田 原,季子非,郭浩南,馮琳琳,許云賀,張莉力

(錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001)

乳酸菌(LAB)廣泛存在于自然界中,是參與不同類型食品發(fā)酵的主要微生物類群之一。它們以其潛在的健康和營養(yǎng)益處而聞名,因此被認為是“具有益生性能的微生物”或“當攝入足夠量的活的乳酸菌,可賦予宿主健康等益處”[1]。近年來,人們逐漸關(guān)注乳酸菌并了解到其對人體的好處。它們能夠?qū)θ梭w腸道的綜合性疾病有良好的改善和輔助治療作用,尤其對病毒性、過敏性腹瀉和便秘有較佳的療效[2-3]。但是,乳酸菌的菌株種類千差萬別,所以在產(chǎn)酸、耐熱、產(chǎn)生風味物質(zhì)以及胃腸道中的耐受力、黏附腸壁力、臨床效果和對宿主健康等方面的應(yīng)用程度和有益程度上出現(xiàn)天壤之別[4]。大量文獻證明,使用乳酸菌發(fā)酵的產(chǎn)品是可行的、安全的,但是在少量臨床的病例和科學研究中也發(fā)現(xiàn),在部分心內(nèi)膜炎患者、敗血癥、肝膿腫和尿路感染的病人體內(nèi)分離出乳酸菌[5-6],進而乳酸菌的應(yīng)用究竟是否存在安全性問題成為全球關(guān)注的熱點。因此,對食品乳酸菌株進行安全性和益生性評價是非常必要的。

分離于地瓜自然發(fā)酵酸漿中的優(yōu)勢乳酸菌副干酪乳桿菌L1,是來自錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院食品微生物實驗室的自產(chǎn)植物源乳酸菌[7],該菌在高淀粉培養(yǎng)基質(zhì)中快速增殖(在地瓜汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h活菌數(shù)能達到1.79×1012CFU/mL),高效產(chǎn)酸(在地瓜汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,pH下降到3.4左右),具有黏附淀粉,快速沉降地瓜淀粉的作用,用于制作地瓜淀粉絮凝劑,工業(yè)生產(chǎn)地瓜粉絲等[8]。本實驗通過耐藥性實驗、有害代謝產(chǎn)物實驗及動物實驗,確定該株菌是否具有安全性能,通過對外界環(huán)境耐受性、生理功能特性及體外細胞黏附實驗,確定該株菌是否具有益生性能,為副干酪乳桿菌L1應(yīng)用于實際生產(chǎn)生活奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副干酪乳桿菌L1、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌 均來自于錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院食品微生物實驗室;健康昆明SPF雄性小鼠 體重18 g左右,來源于錦州醫(yī)科大學SPF級動物培養(yǎng)中心;Caco-2細胞 錦州醫(yī)科大學生命科學院;葡萄糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉、可溶性淀粉、對二甲氨基苯甲醛、濃鹽酸、95%乙醇、乙醚、硝酸鉀、碘化鉀、溴甲粉紫、液體石蠟、甲苯 天津市風船化學試劑科技有限公司;酵母膏、蛋白胨、瓊脂糖、乳糖 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-酪氨酸、L-鳥氨酸 Sigma公司;Tris base、溶菌酶、硼酸、Na2EDTA·2H2O、溴化乙錠、1 kbp DNA marker、質(zhì)粒提取試劑盒 沈陽天根生化試劑責任有限公司;藥敏紙片 杭州微生物試劑有限公司;胎牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司;0.25%胰酶溶液、雙抗液 Gibco公司;磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、細胞高糖培養(yǎng)液(DMEM) HyClone公司;TritonX-100 合肥博美生物科技有限公司;地瓜汁液體培養(yǎng)基[7-8]用來培養(yǎng)副干酪乳桿菌L1;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、氨基酸脫羧酶實驗培養(yǎng)基、硝酸鹽培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基 為微生物國標配制方法;哥倫比亞血瓊脂平板 無錫賽維商務(wù)有限公司。

HR/T20MM立式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;DYY-4C型電泳儀電源 北京市六一儀器廠;SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;2F-104凝膠成像分析系統(tǒng) 金壇市盛藍儀器制造有限公司;SCAN300型全自動菌落計數(shù)器 Interscience;倒置顯微鏡DP73 Olympus公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱CHP-160常州智博瑞儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 副干酪乳桿菌L1菌液的制備 將副干酪乳桿菌L1接種于預(yù)先配制好并滅菌后的地瓜汁液體培養(yǎng)基中,接種量為10%(v/v),30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,活化三代后待用。

1.2.2 Caco-2細胞培養(yǎng) 配制完全培養(yǎng)基,每10 mL DMEM高糖培養(yǎng)基加2 mL胎牛血清加0.1 mL雙抗液。將凍存的Caco-2細胞從液氮中取出,立即放入37 ℃水浴鍋中快速融化,用無菌移液槍將融化后的細胞懸液2 mL移至15 mL離心管中,向離心管中加入4 mL 37 ℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基,混勻,1000 r/min離心4 min,棄去上清,加入10 mL完全培養(yǎng)基,將混勻后的細胞懸浮液移至細胞培養(yǎng)瓶中,置于95%濕度,5% CO2培養(yǎng)箱,37 ℃下恒溫培養(yǎng)。當細胞貼壁80%左右進行細胞換液,吸出舊的培養(yǎng)基,用無菌PBS清洗一次,加入新的完全培養(yǎng)基,根據(jù)細胞生長狀態(tài),每1～2 d換液一次。當細胞80%～90%匯合時進行細胞傳代,棄去舊的培養(yǎng)基,用無菌PBS清洗兩次,加入1 mL預(yù)熱的0.25%胰酶消化5 min,加入1 mL胎牛血清終止消化,將混合液體倒入離心管,1500 r/min離心4 min,棄去上清液,加入3 mL無菌PBS重復(fù)離心,棄上清,加入完全培養(yǎng)基,吹打混勻細胞,按1∶2的比例傳代培養(yǎng)[9]。

1.2.3 安全性評價

1.2.3.1 藥敏實驗 采用K-B(藥敏紙片瓊脂擴散法),用無菌生理鹽水將副干酪乳桿菌L1稀釋成濃度為1.0×109CFU/mL的菌懸液,取0.1 mL均勻涂布于地瓜汁固體培養(yǎng)基表面(固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基加2%的瓊脂),放置30 min以上待干燥后,用無菌鑷子夾取藥敏紙片平貼在涂好細菌的瓊脂表面,每個平板貼2種藥敏紙片。所用的藥敏紙片分別為:紅霉素、鏈霉素、卡那霉素、萬古霉素、青霉素、諾氟沙星、阿奇霉素和四環(huán)素。將貼好藥敏紙片的平板放置30 min以上,然后倒置平板30 ℃培養(yǎng)48 h,用游標卡尺測量各藥敏紙片的抑菌圈大小[1,10-11]。

1.2.3.2 質(zhì)粒提取實驗 取2 mL活化后的副干酪乳桿菌L1菌懸液,使用質(zhì)粒提取試劑盒和高效溶菌酶,提取L1的質(zhì)粒[12-13]。配制1%濃度的瓊脂糖凝膠,溫度降到55 ℃左右時,加入EB搖勻,制膠板。取5 μL提取液與1 μL 6×Loading buffer混勻,點樣于瓊脂糖凝膠孔道中,電泳液為1×TBE溶液,電壓設(shè)定100 V,電流設(shè)定60 A,工作時間90 min。電泳結(jié)束后,將瓊脂糖凝膠置于圖像記錄分析系統(tǒng)中,在254 nm紫外燈照射下,觀察是否有電泳條帶。

1.2.3.3 氨基酸脫羧酶檢測實驗 在1000 mL蒸餾水中加入蛋白胨5 g,酵母膏3 g,葡萄糖1 g,1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1 mL,調(diào)節(jié)pH為6.8,將酪氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸五種氨基酸分別按0.5%的接種量加入到培養(yǎng)基中,分為五組氨基酸培養(yǎng)基,將活化后的副干酪乳桿菌L1菌懸液按照10%接種量(v/v)分別接入到滅菌后的五組培養(yǎng)基中,制備五組實驗組(培養(yǎng)基加氨基酸接菌)和對照組(培養(yǎng)基不加氨基酸接菌),30 ℃培養(yǎng)24 h和48 h,觀察培養(yǎng)基顏色變化[1,14]。

1.2.3.4 硝酸鹽還原酶檢測實驗 在1000 mL的地瓜汁液體培養(yǎng)基中加入蛋白胨5 g,硝酸鉀0.2 g,加熱溶解,調(diào)節(jié)pH為7.4,配制成硝酸鹽培養(yǎng)基。將活化后的副干酪乳桿菌L1菌懸液按照10%接種量(v/v)接入到滅菌后的硝酸鹽培養(yǎng)基中,制備實驗組(接菌)和對照組(不接菌)。30 ℃培養(yǎng)48 h后,先滴加10滴5%的KI溶液,再滴加10滴5%的淀粉溶液,充分震蕩混勻后觀察培養(yǎng)基顏色變化[15]。

1.2.3.5 吲哚實驗 將活化后的副干酪乳桿菌L1菌懸液按照10%接種量(v/v)接入到滅菌后的蛋白胨水培養(yǎng)基中,制備實驗組(接菌)和對照組(不接菌),30 ℃培養(yǎng)48 h后取出,在培養(yǎng)基中加入2 mL乙醚,充分振蕩,靜置片刻,使乙醚浮于上層液面,此時沿管壁緩慢加入10滴吲哚試劑(切勿搖動),觀察兩層交界處顏色變化[11]。

1.2.3.6 溶血實驗 在無菌條件下,用滅菌的接種環(huán)挑取活化后的副干酪乳桿菌L1菌懸液在血瓊脂平板上劃線,30 ℃倒置培養(yǎng)48 h后,觀察菌落周圍有無溶血圈,拍照記錄反應(yīng)現(xiàn)象。若在菌株菌落周圍的瓊脂顯示綠色,為α-溶血;在菌落周圍出現(xiàn)透明圈,為β-溶血;對溶血無作用或不溶血,為γ-溶血[16-17](用金黃色葡萄球菌作為陽性對照組進行比較)。

1.2.3.7 小鼠急性毒性實驗 將24只小鼠隨機分成實驗組和對照組,每組12只。設(shè)置小鼠環(huán)境溫度22 ℃,濕度60%,每日光照12 h,補足鼠糧和純凈水,適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進行實驗,實驗期間環(huán)境不變。調(diào)整活化后菌液濃度為1.0×1011CFU/mL,實驗組每次灌胃0.2 mL菌懸液,對照組每次灌胃0.2 mL生理鹽水,每天定時灌胃一次。喂養(yǎng)期間保證小鼠自由進食、進水,每天記錄觀察小鼠生命活動特征、體重等生理狀態(tài)。每組隨機選取4只,在喂養(yǎng)第7 d禁食、禁水,第8 d采用頸椎脫臼法處死解剖小鼠[18-19],觀察其心、肝、脾、肺、腎器官變化并稱量臟器質(zhì)量,計算臟器指數(shù),公式如下:

臟器指數(shù)=m1/m2

式(1)

式中:m1為臟器質(zhì)量(g);m2為小鼠體重質(zhì)量(g)。

1.2.3.8 30 d喂養(yǎng)實驗 經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)后的小鼠中,隨機選取實驗組和對照組各4只。飼喂情況同1.2.3.7,延長喂養(yǎng)時間至30 d,每天記錄小鼠生命活動特征和體重狀況。第31 d處死解剖小鼠后,觀察其心、肝、脾、肺、腎器官變化并稱取臟器質(zhì)量,計算臟器指數(shù),公式同1.2.3.7。

1.2.4 益生性評價

1.2.4.1 耐酸性 用稀鹽酸調(diào)整地瓜汁液體培養(yǎng)基的pH至2.0、2.5、3.0、3.5,在115 ℃滅菌30 min后,冷卻備用。以未經(jīng)調(diào)整過的地瓜汁液體培養(yǎng)基(pH約為7.0)作為對照。將副干酪乳桿菌L1活化后轉(zhuǎn)接至以上培養(yǎng)基中,接種量10%(v/v),置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別在0、1、2、3 h處取樣,采用平板菌落計數(shù)法測定樣品中的菌體數(shù)量[17,20]。

1.2.4.2 膽汁鹽耐受性 用0.4% NaOH調(diào)整地瓜汁液體培養(yǎng)基的pH至7.8,在上述培養(yǎng)基中加入牛膽鹽(煮溶20 min完全溶解),配制含有質(zhì)量濃度分別為0.03、0.30、0.50 g/100 mL的地瓜汁液體培養(yǎng)基,在115 ℃下滅菌30 min后備用。以不含牛膽鹽的地瓜汁液體培養(yǎng)基作為對照。將活化后的副干酪乳桿菌L1轉(zhuǎn)接至以上培養(yǎng)基中,接種量10%(v/v),置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別在0、1、2、3、4 h處取樣,采用平板菌落計數(shù)法測定樣品中的菌體數(shù)量[21-22]。

1.2.4.3 耐高鹽評價 配制含有不同濃度NaCl(1、2、3、4、5 g/100 mL)的地瓜汁液體培養(yǎng)基,115 ℃滅菌30 min后備用。以不含NaCl的地瓜汁液體培養(yǎng)基作為對照。將活化后的副干酪乳桿菌L1轉(zhuǎn)接至以上培養(yǎng)基中,接種量10%(v/v),置于30 ℃恒溫培養(yǎng)中,培養(yǎng)24 h取樣,采用平板菌落計數(shù)法測定樣品中的菌體數(shù)量[20]。

1.2.4.4 自聚集性 將活化后的副干酪乳桿菌L1在20 ℃下3000 r/m離心10 min,蒸餾水洗滌2次,再懸浮,用蒸餾水稀釋,調(diào)整OD值在660 nm下為0.3(OD0)。在37 ℃孵育60 min后,再次測量660 nm下的OD值(OD60)[20]。自聚集計算公式:

自聚集(%)=[(OD0-OD60)/OD0]×100

式(2)

1.2.4.5 疏水性 測定細菌對甲苯類化合物的黏附性。取5 mL活化后的副干酪乳桿菌L1菌液在20 ℃下3000 r/min離心15 min,用蒸餾水洗滌兩次,再懸浮于5 mL蒸餾水中,得到約108CFU/mL(OD560,A)。然后將4 mL懸浮液與1.2 mL甲苯接觸。孵育10 min后,渦流2 min,使細菌懸浮液與二甲苯完全混合,水相OD(A0)在560 nm處測定[23]。疏水性計算公式:

H(%)=[(A-A0)/A]×100

式(3)

1.2.4.6 副干酪乳桿菌L1對Caco-2細胞的黏附觀察 將Caco-2細胞接種于帶有細胞爬片的六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),每天換液至細胞鋪滿單層,黏附觀察前最后一次換液換成無雙抗的培養(yǎng)基。將預(yù)先活化好的副干酪乳桿菌L1菌懸液3000 r/m離心5 min,棄上清,無菌PBS洗一次,重復(fù)上述離心,棄上清,加入等量的DMEM制成菌懸液,每孔加入1 mL菌懸液,與Caco-2細胞共培養(yǎng)2 h。取出細胞爬片,用無菌PBS清洗三次,以除去未黏附的細菌,10%甲醛固定30 min,自然風干,結(jié)晶紫染色,顯微鏡下觀察黏附情況,粗略計算每個Caco-2細胞黏附的細菌數(shù)[24]。

1.2.4.7 副干酪乳桿菌L1對Caco-2細胞的黏附計數(shù) 將Caco-2細胞接種于不含細胞爬片的六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),細胞與細菌處理同上。共培養(yǎng)3 h后,棄去液體,用無菌PBS清洗孔板三次,以除去未黏附的細菌。之后每孔加入0.7 mL預(yù)熱后的胰酶作用10 min,待細胞完全脫落,加入0.3 mL含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)。再用TritonX-100裂解細胞5 min,將裂解后的混合液體梯度稀釋,涂布在MRS瓊脂平板上,30 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù),每個梯度3個重復(fù)[1]。黏附率公式:

黏附率(%)=黏附細菌數(shù)/初始細菌數(shù)×100

式(4)

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 副干酪乳桿菌L1安全性評價

2.1.1 耐藥性評價實驗結(jié)果 耐藥性實驗結(jié)果見表1,副干酪乳桿菌L1對常見8種抗生素中的紅霉素和阿奇霉素表現(xiàn)為抗性,對青霉素敏感,其他5種抗生素均不敏感。一些抗生素的試驗表明,乳酸菌不會受到使用這些抗生素治療的影響,并且可能有助于維持抗生素治療過程中腸道菌群的自然平衡[1]。

表1 耐藥性實驗檢測結(jié)果Table 1 The results of resistance test

2.1.2 質(zhì)粒提取實驗結(jié)果 若是乳酸菌的耐藥基因存在于可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒上,就容易導致乳酸菌上的耐藥基因通過水平方式轉(zhuǎn)移到人體基因組上,通過基因表達造成潛在危害[25-26]。瓊脂糖凝膠電泳實驗結(jié)果見圖1,副干酪乳桿菌L1的3個平行樣泳道上面均沒有條帶出現(xiàn),說明副干酪乳桿菌L1沒有質(zhì)粒存在,這就說明該株菌的耐藥基因是存在于乳酸菌自身基因組上,沒有在質(zhì)粒上,因此可初步判斷該株菌是安全菌株。

圖1 質(zhì)粒提取電泳圖Fig.1 Electrophoregram of plasmid extraction注:M:1 kb DNA Marker;1、2、3:副干酪乳桿菌L1。

2.1.3 有害代謝產(chǎn)物實驗結(jié)果 有害代謝產(chǎn)物實驗結(jié)果見圖2。氨基酸脫羧酶實驗中使用的氨基酸為酪氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸,經(jīng)氨基酸脫羧酶作用后脫氨分別形成酪胺、腐胺、尸胺、組胺和精胺。而生物胺過量積累會引起人體副作用,如頭痛、高血壓、惡心和嘔吐等癥狀[27]。在氨基酸脫羧酶活性檢測實驗結(jié)果中,對照組和五組實驗組培養(yǎng)基變渾濁且為黃色,說明該菌在增殖過程中表現(xiàn)為陰性反應(yīng),即副干酪乳桿菌L1不產(chǎn)生氨基酸脫羧酶,對人體無害。

表2 有害代謝產(chǎn)物實驗結(jié)果Table 2 Experimental results of harmful metabolites

硝酸鹽還原酶會催化硝酸鹽還原成亞硝酸鹽,亞硝酸鹽是一種劇毒強致癌物,一旦攝入后會對人體造成嚴重危害[28]。在硝酸鹽還原酶檢測實驗結(jié)果中,對照組培養(yǎng)基無顏色變化,實驗組培養(yǎng)基變渾濁且為淡黃色,說明該菌在增殖過程中表現(xiàn)為陰性反應(yīng),即副干酪乳桿菌L1不產(chǎn)生硝酸鹽還原酶,對人體無害。

色氨酸是人體必須的氨基酸之一,有免疫、促進消化、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成等功能。若菌株分解蛋白質(zhì)中的色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì),會影響機體對色氨酸的吸收[11]。在吲哚實驗結(jié)果中,實驗組培養(yǎng)基變渾濁且乙醚層為無色,說明該菌在增殖過程中表現(xiàn)為陰性反應(yīng),即副干酪乳桿菌L1不產(chǎn)生色氨酸酶,不會影響色氨酸的代謝。

溶血現(xiàn)象是人體內(nèi)一種不正常的現(xiàn)象[29],溶血素生產(chǎn)能力越強,紅血球破壞越嚴重,溶血現(xiàn)象越嚴重,一旦人體被感染,會造成非常嚴重的敗血癥,是乳酸菌安全性評價的重要檢測指標之一。實驗結(jié)果見圖2,副干酪乳桿菌L1在血平板上培養(yǎng)48 h后長出乳白色菌落且沒有溶血圈,屬于沒有毒性的γ-溶血,說明該菌株不是致病菌,且無致病性,而金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出β-溶血。

圖2 溶血實驗檢測結(jié)果Fig.2 The results of hemolysis test注:a:副干酪乳桿菌L1;b:金黃色葡萄球菌。

2.1.4 小鼠急性毒性實驗結(jié)果 動物實驗是檢測食品安全性最直接最有效的方法之一。根據(jù)《食品安全性毒理學評價程序》定義乳酸菌毒理學評價,可先進行第一階段和第二階段毒性實驗,檢測結(jié)果未觀察到的最大有害作用劑量大于等于人體攝入量的100倍[30],并在短期喂養(yǎng)實驗中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的毒性作用,可綜合其他實驗結(jié)果,初步作出安全性評價。小鼠急性毒性實驗期間,灌胃7 d內(nèi),未出現(xiàn)死亡,小鼠生命活動一切正常,飲食和飲水較穩(wěn)定,鼠毛光潔白亮,排泄物狀態(tài)正常,且小鼠體重隨著喂養(yǎng)時間呈現(xiàn)增長趨勢,與對照組相比,無顯著性差異(p>0.05)(見表3)。第8 d解剖后,小鼠的心、肝、脾、肺、腎五種主要器官組織無病變,且通過臟器指數(shù)比較,副干酪乳桿菌L1組和生理鹽水組的臟器指數(shù)無顯著性差異(p>0.05，見表4),說明副干酪乳桿菌L1對小鼠無毒害作用。

表3 動物體重變化(g)Table 3 The weight change of animals(g)

表4 急性毒性實驗臟器指數(shù)結(jié)果Table 4 The index results of acute toxicity organ

2.1.5 30 d喂養(yǎng)實驗結(jié)果 小鼠亞慢性毒性實驗期間,灌胃30 d內(nèi),未出現(xiàn)死亡,小鼠生命活動一切正常,飲食和飲水較穩(wěn)定,鼠毛光潔白亮,排泄物狀態(tài)正常,且小鼠體重隨著喂養(yǎng)時間呈現(xiàn)增長趨勢,與對照組無顯著性差異(p>0.05，見表5)。第31 d解剖后,小鼠的心、肝、脾、肺、腎五種主要器官組織無病變,且通過臟器指數(shù)比較,副干酪乳桿菌L1組和生理鹽水組的臟器指數(shù)無顯著性差異(p>0.05)(見表6),說明副干酪乳桿菌L1對小鼠的生理活動及身體主要器官無有害影響。

表5 動物體重(g)變化Table 5 The weight(g)change of animals

表6 30 d喂養(yǎng)實驗臟器指數(shù)結(jié)果Table 6 The index results of 30 d feeding experiment

2.2 副干酪乳桿菌L1益生性評價

2.2.1 環(huán)境耐受性評價

2.2.1.1 耐酸性實驗結(jié)果 要發(fā)揮乳酸菌的益生性能,在到達腸道之前,乳酸菌首先必須在胃中存活,其中胃酸的分泌構(gòu)成了大部分攝取微生物的主要防御機制。人胃中的pH在禁食期間為1,在餐后為4.5,食物消化可長達3 h[21]。如表7所示,不同酸性環(huán)境下,L1活菌數(shù)的變化趨勢并不相同。在對照組培養(yǎng)基中,初始活菌數(shù)為107CFU/mL,培養(yǎng)1 h后,活菌數(shù)升了一個數(shù)量級,并且在實驗的3 h中,活菌數(shù)在不斷上升。在pH3.5的地瓜汁TJA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h,副干酪乳桿菌L1的活菌數(shù)沒有降低,反而呈上升趨勢，pH為3.5時的上升趨勢大于pH為3.0時的上升趨勢，但二者差異均不顯著(p>0.05),說明副干酪乳桿菌L1的生長對于pH3.5和3.0的酸性環(huán)境幾乎不受影響。

表7 不同酸性環(huán)境下細菌存活數(shù)Table 7 Bacterial survival in different acidic environments

在pH2.5和2.0的環(huán)境下,L1的活菌數(shù)隨著培養(yǎng)時間的增加略有降低,但差異不顯著(p>0.05)?？梢钥闯鲈谂囵B(yǎng)過程中,L1的總體活菌數(shù)始終在107CFU/mL以上,能夠滿足益生菌在人體內(nèi)發(fā)揮作用的濃度要求(一般為106～109CFU/mL)。由以上結(jié)果可見,副干酪乳桿菌L1對人體生理濃度范圍內(nèi)酸性變化有較好的耐受性。

2.2.1.2 膽汁鹽耐受性實驗結(jié)果 為了更好的發(fā)揮益生性能,乳酸菌同樣要有良好的膽鹽耐受性。由于小腸中膽鹽的生理濃度介于5000～20000 μmol/L之間,食物在小腸中停留1～4 h,所以我們最高使用0.5 g/100 mL的膽鹽濃度,相當于12255 μmol/L,并且測定了培養(yǎng)0～4 h的活菌數(shù)[16]。如表8,副干酪乳桿菌L1在對照組培養(yǎng)基中初始數(shù)量為107CFU/mL,培養(yǎng)1 h后,菌體數(shù)量上升了一個數(shù)量級,并且在實驗的4 h中,活菌數(shù)不斷上升。在含有0.03 g/100 mL膽鹽的地瓜汁TJA培養(yǎng)基中,活菌數(shù)有少量的下降,但差異并不顯著(p>0.05),并在培養(yǎng)2 h后有小幅度的上升趨勢。在含0.3、0.5 g/100 mL膽鹽的地瓜汁TJA培養(yǎng)基中作用1 h后,活菌數(shù)略有降低(p>0.05),但培養(yǎng)到3～4 h后,降低趨勢逐漸平穩(wěn)?？梢钥闯鲈谂囵B(yǎng)過程中,L1總體的活菌數(shù)始終在107CFU/mL以上,能夠滿足益生菌在人體內(nèi)發(fā)揮作用的濃度要求(一般為106～109CFU/mL)。由此可見,副干酪乳桿菌L1對人體生理濃度范圍內(nèi)的膽鹽有較好的耐受性。

表8 不同膽鹽濃度下細菌存活數(shù)Table 8 Bacterial viability under different bile salt concentrations

2.2.1.3 耐高鹽實驗 乳酸菌攝入體內(nèi)之后,同樣需要耐受不同程度的滲透壓,從而發(fā)揮有效作用。如圖3,在地瓜汁TJA液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaCl,副干酪乳桿菌L1在其中培養(yǎng)24 h后,活菌數(shù)與不含NaCl的初始數(shù)相比稍有降低(p>0.05),即使在NaCl濃度為5 g/100 mL時存活率仍高達97.2%,總體活菌數(shù)始終保持在1010CFU/mL以上。由此可見,副干酪乳桿菌L1具有較強的耐高鹽能力,在胃腸道的高鹽環(huán)境中能夠有效地消除高滲透壓所帶來的不利影響,維持菌體滲透壓的相對平衡。

圖3 不同鹽濃度下細菌數(shù)Fig.3 The number of bacteria under different salt concentration注:上標小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

2.2.2 生理特性評價 自聚集是生物膜形成的一個重要特性,而乳酸菌生物膜通過保護胃腸道轉(zhuǎn)運中的菌株,產(chǎn)生抗菌化合物和刺激免疫應(yīng)答從而進行腸道定植[16],因此,自聚集性可反映細菌的黏附性能。如表9,在660 nm下,副干酪乳桿菌L1菌懸液孵育1 h的自聚集性為15.8%±1.2%,同樣條件下任大勇[31]測定的陽性對照鼠李糖乳桿菌GG孵育2 h的自聚集性為33%;在Shekh等[16]測定的10株菌中,2株鼠李糖乳桿菌Fb和GG孵育2 h的自聚集性分別為14%和30%,其余8株植物乳桿菌孵育2 h的自聚集性在3%～20%之間,并且隨著孵育時間的增加,自聚集能力會明顯增加。而張俊娟[32]測定的15株乳酸桿菌中,在1～3 h的孵育時間得到自聚集性的平均值為15%～98%,菌株間差異較大。因此可以看出,副干酪乳桿菌L1具有一定的自聚集性,但相對較低。

Perez研究表明,可通過測定菌株疏水性的大小來推斷其黏附能力的高低,疏水性在細菌發(fā)揮黏附作用和自聚集反應(yīng)中均起到重要的作用,即疏水性高的菌株對腸上皮細胞的黏附作用也強,并且這種關(guān)聯(lián)呈現(xiàn)一定的依賴性[33]。如表9,在560 nm下,副干酪乳桿菌L1菌懸液的疏水性為9.7%±0.8%;參考王娉婷[34]測定的陽性對照鼠李糖乳桿菌GG的疏水性24.37%,L1疏水性相對較低;Shekh等[16]測定的10株植物乳桿菌的疏水性為10%～37%,其中LGG疏水性為28%;對比張俊娟[32]測定的15株乳酸菌的疏水性,小于5%的占46.67%、在5%～20%之間的占33.33%、大于20%的占20.00%,可以看出L1具有一定的疏水性,但相對偏低。

表9 不同菌株自聚集性和疏水性比較Table 9 Comparison of self aggregation and hydrophobicity of different strains

細菌的疏水性源于菌體表面的非極性殘基的相對分布,靜電相互作用則與靜電荷有關(guān),自聚集能力也是菌體表面性質(zhì)的一種外在反映[35],因此自聚集性和疏水性高可能對細菌的黏附能力有促進作用,但這只是高黏附性能的初篩指標,并不是黏附能力強的必要條件,所以副干酪乳桿菌L1的黏附能力還需進一步的測定去判斷。

2.2.3 黏附性評價

2.2.3.1 黏附觀察 Caco-2細胞在形態(tài)學上與人小腸上皮細胞相似,經(jīng)培養(yǎng)后可形成極性的單層細胞,常被用于細菌體外黏附實驗[36]。細菌黏附在腸道上皮細胞才能有效的定植于腸道,從而發(fā)揮益生性能。如圖4,在油鏡下觀察副干酪乳桿菌L1黏附到Caco-2細胞的兩個視野,可見每個細胞約黏附30個細菌,而在倒置顯微鏡400倍下只能看見細胞,細菌幾乎觀察不到。參考陳臣[35]測定陽性對照鼠李糖乳桿菌LGG對Caco-2細胞的黏附數(shù)為15,而L1黏附數(shù)約為30,可以看出L1黏附數(shù)高于LGG。

圖4 副干酪乳桿菌L1對Caco-2細胞的黏附(1000×)Fig.4 Adhesion of Lactobacillus caseiL1 to Caco-2 cells(1000×)

2.2.3.2 黏附計數(shù) 經(jīng)平板計數(shù)得出副干酪乳桿菌L1對Caco-2細胞黏附率為22.37%±1.44,參考Yeo等[17]測定的陽性對照鼠李糖乳桿菌LGG的黏附率為5.10%,由張莉[37]測定的LGG對Caco-2的黏附率為4.28%,可以看出L1的黏附率明顯高于LGG。L1能較好的黏附并定植于人體腸道,從而發(fā)揮其益生作用。

3 結(jié)論

通過對副干酪乳桿菌L1的安全性評價可知,該菌在耐藥性檢測實驗中,對常見的8種抗生素中對紅霉素和阿奇霉素表現(xiàn)為抗性,對青霉素表現(xiàn)為敏感,其他均不敏感且不含質(zhì)粒;在有害代謝產(chǎn)物檢測實驗中,實驗結(jié)果均為陰性,且為無毒的γ-溶血;在動物實驗中,體重和臟器指數(shù)均與對照組無顯著性差異(p>0.05),各臟器和生理狀態(tài)也很健康。由益生性評價可知,該菌對外界環(huán)境中的酸性、膽鹽及高滲透壓耐受性良好,也體現(xiàn)了一定的自聚集性和疏水性,對體外Caco-2細胞能有較好的黏附特性。因此,副干酪乳桿菌L1表現(xiàn)了良好的安全性和益生性,為實際生產(chǎn)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。