王志華,朱曉雯,何桂霞,王澤建,王永紅,莊英萍,*

(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家生化工程技術(shù)研究中心,上海 200237; 2.上海明錦畜牧養(yǎng)殖有限公司,上海 202150)

光合細(xì)菌(Photosynthetic Bacteria,PSB)是一類以光為能源、能在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用自然界中的有機(jī)物、硫化物等作為供氫體進(jìn)行光合作用的微生物。其擁有合成許多化合物的能力,比如輔酶Q10、維生素B12、5-氨基乙酰丙酸、卟啉、色素等[1-2]。而目前對光合細(xì)菌研究的熱點(diǎn)之一是其強(qiáng)大的水處理能力,獨(dú)特的光能異養(yǎng)特性使其能夠在高濃度的有機(jī)廢水中生存,并最終通過代謝將廢水中的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為水生生物生長所需的養(yǎng)料,達(dá)到凈化水質(zhì),促進(jìn)水體物質(zhì)循環(huán)的目的[3-4]。王國惠[5]從崇明本地土壤中篩選出由深紅紅螺菌、沼澤紅假單胞菌、類球紅細(xì)菌三種光合細(xì)菌組成的優(yōu)勢混合菌群,過往研究表明菌種間的相互作用能夠強(qiáng)化降解過程。目前,光合細(xì)菌處理污水技術(shù)應(yīng)用的一大障礙是光合細(xì)菌生產(chǎn)仍以批培養(yǎng)為主,而將補(bǔ)料技術(shù)用于光合細(xì)菌培養(yǎng)過程鮮有報道,利用先進(jìn)傳感器技術(shù)實(shí)時檢測來指導(dǎo)優(yōu)化過程也是解決這類問題的關(guān)鍵[6]。

氧化還原電位(oxidation reduction potential,ORP)作為反映整體電子轉(zhuǎn)移和胞內(nèi)氧化還原平衡的參數(shù),在一些厭氧或者微好氧發(fā)酵過程中被廣泛應(yīng)用[7-9]。雖然ORP檢測的原理并不復(fù)雜,但是鮮有能夠全面系統(tǒng)地解釋其與微生物代謝之間關(guān)系的報道[10]。pH、溶氧、平衡常數(shù)以及培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的利用與產(chǎn)物的生成,均會造成ORP的變化[11]。

本論文將在線ORP監(jiān)測系統(tǒng)與光合細(xì)菌菌群的生長過程相耦合,并希望能夠優(yōu)化補(bǔ)料工藝,最終達(dá)到提高菌濃,節(jié)約生產(chǎn)成本,為解決此類問題提供一個新的視角的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)以及類球紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)組成的混合菌 上海明錦畜牧養(yǎng)殖有限公司提供;酵母提取物、琥珀酸鈉、檸檬酸鐵、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉、氯化銨、氯化鈣、硫酸鋅、氯化錳、硼酸、氯化鈷、氯化銅、氯化鎳、鉬酸鈉 分析純,凌峰化學(xué)試劑有限公司(上海)。

ZWY-211C恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)柜 智城分析儀器制造有限公司(上海);UV-2102PC紫外可見光分光光度計 菁華科技儀器有限公司(上海);FE20型pH計 梅特勒-托利多儀器;5L發(fā)酵罐 國強(qiáng)生化工程裝備有限公司(上海);TGL-16A 臺式高速離心機(jī) 悅豐儀器儀表有限公司(上海);Agilent 1100 series 高效液相色譜 Agilent 公司(美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 活化培養(yǎng)基:酵母提取物 0.3 g/L、C4H4Na2O42 g/L、FeC6H5O70.005 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.02 g/L、NaCl 0.4 g/L、NH4Cl 0.4 g/L、CaCl20.05 g/L、微量元素SL-6 1 mL/L、瓊脂20 g/L pH6.8、121 ℃滅菌20 min。

生長培養(yǎng)基:酵母提取物 0.3 g/L、C4H4Na2O42 g/L、FeC6H5O70.005 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.02 g/L、NaCl 0.4 g/L、NH4Cl 0.4 g/L、CaCl20.05 g/L、微量元素SL-6 1 mL/L、pH6.8、121 ℃滅菌20 min。

微量元素SL-6:ZnSO4·7H2O 0.1 g/L、MnCl2·4H2O 0.03 g/L、H3BO30.03 g/L、CoCl2·6H2O 0.2 g/L、CuCl·2H2O 0.01 g/L、NiCl2·2H2O 0.02 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.03 g/L。

補(bǔ)料培養(yǎng)基0、補(bǔ)料培養(yǎng)基1、補(bǔ)料培養(yǎng)基2、補(bǔ)料培養(yǎng)基3、補(bǔ)料培養(yǎng)基4、補(bǔ)料培養(yǎng)基5成分分別為:去離子水、C4H4Na2O429 g/L、C4H4Na2O458 g/L、C4H4Na2O487 g/L、C4H4Na2O4116 g/L、C4H4Na2O4145 g/L,pH6.8,于121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 種子液制備 將保存于4 ℃冰箱中的混合菌株取出,涂布于裝有活化培養(yǎng)基的斜面,于28 ℃光源功率40 W培養(yǎng)24 h,連續(xù)培養(yǎng)三代完成活化。用60 mL無菌水將菌懸液從斜面洗脫接入裝有400 mL生長培養(yǎng)基的透明培養(yǎng)瓶中,于28 ℃光源功率40 W培養(yǎng)24 h備用。

1.2.3 光合細(xì)菌菌群批培養(yǎng)的代謝參數(shù)采集 將種子液和生長培養(yǎng)基按1∶4 (V/V)接入5 L發(fā)酵罐中,裝液量為4.5 L。初始pH調(diào)為6.8,轉(zhuǎn)速設(shè)為150 r/min,于28 ℃光源功率40 W培養(yǎng)144 h,每12 h取一次樣,測定OD660、菌體干重、琥珀酸濃度,記錄ORP值。

1.2.4 不同速率的碳源流加對光合細(xì)菌菌群生長的影響 將種子液和生長培養(yǎng)基按1∶4 (V/V)接入5 L發(fā)酵罐中,裝液量為4.5 L。初始pH調(diào)為6.8,轉(zhuǎn)速設(shè)為150 r/min,于28 ℃ 光源功率40 W培養(yǎng)144 h。于60 h開始分別補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基0、補(bǔ)料培養(yǎng)基1、補(bǔ)料培養(yǎng)基2、補(bǔ)料培養(yǎng)基3、補(bǔ)料培養(yǎng)基4、補(bǔ)料培養(yǎng)基5,每小時補(bǔ)入體積為3 mL,即補(bǔ)入琥珀酸鈉流速分別為:0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g·(L·h)-1。每12 h取一次樣,測定OD660、菌體干重、琥珀酸濃度,記錄ORP值。

1.2.5 基于ORP反饋控制的間歇補(bǔ)料培養(yǎng)工藝 將種子液和生長培養(yǎng)基按1∶4 (V/V)接入5 L發(fā)酵罐中,裝液量為4.5 L。初始pH調(diào)為6.8,轉(zhuǎn)速設(shè)為150 r/min,于28 ℃ 光源功率40 W培養(yǎng)144 h。將補(bǔ)料過程與ORP變化相耦合,將ORP開始上升視為補(bǔ)料的起點(diǎn),補(bǔ)入培養(yǎng)基4,每小時補(bǔ)入體積為3 mL,補(bǔ)入速度即0.08 g·(L·h)-1,當(dāng)5 L罐中琥珀酸濃度達(dá)1 g/L時停止。ORP開始上升時再次開啟補(bǔ)料,不斷重復(fù)上述過程,直至培養(yǎng)過程結(jié)束。每6 h取一次樣,測定OD660、菌體干重、琥珀酸濃度,記錄ORP值。

1.3 指標(biāo)的測定與計算

1.3.1 ORP測定 采用ORP電極(EASYFERM PLUS K8 RX 325,Hamilton)進(jìn)行測定。

1.3.2 吸光度(OD660)測定 菌濃由吸光度(OD660)表示,將菌液適當(dāng)稀釋后于波長660 nm處測定吸光值,以空白生長培養(yǎng)基為對照。菌體的光密度值(OD660)=OD660×稀釋倍數(shù)[12]。

1.3.3 菌體干重(DCW)測定 取10 mL培養(yǎng)液10000 r/min離心10 min,用去離子水洗滌菌體兩次,經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾洗滌液后,留菌體,放入烘箱105 ℃烘24 h,稱重[13]。

1.3.4 琥珀酸鈉測定 Agilent 1100 HPLC系統(tǒng),色譜柱:AquaSeq公司C18柱。樣品前處理:取10 mL培養(yǎng)液,7500 r/min 4 ℃離心10 min,取1.5 mL上清液4 ℃ 12000 r/min離心15 min,再取上清液用0.22 μm的膜過濾,濾液于-20 ℃保存待用。流動相:3 mmol H2SO4溶液;流速:0.4 mL/min。進(jìn)樣量:20 μL。柱溫:50 ℃。檢測波長:215 nm[14]。

1.3.5 平均比生長速率的計算 平均比生長速率計算公式:

式(1)

式中:μ:平均比生長速率,1/h;N1:培養(yǎng)結(jié)束時菌濃,g/L;N0:培養(yǎng)前菌濃,g/L;t:培養(yǎng)時間,h。

1.3.6 琥珀酸利用效率的計算 琥珀酸鈉利用效率計算如下:

式(2)

式中:n:琥珀酸利用效率,gDCW/g;S0:培養(yǎng)前琥珀酸鈉濃度,g/L;Sc:過程中補(bǔ)入的琥珀酸鈉濃度,g/L;N1:培養(yǎng)結(jié)束時菌濃,g/L;N0:培養(yǎng)初期菌濃,g/L。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,數(shù)據(jù)采用Origin 2016進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 光合細(xì)菌菌群分批培養(yǎng)的代謝變化

光合細(xì)菌發(fā)酵過程中ORP、OD660以及碳源隨時間變化規(guī)律如圖1所示。0～60 h,ORP值由152 mV降至-167 mV,此時培養(yǎng)環(huán)境由氧化狀態(tài)轉(zhuǎn)為還原狀態(tài)。這與混合菌群均為兼性厭氧混合菌群的好氧生長有關(guān)。60 h后,ORP開始上升,至培養(yǎng)結(jié)束上升至-19 mV。培養(yǎng)前12 h,菌體處于延滯期;12～36 h進(jìn)入快速增長階段,OD660值由0.37增長至1.31。36 h后菌群增長有所減緩,72 h之后菌濃不再上升,維持在1.70～1.80。琥珀酸鈉的最初濃度為1.60 g/L,60 h后濃度僅為0.178 g/L。基于光合菌群各參數(shù)間的相關(guān)性分析,ORP的下降基本與菌體的生長過程耦合,而在菌體生長停滯之后,ORP開始出現(xiàn)回升。根據(jù)主要碳源—琥珀酸鈉的濃度檢測結(jié)果,分析菌群停止快速增長可能是由于碳源不足所致。因此,考慮將表觀參數(shù)—ORP作為描述菌體生長過程中碳源消耗的信號,而其在生長后期的上升可能是碳源不足導(dǎo)致菌體停止增長。

圖1 光合細(xì)菌相關(guān)代謝參數(shù)的變化Fig.1 Changes in metabolic parameters related to photosynthetic bacteria

2.2 不同碳源流加速率對光合細(xì)菌菌群生長的影響

2.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,批次培養(yǎng)至一定階段,ORP不再下降的信號可作為主要碳源不足的預(yù)警。為了延長光合細(xì)菌的生長時間以提高其培養(yǎng)濃度,進(jìn)行了琥珀酸鈉連續(xù)補(bǔ)料實(shí)驗(yàn),以考察不同濃度的琥珀酸鈉對光合細(xì)菌后期生長的影響。5個實(shí)驗(yàn)組中,當(dāng)琥珀酸鈉補(bǔ)入之后,菌體均恢復(fù)了生長(圖2),證明批培養(yǎng)60 h后主要碳源不足是限制光合細(xì)菌進(jìn)一步生長的重要因素。

從圖2中由補(bǔ)加速度的差異導(dǎo)致的不同底物濃度積累對菌體后期生長的影響也具有明顯差異。當(dāng)碳源濃度過低時,菌體的代謝活性會由于所需營養(yǎng)物質(zhì)得不到滿足而受到抑制,導(dǎo)致菌體生長緩慢;當(dāng)碳源濃度過高時,細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓會增大,使酶的活性受到抑制,進(jìn)而影響菌體的生長代謝[15]。如圖2所示,當(dāng)流加琥珀酸鈉的速度為0.02、0.04 g·(L·h)-1時,琥珀酸鈉進(jìn)入發(fā)酵體系后迅速被消耗,僅在發(fā)酵后期有較小濃度的累積。而當(dāng)流加琥珀酸鈉的速度為0.06、0.08和0.10 g·(L·h)-1時,流加開始后,發(fā)酵液中的琥珀酸鈉積累明顯,至培養(yǎng)結(jié)束時,發(fā)酵罐中琥珀酸鈉含量濃度已分別達(dá)2.05、6.58和7.30 g/L。如表1所示,當(dāng)補(bǔ)料濃度為0.08 g·(L·h)-1時,發(fā)酵終點(diǎn),即144 h時,OD660最大,達(dá)3.034,整個培養(yǎng)周期內(nèi)菌體的平均比生長速率最高，為0.018 h-1。

圖2 不同碳源的補(bǔ)加速度流加對光合菌群生長的影響Fig.2 Effect of supplementary acceleration flow of different carbon sources on the growth of PSB注:(a):空白;(b):0.02 g·(L·h)-1;(c):0.04 g·(L·h)-1;(d):0.06 g·(L·h)-1;(e):0.08 g·(L·h)-1;(f):0.10 g·(L·h)-1。

表1 不同補(bǔ)料策略下光合細(xì)菌生長的參數(shù)Table 1 Parameters of PSB cultivation under different feeding strategy

2.3 基于ORP反饋控制的間歇補(bǔ)料培養(yǎng)工藝

當(dāng)補(bǔ)入碳源的流速為0.08 g·(L·h)-1時,發(fā)酵終點(diǎn)可獲得最高的菌群密度。發(fā)酵至60 h時,ORP開始上升,開始啟動補(bǔ)料,直至發(fā)酵液中琥珀酸鈉濃度達(dá)1 g/L左右,補(bǔ)料停止。圖3所示,首階段補(bǔ)料開始時間為60 h,至78 h達(dá)到所設(shè)定閾值。期間琥珀酸的濃度由0.18 g/L上升至1.146 g/L,ORP停止上升恢復(fù)下降趨勢。當(dāng)培養(yǎng)過程進(jìn)行至90 h,ORP上升、OD660停止增長,且琥珀酸濃度已經(jīng)降至0.19 g/L。經(jīng)過首階段補(bǔ)料操作,OD660由1.70升至2.67,ORP由-158 mV降至-290 mV,補(bǔ)入琥珀酸鈉即將耗完。

圖3 基于ORP補(bǔ)料工藝下對光合細(xì)菌代謝參數(shù)Fig.3 Parameters of PSB cultivation under feeding strategy based on ORP value

90 h進(jìn)行第二階段補(bǔ)料操作,于105 h左右到達(dá)設(shè)定的琥珀酸鈉濃度閾值。補(bǔ)入碳源之后,光合細(xì)菌再次恢復(fù)生長,直到126 h。在第二次補(bǔ)料過程中,OD660由2.68增加至3.82,ORP由-290 mV降至-341 mV。同理,進(jìn)入第三次補(bǔ)料階段。第三階段經(jīng)歷時間比較短,因?yàn)榇藭r已經(jīng)接近光合細(xì)菌的生長末期,138 h,ORP不再上升,OD660開始下降,說明菌群已經(jīng)停止生長,最終OD660為4.12。表2可以看出,相比于連續(xù)的底物流加培養(yǎng)(0.08 g·(L·h)-1),基于ORP的補(bǔ)料工藝將平均比生長速率由0.018提升至0.019,生物量提高57%,琥珀酸鈉利用效率從0.119 gDCW/g提高至0.262 gDCW/g。

表2 不同條件下光合細(xì)菌生長參數(shù)Table 2 Growth parameters of PSB under different situation

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將在線ORP技術(shù)用于光合細(xì)菌的補(bǔ)料培養(yǎng)過程,對光合細(xì)菌的補(bǔ)料培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)化。將ORP開始回升作為菌體因缺少碳源而停止生長的信號。分別在在60、90、126 h以0.08 g·(L·h)-1的速度補(bǔ)入琥珀酸鈉,菌體干重由0.60 g/L提高至0.94、1.16 g/L,最后達(dá)1.46 g/L。相對于批培養(yǎng),補(bǔ)料工藝省去了放料、清洗發(fā)酵罐、滅菌、配料等步驟,提高了設(shè)備的利用率。而基于ORP反饋控制的間歇補(bǔ)料培養(yǎng)工藝進(jìn)一步提高生產(chǎn)效率,降低生產(chǎn)成本。