李 亞,王 通,王廣飛,王運(yùn)智,于雁飛,高永林,*

(1.煙臺(tái)嘉惠海洋生物科技有限公司,山東煙臺(tái) 264006; 2.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東煙臺(tái) 264005)

牡蠣俗稱海蠣子、生蠔,是世界上養(yǎng)殖規(guī)模最大的貝類,也是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一,在我國(guó)沿海地區(qū)有廣泛的人工養(yǎng)殖[1]。牡蠣中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富,包括高含量的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),氨基酸組成完善,富含維生素及各種微量元素,尤其是?；撬岷枯^高[2]。牡蠣藥食同源,不僅具有很高的食用價(jià)值,而且具有獨(dú)特的保健功能[3]。牡蠣肽是以牡蠣為原料,利用分子生物技術(shù)酶解加工后經(jīng)分離、純化、干燥等步驟制成的分子量較低的低聚肽混合物[4]。牡蠣肽近年來(lái)研究廣泛,牡蠣肽對(duì)機(jī)體有著抗氧化、抗高血壓、降血糖、提高免疫力、抗腫瘤、改善學(xué)習(xí)記憶等重要作用[5-7]。

腎陽(yáng)虛是一種中醫(yī)名詞術(shù)語(yǔ)。腎陽(yáng)虛證是中醫(yī)的基本證型之一[8],由于“腎陽(yáng)虛衰,溫煦失職,氣化失權(quán)”所表現(xiàn)出的虛寒型證候,稱為腎陽(yáng)虛證。機(jī)體腎陽(yáng)虛證的形成與神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)緊密相關(guān),是多系統(tǒng)和多器官功能的綜合表現(xiàn)[9]。腎陽(yáng)虛證在下丘腦-垂體-靶腺(腎上腺皮質(zhì)、甲狀腺、性腺、胸腺)軸均有不同環(huán)節(jié)、不同程度的功能紊亂,且主要的發(fā)病環(huán)節(jié)在下丘腦(或更高級(jí)中樞)的調(diào)節(jié)功能紊亂[10]。腎陽(yáng)虛的主要病機(jī)為甲減[11-12],甲狀腺功能低下在腎陽(yáng)虛病機(jī)學(xué)上占有重要的地位[13]。腎陽(yáng)虛的形成有先天遺傳的因素,也受后天膳食營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境因素、生理狀態(tài)、精神狀態(tài)、日常生活習(xí)慣以及某些疾病和治療的影響[14]。

動(dòng)物機(jī)體在某些化學(xué)試劑的誘導(dǎo)下會(huì)出現(xiàn)內(nèi)源性代謝紊亂和失調(diào),導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)病理和生理上的改變[15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠肌肉注射氫化可的松建立大鼠腎陽(yáng)虛模型,以大鼠下丘腦-垂體-甲狀腺軸中各激素水平的變化來(lái)判斷腎陽(yáng)虛模型的建立,并在建立模型過(guò)程中對(duì)動(dòng)物給予不同劑量牡蠣肽灌胃處理,通過(guò)測(cè)定血清中游離三碘甲狀腺原氨酸(T3)、游離Ⅲ磺甲狀腺原氨酸(T4)、促甲狀腺素(TSH)等激素水平及甲狀腺組織的病理變化,觀察牡蠣肽對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠的作用是否與改善下丘腦-垂體-甲狀腺軸的功能低下有關(guān)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

健康SD大鼠 雄性,SPF級(jí),9周齡,體重210～230 g,60只,由山東綠葉制藥有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可號(hào):魯20140002);飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供;牡蠣肽 煙臺(tái)嘉惠海洋生物科技有限公司(批號(hào)ML20180300205,肽含量為62.1%,平均分子量為480.37);氫化可的松注射液 天津金耀藥業(yè)有限公司;T3、T4、TSH酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒 上海超研生物科技有限公司;Trizol試劑 北京索萊寶科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 Thermo公司;其余所用試劑 均為分析純。

Multiskan MK3酶標(biāo)儀 Thermo公司;CX31生物顯微鏡 日本奧林巴斯公司;TDL-40B臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;石蠟切片機(jī) 德國(guó)Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將60只SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)分為5組,即正常組、模型組、牡蠣肽300 mg/kg組、牡蠣肽150 mg/kg組、牡蠣肽75 mg/kg組。其中正常組不注射氫化可的松、不進(jìn)行牡蠣肽灌胃、給予與牡蠣肽等體積的水;模型組以每天25 mg/kg劑量肌肉注射氫化可的松建立腎陽(yáng)虛模型(成功建模的模型組動(dòng)物表現(xiàn)為豎毛、采食飲水減少、活動(dòng)減少、體重減輕,血清T3、T4含量降低、TSH水平升高);牡蠣肽組動(dòng)物每天25 mg/kg劑量肌肉注射氫化可的松并灌胃給予相應(yīng)劑量牡蠣肽(300、150、75 mg/kg)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,實(shí)驗(yàn)持續(xù)35 d。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠正常進(jìn)食、正常進(jìn)水。

1.2.2 樣本采集 連續(xù)灌胃完畢,對(duì)各組大鼠進(jìn)行麻醉,抽取腹主動(dòng)脈血,以1200×g(4 ℃)轉(zhuǎn)速離心10 min,吸取上層血清分裝,-80 ℃冰箱保存。打開顱骨后分離出下丘腦組織和甲狀腺組織,甲狀腺用福爾馬林溶液固定保存,下丘腦使用液氮速凍。

1.2.3 血清T3、T4、TSH的檢測(cè) 采用ELISA法,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,測(cè)定各組血清樣品中T3、T4、TSH的含量。

1.2.4 下丘腦促甲狀腺激素釋放激素(TRH)mRNA表達(dá)的檢測(cè) 采用Trizol法提取下丘腦總RNA[16],嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增,實(shí)驗(yàn)中TRH上游引物序列為5′-GCTGGCTCTGG CTTTGAT-3′,下游引物序列為5′-GCCGGACCT GAACATTCT-3′[17],測(cè)定出各組結(jié)果后,以正常組的TRH mRNA表達(dá)水平為100%參照,計(jì)算并得出其余各組的TRH mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 甲狀腺病理學(xué)組織檢查 將甲狀腺組織常規(guī)切片,HE染色,顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠血清 T3、T4、TSH水平

甲狀腺是調(diào)節(jié)機(jī)體生命活動(dòng)的重要內(nèi)分泌腺體,甲狀腺能夠分泌甲狀腺激素(T3、T4)來(lái)促進(jìn)機(jī)體的物質(zhì)代謝和能量代謝。甲狀腺功能受上游下丘腦和垂體的調(diào)節(jié),下丘腦釋放TRH并作用于垂體促進(jìn)分泌促甲狀腺素(TSH),TSH進(jìn)一步作用于甲狀腺促進(jìn)甲狀腺激素的釋放,同時(shí)機(jī)體血液中甲狀腺激素濃度的升高可以通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)抑制下丘腦TRH和垂體TSH的分泌,構(gòu)成下丘腦-垂體-甲狀腺軸的自發(fā)性控制回路[18-19]。當(dāng)出現(xiàn)腎陽(yáng)虛時(shí),下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能受到影響從而導(dǎo)致相關(guān)激素的含量發(fā)生變化。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),腎陽(yáng)虛模型組大鼠血清T3、T4水平均較正常組極顯著降低(p<0.01),血清TSH水平有極顯著升高(p<0.01)。研究結(jié)果與翟旭峰等[12]的報(bào)道一致。與腎陽(yáng)虛模型組相比,牡蠣肽(300和150 mg/kg)在不同程度上提升了大鼠血清T3、T4水平、降低血清TSH水平(p<0.05)。各激素水平變化幅度與牡蠣肽灌胃劑量呈正相關(guān)(見(jiàn)圖1、圖2和圖3)。研究結(jié)果表明,牡蠣肽(300和150 mg/kg)明顯改善腎陽(yáng)虛模型大鼠血清激素水平。

圖1 牡蠣肽對(duì)大鼠血清T3的影響Fig.1 Effect of oyster peptide on serum T3 level注:與正常組相比,**表示差異極顯著p<0.01; 與模型組相比,Δ表示差異顯著p<0.05, ΔΔ表示差異極顯著p<0.01;圖2～圖4同。

圖2 牡蠣肽對(duì)大鼠血清T4的影響Fig.2 Effect of oyster peptide on serum T4 level

圖3 牡蠣肽對(duì)大鼠血清TSH的影響Fig.3 Effect of oyster peptide on serum TSH level

2.2 大鼠下丘腦TRH mRNA表達(dá)

下丘腦所分泌的TRH是下丘腦合成及分泌的一種下丘腦激素,它可以促進(jìn)垂體TSH的合成與分泌。同時(shí),TRH的合成也受血液中甲狀腺激素的調(diào)節(jié)。TRH在丘腦-垂體-甲狀腺軸介導(dǎo)的腎陽(yáng)虛病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用,發(fā)生腎陽(yáng)虛時(shí)下丘腦TRH水平降低。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組相比,腎陽(yáng)虛模型組大鼠下丘腦TRH mRNA表達(dá)極顯著降低(p<0.01)。與閔友江等[17]的研究結(jié)果一致，與腎陽(yáng)虛模型組相比,牡蠣肽組(300和150 mg/kg)大鼠下丘腦TRH mRNA表達(dá)水平有顯著性增加(p<0.05),且表現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系(見(jiàn)圖4)。研究結(jié)果表明,牡蠣肽(300和150 mg/kg)對(duì)腎陽(yáng)虛模型大鼠下丘腦TRH mRNA表達(dá)有明顯改善作用。

圖4 牡蠣肽對(duì)大鼠下丘腦TRH mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of oyster peptide on hypothalamus TRH mRNA express

2.3 大鼠甲狀腺病理變化

由圖5可見(jiàn),正常組動(dòng)物甲狀腺病理組顯示,實(shí)質(zhì)內(nèi)為大量甲狀腺濾泡,濾泡壁由單層上皮圍成,形成雙層壁,少量的間質(zhì)(圖5A)。腎陽(yáng)虛模型組動(dòng)物甲狀腺組織中甲狀腺數(shù)量減少,且濾泡變得不清晰,充滿膠質(zhì),且數(shù)量也有所減少,濾泡大小不等,大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5B)。與模型組比較,牡蠣肽(300 mg/kg)組動(dòng)物甲狀腺細(xì)胞數(shù)量有所增加,濾泡結(jié)構(gòu)正常,界限較為整齊,與正常組較為接近(圖5C)。牡蠣肽其他組動(dòng)物甲狀腺病變與模型組比較未見(jiàn)明顯改善。研究結(jié)果說(shuō)明300 mg/kg劑量的牡蠣肽對(duì)改善甲狀腺的病變有明顯保護(hù)作用。

圖5 各組動(dòng)物甲狀腺組織形態(tài)學(xué)觀察Fig.5 Histological observation of thyroid tissue

3 結(jié)論

腎陽(yáng)虛證的主要發(fā)病環(huán)節(jié)為下丘腦功能紊亂,下丘腦-垂體-甲狀腺軸異常引起的一系類表現(xiàn)和腎陽(yáng)虛證類似,因此甲狀腺軸的各激素水平可以間接反映腎陽(yáng)虛證的狀態(tài)。本次實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)肌肉注射氫化可的松建立腎陽(yáng)虛模型,并觀察牡蠣肽的干預(yù)作用。由牡蠣肽各組的激素水平變化和可以看出,牡蠣肽可顯著改善腎陽(yáng)虛大鼠異常的T3、T4及TSH含量,并促進(jìn)下丘腦TRH mRNA的表達(dá),對(duì)甲狀腺組織也有較好的保護(hù)作用,且本次實(shí)驗(yàn)中以300 mg/kg的劑量效果最好。本次實(shí)驗(yàn)說(shuō)明牡蠣肽可改善腎陽(yáng)虛模型大鼠的血清激素水平及下丘腦TRH mRNA的表達(dá),可預(yù)防甲狀腺病理變化,對(duì)改善腎陽(yáng)虛證有明顯的效果;其效果與調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-甲狀腺軸的內(nèi)分泌功能有關(guān),且在基因表達(dá)的水平上參與了調(diào)節(jié)。