吳 迪,劉平平,李 萌,*,王昌濤,2,趙 丹,張佳嬋

(1.北京工商大學(xué)理學(xué)院，北京市植物資源研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100048; 2.北京工商大學(xué)，北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100048)

葛根(PuerariaDC.)又名葛藤、葛麻葉、甜葛藤、粉葛藤等[1]。葛根含有的活性成分為總黃酮,另外還含有少量的生物堿等。其中,葛根總黃酮中含有的異黃酮成分,是葛根的主要活性成分[2-4]。研究表明,葛根異黃酮是一種天然的抗氧化劑,具有較強(qiáng)的抗氧化作用[5]。此外,葛根素具有較強(qiáng)的抗缺氧和抗氧化作用[6]。西方的一些發(fā)達(dá)國(guó)家多在葛根素的提取及藥效方面進(jìn)行研究,著重研究葛根黃酮的體內(nèi)體外抗氧化活性和雌激素效應(yīng)[7]。葛根的藥理作用主要有:對(duì)肝臟的保護(hù)作用、對(duì)基因表達(dá)的影響、抗氧化作用、輻射防護(hù)作用[8]。

在葛根的研究中,對(duì)其進(jìn)行微生物發(fā)酵并對(duì)其進(jìn)行抗衰老功效評(píng)價(jià)較少,故本實(shí)驗(yàn)主要利用微生物發(fā)酵法對(duì)葛根中的有效成分進(jìn)行提取,并與葛根水提液一同進(jìn)行抗氧化及抗衰老功效測(cè)定,從而評(píng)價(jià)葛根水提液及葛根發(fā)酵液是否有潛在的抗衰老功效,為其在食品藥品中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粉葛片 云南白藥集團(tuán)股份有限公司中藥飲片分公司;人皮膚成纖維細(xì)胞 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心;黃酒酵母 北京市食品釀造研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)、胰酶(0.25% EDTA) 美國(guó)Sigma Aldrich公司;DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、青霉素(1×105U/L)、鏈霉素(100 mg/L) 美國(guó)Gibco公司;人Ⅰ型膠原(COLI)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司;人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1)酶聯(lián)免疫試劑盒 美國(guó)CUSABIO公司;MTT 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司;其余無(wú)機(jī)試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

BS2202S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;DSHZ-300恒溫水浴振蕩器 江蘇省太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;CO2恒溫培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司;高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;Multiskan酶標(biāo)儀 賽默費(fèi)世爾(上海)儀器有限公司;UV-1240 紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;YJ-2450醫(yī)用超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葛根水提液及葛根發(fā)酵液的制備 葛根水提液的制備:選用50目葛根粉20 g,按照料液比為1∶15 (g/mL,下同)加入去離子水300 mL,70 ℃水浴搖床中提取3 h,冷卻后4900 r/min離心10 min,取上清液待測(cè),過(guò)膜備用;葛根發(fā)酵液的制備:選用50目葛根粉20 g,按照料液比為1∶15,加入去離子水,高溫高壓滅菌后,接入5%的黃酒酵母擴(kuò)培菌液,置于培養(yǎng)箱中28 ℃,180 r/min培養(yǎng)48 h,再次滅菌冷卻后4000 r/min離心10 min,取上清液,過(guò)膜備用。

1.2.2 主要活性成分的測(cè)定 吸取1 mL的葛根水提液及發(fā)酵液,分別測(cè)定其黃酮含量及總糖含量。

1.2.2.1 黃酮含量測(cè)定 按照硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[25]測(cè)定。稱(chēng)取5 mg干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,用少量60%的乙醇攪拌溶解,后轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中并定容,搖勻,得到濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于六支10 mL比色管中,各加入30%乙醇溶液使比色管內(nèi)均達(dá)到5 mL。后各取出1 mL于試管中,精確加入5% NaNO2溶液0.3 mL,搖勻放置6 min后,加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,搖勻放置6 min。隨后加入4 mL濃度為1 mol/L的NaOH溶液,加水0.4 mL,搖勻放置15 min,以第1管為空白于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,以吸光度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品含量作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣品測(cè)定時(shí),取葛根水提液、葛根發(fā)酵液2 mL,加入30%乙醇溶液使比色管內(nèi)達(dá)到5 mL,取1 mL樣品加入0.3 mL 5% NaNO2溶液,搖勻放置6 min后,加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,搖勻放置6 min。加入4 mL濃度為1 mol/L的NaOH溶液,加水0.4 mL,搖勻放置15 min,在510 nm下測(cè)定吸光度,用溶劑作為空白。所得黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.3715x+0.0039(R2=0.99976)。

黃酮得率(%)=發(fā)酵液中黃酮含量×水提液(發(fā)酵液)體積×100/葛根粉質(zhì)量

式(1)

1.2.2.2 總糖含量測(cè)定 按照苯酚-硫酸法[26]測(cè)定。準(zhǔn)確稱(chēng)取無(wú)水葡萄糖100 mg于100 mL容量瓶中,用蒸餾水定容,得到1 mg/mL葡萄糖溶液。苯酚10 g加水190 mL得5%苯酚溶液于棕色瓶中。量取1 mg/mL葡萄糖溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于50 mL容量瓶中定容,準(zhǔn)確吸取該系列溶液各2 mL,分別置于試管中,進(jìn)行比色反應(yīng)。取稀釋200倍的葛根水提液、葛根發(fā)酵液2 mL于試管中,以2.0 mL去離子水做空白對(duì)照,加1 mL 5%苯酚溶液混勻。加入5.0 mL濃硫酸,混勻5 min后,沸水浴1 h。取出冷卻后至室溫,在490 nm處測(cè)吸光度。所得總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=12.277x+0.0143(R2=0.998)。

總糖得率(%)=發(fā)酵液中總糖含量×水提液(發(fā)酵液)體積×100/葛根粉質(zhì)量

式(2)

1.2.3 對(duì)DPPH自由基清除作用的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[27-28]中的方法。將提取液與發(fā)酵液用去離子水稀釋五個(gè)梯度作為待測(cè)液,取等體積的待測(cè)液與2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻?yàn)锳1管;取等體積的無(wú)水乙醇與2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻?yàn)锳2管;取等體積的無(wú)水乙醇與待測(cè)液混勻?yàn)锳3管。反應(yīng)30 min后,在517 nm下利用測(cè)A1、A2、A3管吸光度。DPPH自由基清除率計(jì)算公式[29-33]如下。

清除率(%)=[(A2+A3)-A1]×100/A2

式(3)

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中,以0.05 g/100 mL胰酶消化傳代。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng),37 ℃5% CO2培養(yǎng)12 h。

1.2.5 細(xì)胞活力的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[34]的方法,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人皮膚成纖維細(xì)胞以0.05%胰酶消化、細(xì)胞培養(yǎng)液制備成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度為1×105/mL,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔100 μL,過(guò)夜后,每孔加入100 μL含不同質(zhì)量濃度樣品溶液或無(wú)樣品DMEM培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)設(shè)置調(diào)零組(DMEM)、細(xì)胞對(duì)照組(細(xì)胞+DMEM)、樣品組(細(xì)胞+不同濃度樣品溶液)。樣品組葛根水提液、葛根發(fā)酵液的樣品溶液終質(zhì)量濃度均設(shè)定為0.06、0.18、0.53、1.67、5 mg/mL,每組5個(gè)平行孔。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24、48、72 h。常規(guī)方法加入5 mg/mL噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)溶液與DMEM培養(yǎng)液混合溶液(體積比1∶5)100 μL處理4 h,150 μL二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)溶解,37 ℃孵育10 min,測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處吸光度。細(xì)胞活力按下式計(jì)算。

式(4)

1.2.6 人皮膚成纖維過(guò)氧化氫酶活力的測(cè)定 按照過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣品測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制:取0.0、12.5、25.0、50.0、75.0 μL新鮮配制的5 mmol/L H2O2溶液,分別加入過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液至最終體積為100 μL。分別取4 μL,加入96孔板的孔內(nèi)。加入200 μL顯色工作液。25 ℃孵育15 min,測(cè)定520 nm波長(zhǎng)處吸光度A,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=39.631x-0.0003,R2=0.99845。分別取3 μL經(jīng)葛根水提液、葛根發(fā)酵液樣品處理24 h的細(xì)胞裂解液(蛋白濃度已測(cè)定),添加過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液至體積為40 μL,混勻。再加入10 μL 250 mmol/L H2O2溶液,用移液器迅速混勻。反應(yīng) 3 min后,加入450 μL過(guò)氧化氫酶反應(yīng)終止液,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算殘余H2O2濃度。換一潔凈離心管,加入40 μL過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液,再加入10 μL已終止并混勻的上述反應(yīng)體系,混勻。25 ℃孵育15 min后,測(cè)定520 nm波長(zhǎng)處吸光度A,計(jì)算過(guò)氧化氫酶活力。

消耗過(guò)氧化氫(μmol/L)=空白對(duì)照殘余過(guò)氧化氫-樣品殘余過(guò)氧化氫

過(guò)氧化氫酶活力(U/mg蛋白)=[消耗過(guò)氧化氫×稀釋倍數(shù)]/[(反應(yīng)時(shí)間)×(樣品體積)×(蛋白濃度)]

1.2.7 人皮膚成纖維谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)活力的測(cè)定 按照谷胱甘肽過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣品測(cè)定。依次配制10 mmol/L NADPH溶液、84 mmol/L GSH溶液、GPx檢測(cè)工作液、過(guò)氧化物試劑溶液,均溫育到25 ℃。設(shè)定空白對(duì)照組(GPx檢測(cè)緩沖液186 μL+GPx檢測(cè)工作液10 μL+過(guò)氧化物試劑溶液4 μL)、樣品本底對(duì)照組(Gpx檢測(cè)緩沖液180 μL+GPx檢測(cè)工作液10 μL+待測(cè)樣品10 μL)、樣品組(GPx檢測(cè)緩沖液176 μL+GPx檢測(cè)工作液10 μL+待測(cè)樣品10 μL+過(guò)氧化物試劑溶液4 μL)。依次加入檢測(cè)緩沖液、待測(cè)樣品和檢測(cè)工作液,混勻,加入過(guò)氧化物試劑溶液4 μL,反應(yīng)開(kāi)始。保持測(cè)定溫度為25 ℃,每隔30 s,使用酶標(biāo)儀測(cè)定A340,共測(cè)6次。根據(jù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶酶活力單位的定義測(cè)定GPx活力。

檢測(cè)體系中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力=(A340/樣品反應(yīng)時(shí)間-A340/空白反應(yīng)時(shí)間)/0.00622

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力(mU/mg蛋白)=檢測(cè)體系重谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力×稀釋倍數(shù)/樣品中蛋白濃度(U/mg)

1.2.8 人皮膚成纖維細(xì)胞I型膠原(Collagen I)含量的測(cè)定 按照人I型膠原酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣品測(cè)定。葛根水提液、葛根發(fā)酵液樣品溶液在3個(gè)質(zhì)量濃度(0.06、0.53、5.00 mg/mL)條件下處理人皮膚成纖維細(xì)胞24 h后,取細(xì)胞培養(yǎng)液上清液,于2～8 ℃、1000×g離心15 min,取上清液立即進(jìn)行測(cè)定。在預(yù)先包被了抗體的酶標(biāo)孔中加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品,在加入辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的識(shí)別抗原,在37 ℃條件下孵育1 h,兩者與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合形成免疫復(fù)合物,經(jīng)PBST洗滌后,結(jié)合的HRP催化四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)成藍(lán)色,隨后在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色,在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。同時(shí),測(cè)定出膠原標(biāo)準(zhǔn)品的OD值,并以O(shè)D值為縱坐標(biāo),膠原濃度為橫坐標(biāo),用Curve Expert1.4擬合出膠原含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) y=a/(1+be-cx)(a=-2.546,b=-2.518,c=-3.478),并由所測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液的OD值計(jì)算出樣品中所含膠原含量。

1.2.9 人皮膚成纖維細(xì)胞MMP-1含量的測(cè)定 按照MMP-1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行樣品測(cè)定。葛根水提液、葛根發(fā)酵液在5個(gè)質(zhì)量濃度條件下(0.06、0.18、0.53、1.67、5 mg/mL)處理人皮膚成纖維細(xì)胞24 h后,取細(xì)胞培養(yǎng)液上清液,于2～8 ℃、1000×g離心15 min,取上清液立即進(jìn)行測(cè)定。在包被有純化MMP-1抗體的微孔板中,依次加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗MMP-1抗體、HRP標(biāo)記的親和素,經(jīng)徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的作用下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。顏色的深淺與樣品中MMP-1含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)計(jì)算樣品刺激后MMP-1含量,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=a/(1+be-cx)(a=1.111,b=2.436,c=1.134)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,兩兩比較采用t檢驗(yàn),以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,所得結(jié)果以x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根水提液(PWE)、葛根發(fā)酵液(PFB)中活性成分測(cè)定結(jié)果

表1為葛根水提液及葛根發(fā)酵液中黃酮、總糖含量測(cè)定結(jié)果。表1顯示,葛根水提物、葛根發(fā)酵液中均含有豐富的黃酮、糖類(lèi)。其中,葛根水提液中,黃酮得率為5.25%,含量為(3.47±0.23) mg/mL,總糖的得率為5.19%,含量為(3.46±0.18) mg/mL。葛根發(fā)酵液中,黃酮得率為7.20%,含量為(4.80±0.32) mg/mL,總糖的得率為3.78%,含量為(2.52±0.50) mg/mL。說(shuō)明與葛根水提液相比,葛根發(fā)酵液中的黃酮含量較高,其總糖含量相對(duì)較低。

表1 葛根水提液及葛根發(fā)酵液中黃酮、總糖含量Table 1 Content of flavonoids,total sugar in PWE,PFB

2.2 PWE、PFB對(duì)DPPH自由基的清除作用

葛根的水提液和葛根發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基的清除作用見(jiàn)圖1。從圖1可知,在質(zhì)量濃度為2.67～4.44 mg/mL,相同質(zhì)量濃度下葛根發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基的清除率高于葛根水提液。在質(zhì)量濃度在4.44～13.3 mg/mL間,兩者差異并不顯著。通過(guò)數(shù)據(jù)計(jì)算得出,葛根水提液清除DPPH自由基的IC50為3.51 mg/mL。葛根發(fā)酵液清除DPPH自由基的IC50為2.98 mg/mL。說(shuō)明葛根發(fā)酵液在較低濃度即可清除50%的DPPH自由基,葛根水提液所需濃度較高。

圖1 葛根水提液、葛根發(fā)酵液清除DPPH自由基的能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity of PWE and PFB

2.3 PWE、PFB對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞活力的影響

通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)探究不同濃度的葛根提取液對(duì)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2～圖3。由圖可知,葛根水提液及葛根發(fā)酵液均未表現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性,細(xì)胞活力均在85%以上。相同質(zhì)量濃度下,樣品的作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響,因此本實(shí)驗(yàn)選用樣品作用時(shí)間為24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)選擇了三個(gè)濃度,分別為5 mg/mL(高劑量組)、0.53 mg/mL(中劑量組)、0.06 mg/mL(低劑量組)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同質(zhì)量濃度的葛根水提液對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of different concentrations of PWE on cell viability of human skin fibroblasts

圖3 不同質(zhì)量濃度的葛根發(fā)酵液對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effect of different concentrations of PFB on cell viability of human skin fibroblasts

2.4 PWB、PFB對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞過(guò)氧化氫酶的影響

圖4為葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)細(xì)胞中過(guò)氧化氫酶活力的影響。由圖4可知,在質(zhì)量濃度為0.53、5 mg/mL時(shí),經(jīng)葛根水提液及葛根發(fā)酵液處理后的細(xì)胞可以極顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶的酶活力(p<0.01)。質(zhì)量濃度為0.06 mg/mL時(shí),作用不顯著(p>0.05)。相同質(zhì)量濃度的兩種樣品對(duì)細(xì)胞中過(guò)氧化氫酶活力影響不顯著(p>0.05)。由此說(shuō)明葛根水提液及發(fā)酵液能夠增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶酶活力,氧化氫酶是機(jī)體內(nèi)反應(yīng)細(xì)胞氧化水平的重要標(biāo)志性酶之一,其主要作用是催化體內(nèi)的過(guò)氧化氫分解成氧氣和水,從而避免過(guò)量的H2O2與O2在鐵螯合物的作用下生成對(duì)細(xì)胞有害的羥基[35]。宋菲等人[36]經(jīng)過(guò)研究證實(shí),天然椰子油提取物可通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性,進(jìn)而對(duì) H2O2引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷起到一定的保護(hù)作用。衰老自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為,機(jī)體自由基累積引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷在皮膚衰老中發(fā)揮重要作用,氧化應(yīng)激指機(jī)體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除失衡、抗氧化能力降低,自由基產(chǎn)生增多一種狀態(tài),過(guò)度的氧化應(yīng)激產(chǎn)生的過(guò)氧化物會(huì)破壞DNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致生物膜和細(xì)胞核的損傷,引發(fā)細(xì)胞凋亡,是衰老的主要成因之一[37]。由此說(shuō)明,葛根水提液及發(fā)酵液能夠通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶活力,從而加快細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物的分解,達(dá)到抗衰老的功效。

圖4 葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)細(xì)胞中過(guò)氧化氫酶活力的影響Fig.4 Effect on PWE and PFB on catalase activity注:*代表樣品組與細(xì)胞對(duì)照組差異顯著(p<0.05);**代表樣品組與細(xì)胞對(duì)照組差異極顯著(p<0.01);圖5～圖6同。

2.5 PWE、PFB對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力影響

由圖5可知,在質(zhì)量濃度為0.06、0.53 mg/mL時(shí),葛根水提液可以極顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的酶活力(p<0.01),葛根發(fā)酵液處理后的細(xì)胞可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的酶活力(p<0.05),質(zhì)量濃度為5.00 mg/mL時(shí),作用不顯著(p>0.05)。不同樣品下相同質(zhì)量濃度的樣品對(duì)細(xì)胞中細(xì)胞谷胱甘肽過(guò)氧化物酶酶活力的影響差異不顯著(p>0.05),葛根水提液及發(fā)酵液均在質(zhì)量濃度為0.53 mg/mL時(shí),增加谷胱甘肽過(guò)氧化物酶酶活力作用更為顯著。由此說(shuō)明,葛根水提液及發(fā)酵液能夠增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的酶活力,谷胱甘肽過(guò)氧化物酶[38]是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶,特異的催化還原型谷胱甘肽對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。馮冰等人[39]實(shí)驗(yàn)證明,過(guò)氧化氫誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞氧化損傷后,EGCG能夠有效降低細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶降低,同時(shí)EGCG可將其作為植物提取物防護(hù)細(xì)胞損傷研究的陽(yáng)性對(duì)照。由此說(shuō)明,葛根水提液、葛根發(fā)酵液能夠通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的酶活力,從而增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)清除過(guò)氧化物的能力,達(dá)到抗衰老的效果。

圖5 葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)細(xì)胞中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力的影響Fig.5 Effect on PWE and PFB on GSH-Px activity

2.6 PWE、PFB對(duì)細(xì)胞中MMP-1含量、Ⅰ型膠原含量的影響

由圖6A可知,葛根水提液質(zhì)量濃度為0.06、5 mg/mL，可以顯著降低人皮膚成纖維細(xì)胞中MMP-1含量(p<0.05),葛根發(fā)酵液作用下的MMP-1減少率較葛根水提液更高,作用極為顯著(p<0.01)，葛根水提液質(zhì)量濃度為0.53 mg/mL時(shí),作用不顯著。由圖6B可知,在質(zhì)量濃度為0.06、5 mg/mL時(shí),葛根水提液可以顯著增加人皮膚成纖維細(xì)胞中Ⅰ型膠原的含量(p<0.05),當(dāng)質(zhì)量濃度為0.53 mg/mL時(shí),作用不顯著(p>0.05)。另外，葛根發(fā)酵液作用下的細(xì)胞Ⅰ型膠原的增加率較葛根水提液更高,作用極為顯著(p<0.01)。濃度為0.06 mg/mL的葛根發(fā)酵液與葛根水提液增加量最多,分別為(26.67±2.10) ng/mL、(21.47±1.66) ng/mL,分別是細(xì)胞對(duì)照組的2.5倍、2倍(細(xì)胞對(duì)照組為(10.79±0.98) ng/mL)。生化實(shí)驗(yàn)中,葛根發(fā)酵液相比于葛根水提液,清除DPPH自由基的作用更為顯著。而在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,葛根發(fā)酵液比葛根水提液均能夠增加細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白的含量。此差異很有可能是因體外抗氧化實(shí)驗(yàn)機(jī)理與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物及相關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)理不同,所以結(jié)果上有差異。

圖6 葛根水提液、葛根發(fā)酵液對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞MMP-1(A)和I型膠原蛋白含量(B)的影響Fig.6 Effect of PWE,PFB on MMP-1(A) and COL I(B)contents

3 結(jié)論

本研究的結(jié)果表明,葛根發(fā)酵液中的黃酮含量高于葛根水提液,葛根水提液的總糖在一定程度上高于葛根發(fā)酵液。葛根發(fā)酵液能有效清除DPPH自由基,且清除率基本保持在50%及以上,作用較為明顯,可初步表明葛根發(fā)酵液具有一定的抗氧化活性。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同濃度的葛根水提液及葛根發(fā)酵液能夠不同程度上保持較高的細(xì)胞活力,均為表現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性,細(xì)胞活力均在85%以上;此外,與對(duì)照組相比,葛根水提液及葛根發(fā)酵液處理后的細(xì)胞可以極顯著增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫酶酶活力(p<0.01)、谷胱甘肽酶酶活力(p<0.01),不同樣品下相同質(zhì)量濃度的樣品差異明顯,由此說(shuō)明葛根水提液及發(fā)酵液均能夠在一定程度上減少過(guò)氧化物對(duì)細(xì)胞的損傷,達(dá)到抗衰老的效果。與對(duì)照組相比,在質(zhì)量濃度為0.06、5 mg/mL時(shí),葛根水提液及葛根發(fā)酵液處理后的細(xì)胞可以顯著減少M(fèi)MP-1的含量(p<0.05),增加細(xì)胞中Ⅰ型膠原的含量(p<0.05),不同樣品下相同質(zhì)量濃度的樣品差異明顯。葛根發(fā)酵液相較于葛根水提液,抗氧化及抗衰老作用更為明顯。綜上所述,葛根水提液及葛根發(fā)酵液均具有不同程度的抗氧化功效和抗衰老功效。