慕星星,石繼鵬,王鋮博,趙 瀾,趙海紅,張 繼,2,*

(1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730070; 2.甘肅省特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心,甘肅蘭州 730070)

元素硒(Se)有顯著的抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等多種生理活性功能,但無機硒存在毒性大、吸收差、穩(wěn)定性低等缺點,而有機硒化物因其能有效避免無機硒易引起中毒的缺點,受到醫(yī)藥、食品保健等諸多領(lǐng)域普遍關(guān)注[1-2]。硒多糖作為有機硒化物的一種,由于天然資源緊缺、提取不方便等原因很少被開發(fā)利用,因此對植物多糖進(jìn)行硒化修飾是解決該問題的有效途徑。目前已成功合成了百合、南瓜、大蒜、靈芝等植物硒多糖[3-4]。

蕨麻多糖(PAP)統(tǒng)藏藥蕨麻中提取分離的天然高分子化合物,已有研究證實蕨麻多糖具有保護(hù)肝臟、抗氧化、增強免疫系統(tǒng)、保護(hù)心肌細(xì)胞、抗缺氧等方面等生理活性[5-7],而蕨麻作為一種常用藏藥及滋補佳品,一直以來常被用作壯陽通便的補藥,甚至產(chǎn)區(qū)的居民的普通食品,蕨麻及其多糖的開發(fā)研究受到生產(chǎn)地域的位置及文化經(jīng)濟的限制,因此亟需提高蕨麻多糖的深加工與利用水平。

本實驗以課題組前期分離純化的蕨麻多糖為原料[8],通過單因素和響應(yīng)面設(shè)計來優(yōu)化工藝,調(diào)控制備因素合成不同取代度的蕨麻硒多糖(SePAP),利用尺寸排除色譜-激光光散射聯(lián)用法、紫外光譜、紅外光譜、熱重分析和掃描電鏡等手段表征產(chǎn)物結(jié)構(gòu),并對其體外抗氧化活性進(jìn)行初步研究,探討不同取代度的硒化修飾對蕨麻多糖結(jié)構(gòu)表征及活性功能的影響,為進(jìn)一步研究SePAP作為抗氧化能力較強的保健食品奠定必要的實驗基礎(chǔ),以促進(jìn)蕨麻資源合理深加工,提高其利用效能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕨麻(PotentillaanserineL.) 產(chǎn)自甘肅甘南;亞硒酸、丙酮、硒標(biāo)準(zhǔn)液、鹽酸羥胺、乙二胺四乙酸二鈉、環(huán)己烷、溴化鉀、DAN試劑、鄰苯三酚、苯酚、水楊酸等 購自蘭州蘊源生物技術(shù)開發(fā)有限公司;固體超強酸 購自寧波蘇博科能環(huán)保科技有限公司;所有藥品或試劑 均為國產(chǎn)分析純或優(yōu)級純。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海一恒科技有限公司;FD-8真空冷凍干燥機 北京松原華興科技發(fā)展有限公司;IRPrestige-21傅里葉紅外光譜儀 上海譜元儀器有限公司;UV-1601紫外可分光光度計 上海禹重實業(yè)有限公司;AFS-9760原子熒光光度計 上海亞榮生化儀器廠;MARS6全自動微波消解儀 北京萊伯泰科儀器有限公司;DE-6300綜合熱分析儀 博元科技有限公司;JSM6390 LV掃描電鏡等 FEI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SePAP的制備及工藝優(yōu)化

1.2.1.1 SePAP的合成 以實驗室現(xiàn)有分離純化后含糖量為99.5%的蕨麻多糖為原料[8],將其在甲酰胺中充分溶解后,加入一定質(zhì)量的硒化劑亞硒酸以調(diào)節(jié)出不同的投料比,再加入一定質(zhì)量的固體超強酸作為催化劑,在N2保護(hù)的條件下設(shè)置一定的溫度和一定的時間下進(jìn)行硒化反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)離心(3000 r/min,5 min)、丙酮洗滌至丙酮無色、透析72 h后冷凍干燥得到SePAP。

1.2.1.2 單因素實驗 根據(jù)上述合成方法,固定條件為反應(yīng)溫度75 ℃、投料比(PAP∶H2SeO3=1∶0.8)、催化劑量40 mg,考察不同反應(yīng)時間(20、40、60、120、300、480 min)對SePAP硒含量的影響;固定條件為反應(yīng)時間120 min、投料比(PAP∶H2SeO3=1∶0.8)、催化劑量40 mg,考察不同反應(yīng)溫度(35、45、55、65、75、85 ℃)對SePAP硒含量的影響;固定條件為反應(yīng)時間120 min、反應(yīng)溫度75 ℃、催化劑量40 mg,考察不同投料比(PAP∶H2SeO3=1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8、1∶0.9、1∶1)對SePAP硒含量的影響;固定條件為反應(yīng)時間120 min、反應(yīng)溫度75 ℃、投料比(PAP∶H2SeO3=1∶0.8),考察不同催化劑量(10、20、30、40、50、60 mg)對SePAP硒含量的影響。

1.2.1.3 響應(yīng)面設(shè)計實驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上,每個因素選取對SePAP硒含量影響較大的三個水平,以SePAP硒含量為響應(yīng)值,設(shè)計四因子三水平的Box-Behnken中心組合實驗,因素水平和編碼見表1,并利用Design-Expert 8.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平和編碼Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

1.2.2 不同取代度SePAP的制備 根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)對取代度影響最大的因素為催化劑量,因此使用不同質(zhì)量梯度的固體超強酸催化劑(10、20、30、40、50 mg),按照1.2.1的硒化方法來制備出五種不同取代度梯度的蕨麻硒多糖,記為SePAP1-5。

1.2.3 不同取代度SePAP硒含量的測定 以熒光分光光度計法[9],使用硒標(biāo)準(zhǔn)液,以硒的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、熒光強度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并建立回歸方程:Y=85.01X+3.4873(R2=0.997)。將測定的熒光強度帶入方程計算硒含量。

1.2.4 不同取代度SePAP的結(jié)構(gòu)表征

1.2.4.1 分子量 使用尺寸排除色譜-激光光散射聯(lián)用儀(SEC-LLS)測定SePAP的重均分子量(Mw)、數(shù)均分子量(Mn)及分子量分散系數(shù)(Mw/Mn)[10]。

1.2.4.2 紫外光譜掃描 各稱取0.1 gPAP和SePAP,于1000 W功率下微波消解20 min后冷卻定容至25 mL,在5 mL消化液和0.1 g/L的H2SeO3中分別加入加8 mL 0.1 g/L鄰苯二胺溶液,置于陰暗處反應(yīng)50 min,各加入10 mL甲苯充分萃取后靜置。取上層溶液以甲苯為參比,用石英比色皿在200～800 nm波長范圍內(nèi)掃描。

1.2.4.3 紅外光譜掃描 在瑪瑙研缽中加入PAP和SePAP各10 mg,混合干燥溴化鉀,充分研磨壓片,在波數(shù)4000～400 cm-1內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描,分析產(chǎn)物的特征基團(tuán)[11]。

1.2.4.4 熱重分析法 使用用熱分析儀,在氧化鋁坩鍋中裝入3 mg樣品,升溫速率10 ℃/min,溫度范圍:50～800 ℃,靜態(tài)空氣氛圍下測定。

1.2.4.5 掃描電鏡觀察 將充分干燥的SePAP用離子濺射鍍膜法制備電鏡樣品,調(diào)節(jié)加速電壓5 kV,放大10～50 KX,置于掃描電鏡的樣品室中掃描分析[12]。

圖1 單因素實驗及結(jié)果Fig.1 Single-factor experiment and results

1.2.5 不同取代度SePAP的活性研究

式(1)

式中:A為未加樣品的空白組吸光度;A1為加入樣品反應(yīng)體系的吸光度。

1.2.5.2 羥自由基(·OH)清除率測定 以水楊酸法測定樣品清除·OH的能力[14]:將樣品SePAP(1～5)用去離子水溶解配置成1 mg/mL的SePAP溶液,以超純水為空白,在試管中加入0.5 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液、SePAP溶液和0.5 mL 5 mmol/L的H2O2,搖勻后靜置10 min,再加入2 mL 10 mmol/L水楊酸溶液搖勻,10 min后于510 nm波長處測定吸光度。根據(jù)式(2)計算:

·OH清除率(%)=(A0-Ai)×100/A0

式(2)

式中:Ai為未加樣品的空白組吸光度;A0為加入樣品反應(yīng)體系的吸光度。

1.2.5.3 DPPH·清除率測定 將樣品SePAP(1～5)用去離子水溶解配置成1 mg/mL的SePAP溶液,在2 mL SePAP溶液中加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液,混勻后避光靜置30 min,于517 nm處測定吸光度Ai,同時用無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液,測得吸光度Aj,再測得2 mL DPPH-乙醇溶液和2 mL無水乙醇混合液的吸光度A0。以無水乙醇為參比,根據(jù)式(3)計算:

DPPH·清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100

式(3)

式中:Ao為DPPH-乙醇溶液+無水乙醇混合液吸光度;Ai為DPPH-乙醇溶液+SePAP溶液吸光度;Aj為無水乙醇溶液+SePAP溶液吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖,Design-Expert 8.05軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析,SPSS 20.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SePAP的制備工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素實驗結(jié)果 當(dāng)反應(yīng)時間小于120 min時,隨著反應(yīng)時間延長,硒含量不斷的增加,當(dāng)超過120 min時硒含量無明顯變化,因此從節(jié)能考慮120 min最佳;當(dāng)溫度低于75 ℃時,隨著反應(yīng)溫度升高,硒含量持續(xù)增加,當(dāng)超過75 ℃時硒含量開始下降,這是由于溫度過高會損壞多糖的結(jié)構(gòu);當(dāng)投料比小于1∶0.8時,隨著投料比增加,硒含量穩(wěn)定增加,當(dāng)超過1∶0.8時硒含量無明顯變化,說明此時H2SeO3對于樣品已趨于飽和;當(dāng)催化劑量小于50 mg時,隨著催化劑的增加,硒含量不斷增加,當(dāng)超過50 mg時硒含量不變,說明50 mg最適宜。

2.1.2 回歸方程擬合及方差分析 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,設(shè)計表1因素水平表,以SePAP硒含量為響應(yīng)值,采用四因子三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行設(shè)計并進(jìn)行實驗,得到實驗結(jié)果(見表2),對結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析,得到二次回歸方程SePAP硒含量Y=8450.60+183.83A+284.00B+18.83C+115.50D+329.50AB-172.00AC-361.00AD+298.50BC-89.50BD-547.50CD-611.22A2-586.47B2-621.72C2-422.97D2,并確定最佳工藝條件為:當(dāng)時間134.84 min,溫度78.39 ℃,投料比(PAP∶H2SeO3=1∶0.81),催化劑量49.37 mg時,SePAP硒含量最高,理論預(yù)測值為8518.81 μg/g。

表2 響應(yīng)面試驗及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

2.1.3 響應(yīng)面圖分析 圖2中響應(yīng)面圖顯示,隨著各因素的增加,SePAP硒含量逐漸增加,當(dāng)達(dá)到一定值時SePAP硒含量逐漸減;等高線圖顯示,AB、AD、BC和CD作用的等高線呈橢圓形,說明兩因素之間存在顯著交互作用,AC和BD作用的等高線近似圓形,說明一個因素在另一個因素的不同水平對SePAP硒含量的影響過程差異不明顯。

圖2 兩因素的交互作用對蕨麻多糖硒含量的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots showing the interactive effects of two factors on the selenium content of SePAP

2.1.4 響應(yīng)面試驗的驗證 為了驗證蕨麻硒多糖制備模型方程的合理性和可靠性,在理論最佳條件下進(jìn)行驗證實驗,重復(fù)三次,SePAP的硒含量平均值為(8572±136) μg/g,實驗值與模型預(yù)測值(8518.81 μg/g)的差值僅占預(yù)測值的0.69%,可見該模型優(yōu)化出的條件參數(shù)可靠有效。

表4 SePAP硒含量Table 4 Selenium content of SePAP

2.2 不同取代度SePAP的硒含量

隨著使用的固體超強酸催化劑質(zhì)量的增加,制備出的SePAP(SePAP1-5)的硒含量也逐漸增高,依次為2761、4278、5990、7890和8375 μg/g,說明催化劑含量是影響SePAP硒取代度的關(guān)鍵性因素。

2.3 不同取代度SePAP的表征

2.3.1 不同取代度SePAP的分子量 由表5所示,樣品的Mw、Mn隨硒含量的增加而降低。這是由于制備過程中SePAP1到SePAP5使用的催化劑固體超強酸越多,反應(yīng)環(huán)境酸性越大,而多糖在酸性環(huán)境中更容易水解所致[16]。

表5 不同取代度SePAP的分子量Table 5 Molecular weight and distribution of SePAP with different substitution degrees

2.3.2 紫外、紅外光譜 如圖3所示,在200～800 nm波長范圍內(nèi)對PAP,SePAP溶液進(jìn)行掃描,發(fā)現(xiàn)SePAP在288和335 nm波長處出現(xiàn)兩個峰,其中288 nm波長處吸收峰是Se-O鍵的吸收峰,334 nm波長處的吸收峰是Se=O特征吸收峰,這與文獻(xiàn)[17]報道中的Se=O特征吸收峰相吻合。與PAP的光譜相比,說明蕨麻多糖硒化成功。

圖3 PAP、SePAP的紫外光譜Fig.3 UV absorption spectra of PAP and SePAP

由圖4可知,蕨麻多糖紅外光譜具有典型的多糖特征吸收峰(3420.21、2931.84、1386.17、1152.33、1025.72、830.6、726.32 cm-1)。3420.21 cm-1處寬峰是O-H的伸縮振動峰,2931.84 cm-1處為C-H伸縮振動吸收峰,1386.17 cm-1吸收峰是O-H彎曲振動,1152.33 cm-1吸收峰是C-H彎曲振動,1025.72 cm-1處為吡喃環(huán)伸縮振動特征峰,830.6 cm-1處是呋喃環(huán)中C-H變角振動峰,726.32 cm-1處是吡喃環(huán)中C-O-C振動吸收峰[18]。

圖4 蕨麻多糖、SePAP的紅外光譜Fig.4 IR spectra of PAP and SePAP

2.3.3 熱重分析 由圖5可知,SePAP(1～5)的TG譜形狀相似,第一個失重峰是失去吸附水,當(dāng)120 ℃

圖5 不同取代度SePAP的熱重分析Fig.5 Thermal analysis of SePAP with different substitution degrees

時,失重量約為10%,因為盡管SePAP在制備后經(jīng)過了冷凍干燥處理,但是仍會吸附一部分水份;320～430 ℃間,SePAP(1～5)出現(xiàn)第二個失重峰,失重量約達(dá)到了50%,此時SePAP自身發(fā)生劇烈的分解反應(yīng);600 ℃以后,失重趨勢減緩,基本達(dá)到恒質(zhì)量;從DTA圖可以看出,整個失重過程都是放熱反應(yīng),伴隨著硒含量的上升,SePAP開始分解的溫度越來越低,說明硒取代度越高的蕨麻多糖的熱穩(wěn)定性越低,可能因為C-O鍵結(jié)合牢固,不易裂解,當(dāng)多糖的羥基被亞硒酸基化后,C-O鍵的電子云向亞硒酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移,增強了Se=O鍵結(jié)合強度,削弱了C-O鍵的結(jié)合力,使亞硒酸基團(tuán)成為容易失去的基團(tuán)[21-22]。失去亞硒酸基團(tuán)引起了多糖的系列分解反應(yīng),從而加快SePAP的裂解。

2.3.4 掃描電鏡 如圖6掃描電鏡圖所示,SePAP呈不規(guī)則的疏松孔隙狀,表面凸凹不平呈顆粒附著狀,并帶有孔洞,可能是由于許多分子或分子集團(tuán)聚集黏結(jié)所致,說明多糖分子間相互存在排斥力,分子間吸引力較為弱小[23];而隨著取代度的增加,顆粒越小結(jié)構(gòu)越松散,這也與其分子量大小的表征相吻合。

圖6 不同取代度SePAP的掃描電鏡圖(×11.60k)Fig.6 SEM pictures of SePAP with different substitution degrees(×11.60k)

2.4 不同取代度的SePAP對和DPPH·的清除作用

圖7 不同取代度SePAP對·OH和DPPH·的清除能力比較Fig.7 Scavenging capacity of SePAP with different substitution degrees against and DPPH free radical

3 結(jié)論