對萃取液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到多酚提取物[17]。

1.2.2 生普洱茶多酚含量測定 將沒食子酸配制成濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸原液,然后分別取0、2、4、6、8 mL的沒食子酸原液置于25 mL容量瓶中定容至刻度,按Folin-Ciocalteu比色法[18]取1 mL不同濃度的沒食子酸溶液、3 mL Folin-Ciocalteu顯色劑和4.5 mL的飽和Na2CO3溶液于25 mL容量瓶中加蒸餾水定容至刻度,取顯色后的溶液于747 nm波長下測定吸光值[19],每個樣品重復(fù)3次,取平均值。以吸光度值為X軸坐標,沒食子酸溶液濃度為Y軸坐標繪制沒食子酸標準曲線[20],得到回歸方程為y=11.625x-0.428,決定系數(shù)R2=0.9985。將樣品溶解于蒸餾水中，采用以上的方法測定吸光度值后對照標準曲線求得生普洱茶粗多酚的含量。

1.2.3 生普洱茶多酚體外抗氧化效果評價

1.2.3.1 清除DPPH自由基能力測定 參照韋獻雅等[21]的方法,在3個離心管中分別加入不同濃度的樣品和試劑,其中A1號離心管加入25 μg/mL DPPH溶液3.9 mL、樣液100 μL;A2號離心管加入無水乙醇3.9 mL、樣液100 μL;A3號離心管加入25 μg/mL DPPH溶液3.9 mL、80%甲醇溶液100 μL。然后3個離心管搖勻后在暗處靜止反應(yīng)30 min,測定最終反應(yīng)液在517 nm波長下的吸光度值,以VC作為陽性對照實驗。DPPH自由基清除率按以下公式計算:

式(1)

1.2.3.2 清除ABTS+自由基能力測定 參照蔡文國等[22]的方法,在3個離心管中分別加入不同濃度的樣品和試劑,其中A1號離心管加入7 mmol/L ABTS自由基反應(yīng)溶液5.0 mL、樣液200 μL;A0號離心管加入無水乙醇5.0 mL、樣液200 μL;A2號離心管加入7 mmol/L ABTS自由基反應(yīng)溶液5.0 mL和80%甲醇溶液200 μL。3個離心管混勻后室溫下避光反應(yīng)6 min,測定最終反應(yīng)液在734 nm波長下的吸光度值,以VC作為陽性對照實驗。按以下公式計算ABTS自由基清除率:

式(2)

1.2.3.3 清除羥自由基能力測定 參照賈榮[23]的方法,在3個離心管中分別加入不同濃度的樣品和試劑,其中A0號離心管加入300 μL 80%甲醇、9 mmol/L FeSO42.0 mL、9 mmol/L水楊酸乙醇溶液1.0 mL和8.8 mmol/L H2O21.0 mL;Ai號離心管加入300 μL樣品、9 mmol/L FeSO42.0 mL、9 mmol/L水楊酸乙醇溶液1.0 mL和8.8 mmol/L H2O21.0 mL;Aj號離心管加入300 μL樣品、9 mmol/L FeSO42.0 mL、9 mmol/L水楊酸乙醇溶液1.0 mL和80%甲醇1.0 mL。混勻后置于37 ℃水浴鍋中加熱30 min,測定最終反應(yīng)液在510 nm波長下的吸光度值,以VC作為陽性對照實驗。按以下公式計算羥自由基清除率:

式(3)

1.2.3.4 還原力測定 采用鐵離子還原力測定法[24],分別取不同濃度的VC標準液和樣品液,加入0.2 mol/L的PBS緩沖液2.5 mL和1% K3Fe(CN)6溶液2.5 mL,充分混勻后在50 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)20 min,快速冷卻,加入體積分數(shù)10%三氯乙酸2.0 mL終止反應(yīng)。取混合液2.5 mL,加入蒸餾水2.5 mL和0.1% FeCl30.5 mL,充分混勻,在室溫下靜置10 min,模型組用2.5 mL甲醇溶液反應(yīng)的混合液代替VC標準液和樣品液,于700 nm處測吸光值。以VC作為陽性對照,吸光度值越高,還原能力越強。

1.2.4 動物分組與處理 參照Yu等[25]的研究方法,將50只清潔級昆明小鼠隨機分為5組,每組10只,分別為正常組、模型組、2008年生普洱茶多酚組(2008年組)、2012年生普洱茶多酚組(2012年組)與2016年生普洱茶多酚組(2016年組)。正常組和模型組每天灌胃0.2 mL生理鹽水;2008年組、2012年組與2016年組每天分別灌胃0.2 mL 2008年生普洱茶多酚提取物(200 mg/kg·BW)、2012年生普洱茶多酚提取物(200 mg/kg·BW)和2016年生普洱茶多酚提取物(200 mg/kg·BW)。在第14 d灌胃完成之后,所有組小鼠禁食不禁水24 h,第15 d除正常組小鼠外,其余組小鼠均灌胃胃損傷誘導(dǎo)劑(60%的無水乙醇,40%的150 mmol/L鹽酸混合液),每10 g小鼠體重灌胃0.1 mL。灌胃30 min后處死所有小鼠,收集小鼠血液并在4 ℃,4000 r/min離心10 min后取上層血清備用;距賁門和幽門1.5 cm處取出全胃,收集胃液并測定胃液pH,然后沿胃大彎側(cè)剖開,用冰生理鹽水沖洗后,濾紙吸干鋪開,取一段1 cm×0.5 cm的胃組織固定于10%的福爾馬林溶液中,用于做病理組織切片,剩余胃組織放于-80 ℃凍藏備用。整個實驗期間每天稱量記錄小鼠體重。

1.2.5 H&E染色 將小鼠胃組織放在10%福爾馬林溶液中固定24 h,然后通過包埋、切片、制片、脫蠟、蘇木精染色和伊紅染色等步驟獲得切片,最后把切片固定在中性樹膠里面,并在顯微鏡下觀察胃組織的形態(tài)學(xué)改變。

1.2.6 血清中SOD、MDA與GSH水平測定 根據(jù)試劑盒操作說明測定血清中的SOD、MDA與GSH水平。

1.2.7 小鼠胃組織中eNOS、nNOS、COX-2的mRNA表達情況 取50 mg左右胃組織進行組織勻漿,用Trizol提取胃組織中的總RNA,通過微量分光光度計測量總RNA濃度,并把RNA原液稀釋成1 μg/mL。取1 μg/μL的RNA溶液1 μL,加入1μL(oligo)Primer dT和10 μL無菌超純水,于65 ℃反應(yīng)5 min,取出后加入4 μL Reaction Buffer、1 μL Riblock Rnase Inhibitor和2 μL dNTP mix混合均勻,再加入1 μL Revert Aid M-mu/v RT,在42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min合成cDNA。然后于八聯(lián)管中加入10 μL Master、1 μL上游引物、1 μL下游引物、1 μL cDNA模板和7 μL滅菌超純水,簡短離心混勻。最后放入qPCR儀器中擴增,擴增條件為:95 ℃ 變性15 min,60 ℃ 退火1 h,95 ℃延伸15 min,然后循環(huán)40次。以持家基因GAPDH為內(nèi)參基因,通過2-ΔΔCT計算每個基因的相對表達量[26],對應(yīng)基因引物序列見表1。

表1 實驗中用到的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準偏差,采用SPSS 17.0軟件中的One-Way ANOVA進行差異顯著性分析,p<0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著差異。小腸H&E染色組織切片采用顯微鏡拍照觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 生普洱茶的多酚含量

通過標準曲線計算出生普洱茶多酚含量,結(jié)果分別為2008年生普洱多酚含量為92.53 mg/g、2012年生普洱多酚含量為180.00 mg/g、2016年生普洱多酚含量為308.72 mg/g。研究表明,普洱茶在存放過程中,茶多酚和兒茶素含量會有明顯的降低,可能是因為脂型兒茶素的水解,微生物的酶促氧化及自動氧化[27]。龔淑英等[28]對不同年代普洱茶的研究表明,普洱茶隨儲存時間的延長,茶葉中的多酚類自動氧化加深,其含量降低,與本實驗結(jié)果基本一致。

2.2 生普洱茶多酚的體外抗氧化結(jié)果

2.2.1 生普洱茶多酚清除DPPH自由基能力 DPPH自由基是一種合成的有機自由基,是國內(nèi)外常用的一種分析抗氧化活性的方法[29-30]。由圖1可知,3個年份生普洱茶多酚對DPPH自由基的清除能力呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系,當樣品濃度為8～24 μg/mL時,3者之間清除DPPH自由基的能力存在顯著差異(p<0.05);當樣品濃度大于24 μg/mL時,3個年份之間的差異明顯變小,其中2016年的生普洱茶多酚對DPPH自由基的清除能力顯著高于2008年和2012年的生普洱茶多酚(p<0.05),2008年生普洱茶多酚和2012年生普洱茶多酚對DPPH自由基的清除率之間則不存在統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。當樣品濃度為40 μg/mL時,2016年生普洱茶多酚對DPPH自由基的清除率最高達37.75%,顯著高于2008年和2012年生普洱茶多酚對DPPH自由基的清除率(p<0.05)。相對于3個年份生普洱茶多酚的DPPH自由基清除率,VC陽性模型組對DPPH自由基的清除率較低,而且當樣品濃度大于24 μg/mL時,VC對DPPH自由基的清除率明顯減緩。

圖1 不同年份生普洱茶多酚的DPPH自由基清除率Fig.1 DPPH free radical scavenging rate of Puer tea polyphenols in different years注:不同字母表示不同年份同一濃度時數(shù)據(jù)具有顯著性(p<0.05);圖2～圖4同。

2.2.2 生普洱茶多酚清除ABTS+自由基的能力 ABTS+自由基清除率是衡量受試物抗氧化能力的重要指標[31],ABTS+自由基經(jīng)氧化后形成較穩(wěn)定的藍綠色化合物,當有抗氧化劑存在時,ABTS+自由基與其反應(yīng)使溶液顏色變淺,反應(yīng)液吸光度值降低表明抗氧化劑具有抗氧化效果[32]。通過測定不同年份生普洱茶多酚對ABTS+自由基清除率的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著樣品濃度的增加,ABTS+自由基的清除率呈逐漸上升的趨勢。如圖2所示,當樣品濃度范圍為8～24 μg/mL時,3個不同年份生普洱茶多酚對ABTS+自由基的清除率差異較大,其中2016年生普洱茶多酚的ABTS+自由基清除率顯著高于2012年組和2008年組(p<0.05)。當樣品濃度>24 μg/mL時,3個年份生普洱茶多酚的ABTS+自由基清除率差異減小,但均顯著高于VC陽性模型組對ABTS+自由基的清除率(p<0.05)。

圖2 不同年份生普洱茶多酚的ABTS+自由基清除率Fig.2 ABTS+ free radical scavenging rate of Puer tea polyphenols in different years

2.2.3 生普洱茶多酚清除羥基自由基的能力 羥基自由基被公認為生物系統(tǒng)中最具活性的活性氧,能導(dǎo)致生物體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)發(fā)生氧化損傷[6]。不同年份生普洱茶多酚對羥基自由基的清除能力如圖3所示,綜合比較表明,3個年份生普洱茶多酚的羥基自由基清除率均隨著樣品濃度的升高而增大,且三者之間不存在顯著差異(p>0.05),說明儲藏年限的變化對生普洱茶多酚清除羥自由基的能力影響不明顯。有關(guān)羥基自由基作用機理的研究認為羥基自由基清除率與多酚分子結(jié)構(gòu)中酚羥基的數(shù)目有關(guān),而且不同種類的茶多酚對羥基自由基的清除率存在差異[33]。

圖3 不同年份普洱生茶多酚對羥基自由基的清除率Fig.3 OH free radical scavenging rate of Puer tea polyphenols in different years

2.2.4 不同年份生普洱茶多酚的還原力 由圖4可知,不同年份生普洱茶的茶多酚提取物的還原力不同,但整體趨勢都是隨著樣品濃度的增加其還原力增強,而且還原力越強,表明其抗氧化能力越強[34]。在樣品濃度為8～16 μg/mL時,不同年份生普洱茶多酚的還原力差別不大。但是當濃度大于16 μg/mL時,在相同的濃度下,每個年份的樣品提取物的還原力差異顯著(p<0.05),其中2016年茶葉中茶多酚含量最高,還原力也最高,綜合比較3個年份茶葉茶多酚的還原力大小為2016年>2012年>2008年。

圖4 不同年份生普洱茶多酚的還原力Fig.4 Reducing power of Puer tea polyphenols in different years

2.3 實驗過程中小鼠體重變化

整個實驗過程中,每天稱量小鼠體重,觀察不同年份茶多酚對小鼠體重的影響。如圖5A所示,所有組小鼠的體重都呈上升趨勢,其中模型組小鼠體重上升最明顯。相比正常組小鼠和模型組小鼠,灌胃3個不同年份普洱茶多酚的小鼠體重增長均較平緩,其中2008年組小鼠和2016年組小鼠體重顯著低于正常組和模型組(p<0.05),雖然2012年組小鼠體重與正常組和模型組之間不存在顯著差異(p>0.05),但是其初始體重就高于其他組,而且增長趨勢明顯更為平緩;圖5B為各實驗組小鼠每日進食量,其進食量與小鼠體重變化趨勢一致。寧鴻珍等[35]通過測定肥胖大鼠體內(nèi)血脂和瘦素的含量,從而研究茶多酚對肥胖大鼠體重的影響,結(jié)果表明茶多酚不僅可以明顯降低大鼠體重和體脂含量,還對血脂具有較好的調(diào)節(jié)作用。揭國良[36]通過研究茶多酚對3T3-L1前脂肪細胞和成熟脂肪細胞的生理作用,表明茶多酚可以降低3T3-L1前脂肪細胞的活力并降解成熟脂肪細胞,從而說明茶多酚具有減肥功效。Kuo等[37]的試驗結(jié)果表明,給正常大鼠灌胃普洱茶30周可顯著降低膽固醇、甘油三酯和體脂含量,且降低幅度比其它茶類(如綠茶)更大,同時體內(nèi)抗氧化酶SOD活性高于正常模型組。

圖5 實驗小鼠體重變化和每日進食量Fig.5 Body changes and daily intake of experimental mice

因此本實驗中茶多酚組小鼠體重增長低于正常組和模型組的原因可能與茶多酚的減肥效果有關(guān),而且通過相關(guān)性分析可知,茶多酚含量與小鼠體重之間的相關(guān)系數(shù)為-0.078,表示茶多酚含量與小鼠體重之間存在著負相關(guān),即小鼠灌喂茶多酚的量越大,小鼠體重增長越緩慢。

2.4 小鼠胃液量及胃酸值

由表2可知,模型組小鼠的胃液量最多,灌胃3個不同年份生普洱茶多酚的小鼠的胃液量都顯著低于模型組(p<0.05)。模型組小鼠的胃液pH為1.79,顯著低于其余組小鼠的胃液pH(p<0.05),然而灌胃3個不同年份生普洱茶多酚的小鼠的胃液pH均顯著高于模型組(p<0.05),且和正常組之間不存在顯著差異(p>0.05)。胃液量分泌過多或者胃液pH過低都會加重胃損傷的程度[38],如此說明生普洱茶多酚可以減少小鼠胃液量的過度分泌,還可維持小鼠胃內(nèi)正常pH,從而在一定程度上減少高濃度乙醇對胃的急性損傷作用。

表2 小鼠胃液量及胃酸值Table 2 Amount of gastric juice and acid in mice

2.5 胃組織病理學(xué)情況

通過HE染色后,于光學(xué)顯微鏡下觀察胃組織病理學(xué)形態(tài)的改變。如圖6所示,正常組小鼠的胃黏膜幾乎不存在斷裂或破損情況,腺體排列整齊,且粘膜固有層無炎癥細胞浸潤,說明灌胃生理鹽水不會導(dǎo)致小鼠胃黏膜損傷。與正常組小鼠的胃黏膜相比,模型組小鼠的胃黏膜出現(xiàn)了嚴重斷裂和脫落,腺體排列紊亂,固有層炎癥細胞浸潤嚴重,說明胃黏膜損傷模型造模成功。灌胃不同年份生普洱茶多酚的小鼠胃黏膜均存在不用程度的病理損傷,但明顯好于模型組。其中3個年份生普洱茶多酚中,2016年生普洱茶多酚對小鼠胃黏膜損傷的抑制作用最大,胃黏膜上皮細胞幾乎完整,腺體排列較整齊,且炎癥細胞分泌較少。如此說明灌胃生普洱茶多酚會對乙醇引起的小鼠胃黏膜損傷起到一定的抑制作用,而且普洱茶儲存年限越短,抑制效果越好。

圖6 不同年份生普洱茶多酚對小鼠胃黏膜病理學(xué)形態(tài)的影響(200×)Fig.6 Effects of different years of raw puer tea polyphenols on the pathological morphology of gastric mucosa in mice(200×)

2.6 血清中SOD、MDA與GSH水平

采用血清試劑盒測定小鼠血清中SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)與GSH(谷胱甘肽)的水平,結(jié)果如圖7所示。與正常組相比,模型組小鼠的SOD活性和GSH含量顯著降低(p<0.05),MDA含量顯著升高(p<0.05)。與模型組相比,灌胃3個不同年份普洱茶多酚的小鼠血清中的SOD活性明顯升高,其中2016年組小鼠血清中的SOD含量與正常組接近;灌胃3個不同年份普洱茶多酚的小鼠血清中的GSH含量均顯著高于模型組(p<0.05),且與正常組的GSH含量之間存在顯著差異(p<0.05);而灌胃3個不同年份普洱茶多酚的小鼠血清中的MDA含量都顯著低于模型組(p<0.05)。

圖7 小鼠血清中SOD、MDA與GSH水平Fig.7 SOD,MDA and GSH levels in serum of mice注：不同小寫字母表示差異顯著；圖8同。

目前越來越多的研究表明酒精造成的胃損傷與體內(nèi)活性氧的水平升高有關(guān)[37],機體內(nèi)存在著酶和非酶抗氧化防御系統(tǒng),包括SOD、GSH和CAT等。研究表明GSH和SOD能夠清除超氧化物、過氧化氫、羥基和脂質(zhì)過氧化氫自由基,從而降低組織的氧化損傷[39]。MDA是評判脂質(zhì)過氧化的指標,其含量與細胞損傷程度成正相關(guān)[40]。當機體內(nèi)活性氧含量超過抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力時,胃腸道的免疫功能將受到自由基的嚴重破壞,從而導(dǎo)致組織和器官損傷。本研究中3個不同年份的普洱茶多酚均可以提高小鼠體內(nèi)SOD活性和GSH含量,同時減少MDA的含量,進而保護胃組織不受乙醇引起的氧化損傷。

乙醇在乙醇脫氫酶的催化下生成乙醛,乙醛在黃嘌呤氧化酶作用下生成氧自由基導(dǎo)致胃粘膜損傷。自由基反應(yīng)與潰瘍的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系。體外抗氧化指標表明3個不同年份生普洱茶多酚具有較好的體外抗氧化效果,給胃損傷小鼠灌胃不同年份生普洱茶多酚后,小鼠血清中的抗氧化指標均有不同程度的提高,綜合體外和體內(nèi)抗氧化指標說明茶多酚對胃黏膜的保護作用可能與其抗氧化效果相關(guān)。

2.7 胃組織中eNOS、nNOS與COX-2的mRNA表達

采用RT-qPCR測定小鼠胃組織中eNOS、nNOS與COX-2的表達,結(jié)果如圖7所示。eNOS、nNOS在正常組小鼠胃組織中表達最高,而其COX-2的表達最低。與正常組小鼠比較,模型組小鼠的eNOS、nNOS表達顯著降低(p<0.05),COX-2表達顯著升高(p<0.05)。與模型組小鼠相比,eNOS、nNOS的表達在灌胃3個不同年份普洱生茶多酚組的小鼠胃組織中均有升高,其中3個年份eNOS的表達均顯著升高(p<0.05),且與正常組小鼠的eNOS表達無顯著差異(p>0.05),2008年組、2012年組和2016年組小鼠的nNOS表達也都顯著高于模型組(p<0.05);乙醇造模會引起小鼠胃組織中COX-2的表達升高,但給小鼠灌胃2012、2016年份的普洱生茶多酚會顯著降低COX-2的表達(p<0.05),且其表達情況和正常組的表達情況無顯著性差異。

圖8 eNOS、nNOS與COX-2的mRNA相對表達量Fig.8 mRNA expression of eNOS,nNOS and COX-2

胃黏膜中的一氧化氮合酶(NOS)分兩類,一種為固有性NOS(cNOS,包括eNOS、nNOS),一種為誘發(fā)性NOS(iNOS)。cNOS催化產(chǎn)生的NO少,對胃黏膜起到一定程度的保護作用,而且研究發(fā)現(xiàn)胃潰瘍的發(fā)生與eNOS、nNOS的過度抑制有關(guān)。邱紅梅等[41]研究石榴皮鞣質(zhì)對大鼠胃損傷的保護作用,結(jié)果表明150、500 mg/kg的石榴皮提取物可顯著抑制胃組織中eNOS和nNOS的表達下降,從而對酒精性引起的胃損傷起到較好的保護作用。環(huán)氧合酶(COX)是機體合成前列腺素(PCs)的關(guān)鍵酶,在正常情況下,COX-2幾乎不表達,但細胞因子、內(nèi)毒素會誘導(dǎo)COX-2的產(chǎn)生,而經(jīng)COX-2合成的PCs會加速機體炎癥的產(chǎn)生[42]。劉男等[43]研究發(fā)現(xiàn)乙醇致大鼠胃黏膜損傷會引起胃組織中COX-2的蛋白表達顯著升高,其他研究具有相同的結(jié)果[44]。本實驗結(jié)果表明3個不同年份的生普洱茶多酚均能上調(diào)胃組織中eNOS的表達,下調(diào)nNOS、COX-2的表達,其中2012年組和2016年組生普洱茶多酚的調(diào)節(jié)作用與模型組比較存在顯著差異(p<0.05),說明生普洱茶多酚能夠?qū)σ掖家鸬奈笓p傷起到一定的保護作用,這可能與多酚在體內(nèi)的抗氧化能力有關(guān)。

3 結(jié)論

本實驗通過提取2008、2012和2016年生普洱茶多酚,對其進行體外抗氧化效果評價及其對乙醇誘導(dǎo)胃損傷模型小鼠的保護作用評價,結(jié)果發(fā)現(xiàn):3個不同年份的生普洱茶多酚均具有較好的體外抗氧化效果,其中以2016年生普洱茶多酚的體外抗氧化效果最好;通過測量胃損傷小鼠的胃液量和胃酸值發(fā)現(xiàn),3個不同年份生普洱茶多酚均可抑制胃損傷小鼠胃液量的過度分泌,并能維持小鼠正常胃酸值,從而緩解乙醇對胃黏膜的損傷作用;通過胃組織切片觀察(H&E染色)發(fā)現(xiàn),2008年組、2012年組和2016年組小鼠的胃黏膜損傷程度與模型組小鼠相比均有不同程度的減輕;3個不同年份生普洱茶多酚均能增加小鼠血清中SOD酶活和GSH含量,同時減少MDA的含量,進而保護胃黏膜不受氧自由引起的氧化損傷,表明生普洱同時具有較好的體外和體內(nèi)抗氧化作用;3個不同年份生普洱茶多酚可從mRNA水平上調(diào)胃組織中eNOS和nNOS的表達,下調(diào)COX-2的表達,從而從基因?qū)用娓玫谋Ｗo胃組織不受乙醇引起的胃黏膜損傷。綜合本實驗各結(jié)果可知,不同年份生普洱茶多酚不僅具有較好的體外抗氧化效果,而且隨著茶多酚灌胃含量的升高,小鼠的酒精性胃損傷越低,體外和體內(nèi)實驗均表明普洱生茶具有較好的保健功效,為其深入開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。同時實驗過程中發(fā)現(xiàn)灌胃普洱生茶多酚的小鼠體重增長較緩,這可能與普洱茶的減肥作用有關(guān),后續(xù)可建立減肥模型對此假設(shè)進行深入驗證。