馬榮鋒,唐 川,汪雯瀚,楊 焱,田小軍,戴亞峰,王升貴,*

(1.九仙尊霍山石斛股份有限公司,上海 201199; 2.農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室,國家食用菌工程技術(shù)研究中心,上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,上海 201403)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseCZ. Tang et S.J. Cheng)與鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)均屬蘭科石斛屬多年生草本植物,具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺止咳、保肝明目等功效,有很高的開發(fā)利用價值[1-2]?；羯绞?又稱“米斛”,其植株矮小,長3～9 cm,莖直立由下向上逐漸變細(xì),呈圓錐狀,形似米粒,花呈淡黃綠色,明顯區(qū)別于鐵皮石斛等其它石斛,具有獨特的地理分布、形態(tài)特征、遺傳結(jié)構(gòu)及藥理活性[2-3]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),霍山石斛及鐵皮石斛中最主要的活性成分是多糖類化合物,在提高免疫力、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、保肝護胃及抗白內(nèi)障等方面具有明顯的藥理作用。前期研究發(fā)現(xiàn),石斛中除多糖外,還含有生物堿、多酚、黃酮(柚皮素)、菲類物質(zhì)(毛蘭素)等小分子成分,不同石斛因含有獨特的化學(xué)物質(zhì)及結(jié)構(gòu),從而表現(xiàn)出不同的藥理作用[4]。

石斛種類較多(80余種),且功效差別很大,傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為霍山石斛是最道地、最為珍貴的石斛品種,但目前,對于藥用石斛之間功能成分及生物活性等比較研究的報道也較少。王雅文等[5]對鐵皮石斛和霍山石斛種甘露糖、葡萄糖及柚皮素的含量比較發(fā)現(xiàn)依據(jù)兩種石斛的總多糖含量、水解后的單糖含量與峰面積比值以及柚皮素含量,無法區(qū)分鐵皮石斛與霍山石斛,需結(jié)合其他專屬性方法方能對兩種石斛進行區(qū)別。在生物活性研究方面,李秀芳[6]對霍山石斛和4種藥典石斛多糖的降血糖活性進行比較發(fā)現(xiàn),霍山石斛多糖降血糖效果最佳,鐵皮石斛和金釵石斛有一定效果,流蘇石斛和鼓槌石斛與模型組比較沒有顯著差異。查學(xué)強等[7]對霍山石斛和鐵皮石斛多糖清除自由基的能力進行比較,表明霍山石斛多糖具有更高的抗氧化能力。鮑麗娟等[8]對霍山石斛和鐵皮石斛水提物對肝癌細(xì)胞HepG2的體外活性抑制能力進行比較,表明霍山石斛水提物較鐵皮石斛提取物具有更高的抑瘤作用。錢明雪等[9]分析了6 種石斛多糖(霍山石斛、鐵皮石斛、流蘇石斛、鼓槌石斛、金釵石斛和細(xì)莖石斛)抗亞急性酒精性肝損傷的作用,結(jié)果表明6 種石斛多糖抗酒精性肝損傷的活性存在不同,其中以霍山石斛最為有效。在抗炎方面,Li等[10]研究霍山石斛在LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞中的抗炎作用,結(jié)果表明霍山石斛莖乙醇提取物能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NO,TNF-α和IL-1b的產(chǎn)生。Ge等[11]研究表明霍山石斛可抑制香煙煙霧誘導(dǎo)的模型小鼠中的肺部炎癥。在針對白內(nèi)障問題方面,李秀芳等[12]還研究出霍山石斛多糖成分可能通過干預(yù)氧化應(yīng)激途徑延緩糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)展。針對炎癥和抗糖尿病性白內(nèi)障的研究目前尚未在鐵皮石斛的研究中發(fā)現(xiàn)。

本文通過比較霍山石斛與鐵皮石斛(樂清、云南)3種石斛提取物對體外免疫、抗氧化、細(xì)胞氧化損傷、抗腫瘤和抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響,明確兩者的功效差異,從而提高石斛原料的利用價值,為后期作用機制的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

霍山石斛 九仙尊霍山石斛股份有限公司太平畈種植基地;云南鐵皮石斛 龍陵縣林源石斛開發(fā)有限公司;樂清鐵皮石斛 浙江樂清市明森鐵皮石斛有限公司;DMEM、RPMI-1640、胎牛血清(FBS)、馬血清、2.5%胰蛋白液和alamarBlueTMGIBCO公司;牛血清白蛋白(BSA)、細(xì)菌脂多糖(LPS)、青霉素、鏈霉素、磷酸、sulfanilamide、naphtha、staurosporine、水溶性維生素E、維生素C、ABTS、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、三氯化鐵、苯甲基磺酰氟(PMSF)、醋酸鹽緩沖液、過氧化氫(H2O2) Sigma公司;α-葡萄糖苷酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒、RIPA裂解液 南京建成生物工程研究所;HepG2細(xì)胞、PC12、RAW264.7 中科院細(xì)胞所;硫酸、苯酚、葡萄糖、無水乙醇等 均為國產(chǎn)分析純。

UV-120型紫外-可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;DHG-9146A鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;Synergy HT 多功能酶標(biāo)儀、Clarify PC化學(xué)發(fā)光儀 Bio-TEK公司;3541型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技(中國);Delta series 生物安全柜 美國Labconco公司;OLYMPUS-IX71顯微鏡 Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 石斛提取物制備 石斛采用常規(guī)水提法制備水提物樣品:將烘干的霍山石斛、樂清鐵皮石斛、云南鐵皮石斛粉碎加入20 倍水,每次沸水回流提取2 h,共2次,合并濾液,10000×g離心15 min,收集上清液,減壓濃縮至浸膏,60 ℃干燥至恒重,即得到石斛水提物[13],分別命名為霍山石斛提取物、樂清鐵皮提取物及云南鐵皮提取物。

1.2.2 石斛提取物得率和多糖含量測定 以D-葡萄糖為對照品,采用苯酚-硫酸法測定各樣品組分中多糖含量[14]。準(zhǔn)確量取1.0 mL 供試品溶液,置具塞試管中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)和下列公式計算多糖提取率。所獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0098X-0.0101,R2=0.9985)。

樣品提取物得率(%)=提取物的質(zhì)量(g)×100/藥材的質(zhì)量(g)

式(1)

X=C×v1/2×v2×v3/M

式(2)

式(2)中:X:樣品中粗多糖得率(以葡聚糖計),mg/g;C:測試樣品的多糖濃度,mg/L;M:樣品質(zhì)量,mg;v1:樣品提取液總體積,mL;v2:沉淀粗多糖所用樣品提取液體積,mL;v3:樣品測定液總體積,mL。

1.2.3 體外刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放NO活性 稱取一定量的石斛提取物,于滅過菌的Eppendorf離心管中,在無菌條件下用PBS(pH7.4)配成5 mg·mL-1的溶液,12000×g離心30 min,無菌操作臺中將上清轉(zhuǎn)入滅菌管中,再用PBS將樣品稀釋至0.5、1.0、2.0、5.0 mg·mL-1(作用終濃度為50、100、200 和500 μg·mL-1),參照文獻[15]的方法測定巨噬細(xì)胞RAW264.7的NO釋放量。陽性對照為LPS(10 μg·mL-1),陰性對照為PBS(pH7.4)。

1.2.4 體外抗氧化活性檢測

1.2.4.1 ABTS自由基的測定 參照文獻[16-17]的方法,取0.1 mL的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品或水提物(1、2、4 mg/mL)于試管中,加入3.9 mL ABTS+·稀釋工作液,混合10 s并室溫下混勻20 min,734 nm波長下測定吸光度,以Trolox為參照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)線性方程Y=0.0008X+0.1274(R2=0.9958),計算對ABST自由基的清除效果,計算結(jié)果以TEAC值(μmol/L)表示,并以去離子水和0.2 mg·mL-1維生素C為陰性和陽性對照。

1.2.4.2 FRAP法測定總抗氧化能力 參照Benzie等[18]的方法,取100 μL水提物溶液(作用終濃度為1、2、4 mg/mL)與新配置的900 μL FRAP試劑(10 mmol·L-1TPTZ溶液、20 mmol·L-1三氯化鐵溶液和300 mmol·L-1醋酸鹽緩沖液的體積比1∶1∶10),在37 ℃下混勻并孵育2 h,待孵育結(jié)束后,在593 nm處檢測吸光度,分別以水和0.2 mg·mL-1維生素C(VC)為陰性和陽性對照。以硫酸亞鐵繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)線性方程Y=0.001X+0.0348(R2=0.9989),將吸光度值轉(zhuǎn)化對應(yīng)為FRAP值,即μmol/L。

1.2.5 對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞衰老(氧化損傷)的保護作用 參照文獻[19-21]的方法,取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞消化制成懸浮液,用含15%馬血清和2.5% FBS的DMEM培養(yǎng)基配制成5×104個/mL的細(xì)胞懸液,每孔190 μL接種于96孔板,等細(xì)胞貼壁后,加入10 μL 20 mmol·L-1的H2O2處理液,處理4 h后,將培養(yǎng)基吸出,每孔加入199 μL含有血清的DMEM培養(yǎng)液,然后加入1 μL 3種水提物溶液(50、100和200 μg·mL-1)。陽性對照為1 mg·mL-1VC。置于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)48 h后,加入180 μL無色培養(yǎng)基和20 μL 0.075 mg·mL-1AlamarBlueTM試劑,培養(yǎng)6～8 h后至陰性對照組顏色由藍(lán)變紅時,用酶標(biāo)儀測定570和600 nm處的吸光度。然后根據(jù)Alamar Blue試劑盒提供的公式計算樣品對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞增值的影響。計算公式如下:

修復(fù)率(%)=[1-117216×A570(樣品)-80586×A600(樣品)]×100/[117216×A570(對照)-80586×A600(對照)]

1.2.6 體外抑制肝癌細(xì)胞HepG2的活性測定 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞消化制成懸浮液,用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基配制成5×104個/mL的細(xì)胞懸液,接種于96孔板中,每孔200 μL細(xì)胞懸液,在37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞完全貼壁后,吸去培養(yǎng)基,分別加入200 μL含不同樣品的3種水提物(50、100、200和500 μg·mL-1)DMEM培養(yǎng)基。陰性和陽性對照分別為水和10 μmol/L星形孢菌(Staurosporine)。每個樣品做三個復(fù)孔,在37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后吸去培養(yǎng)基,加入180 μL無色培養(yǎng)基和20 μL 0.075 mg·mL-1alamarBlueTM試劑,培養(yǎng)6～8 h后至陰性對照組顏色由藍(lán)變紅時,用酶標(biāo)儀測定570和600 nm處的吸光度。然后根據(jù)Alamar Blue試劑盒提供的公式計算樣品對HepG2細(xì)胞增值的影響。

抑制率(%)=[117216×A570(樣品)-80586×Aλ600(樣品)]×100/[117216×A570(對照)-80586×A600(對照)]

1.2.7 胰島素抵抗HepG2模型細(xì)胞內(nèi)α-葡萄糖苷酶活性 參照文獻[22-23]的方法,HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后以含10%滅活FBS的RPMI 1640培養(yǎng),細(xì)胞貼壁后,將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化,以2×104個/mL的細(xì)胞濃度將HepG2細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞單層貼壁后,加入含1500 IU·L-1胰島素濃度的正常培養(yǎng)基,于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中孵育36 h后,棄去培養(yǎng)基,用PBS(pH為7.4)洗滌1次,再加入正常培養(yǎng)基37 ℃孵育20 min,重復(fù)上述過程1次,最后加入正常培養(yǎng)基。胰島素抵抗組加入正常培養(yǎng)基,陽性對照組加入含1.5 mmol·L-1二甲雙胍的正常培養(yǎng)基,樣品組分別加入含有3種樣品(作用終濃度為100、200、400 μg/mL)的正常培養(yǎng)基,正常細(xì)胞組即復(fù)蘇后用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h,收集細(xì)胞到15 mL離心管中,10000 r·min-1離心3 min,棄上清液,用預(yù)冷的1 mL PBS洗滌細(xì)胞,并重復(fù)兩次,最后收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中,吸去PBS溶液上清后,將離心管置于碎冰之中,按照1 mL 1% triton添加10 μL 100 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)的比例混勻裂解液,5×106個細(xì)胞添加400 μL裂解液,4 ℃過夜,裂解后的離心管置于預(yù)冷到4 ℃的離心機中,15000 r·min-1離心30 min,將上清液轉(zhuǎn)移到1 mL的離心管中,于4 ℃保存。按照α-葡萄糖苷酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒的方法操作，檢測α-葡萄糖苷酶酶活。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013和SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示;結(jié)果采用組間t 檢驗進行比較,當(dāng)p<0.05時,差異顯著;當(dāng)p<0.01時,差異極顯著。圖中僅標(biāo)注各樣品在同一濃度下的顯著性,各樣品在同一濃度下,不含有相同小寫字母,表示差異顯著(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 石斛提取物得率和多糖含量結(jié)果

由表1可知,霍山石斛提取物的得率最高,達(dá)到62.90%,而云南鐵皮多糖含量最高,達(dá)到57.29%。同時,通過計算能夠發(fā)現(xiàn)霍山石斛和鐵皮石斛莖中的多糖含量均在40%～58%之間,差異不明顯。

表1 石斛提取物的得率和多糖含量Table 1 Yield and content of Dendrobium extracts

2.2 體外刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放NO活性分析

巨噬細(xì)胞被激活后產(chǎn)生的NO被視為免疫系統(tǒng)重要的信號傳導(dǎo)因子,結(jié)果如圖1所示,霍山石斛提取物能很好地促進RAW264.7釋放NO,并呈濃度依賴性,表現(xiàn)出良好的提高免疫活性,而樂清鐵皮提取物、云南鐵皮提取物免疫活性較弱。

圖1 石斛提取物對巨噬細(xì)胞Raw264.7釋放NO的影響Fig.1 Effects on NO release from RAW264.7 cells of Dendrobium extracts注:圖中不同小寫字母代表各樣品在同一濃度下差異顯著,p<0.05),圖2～6同。

2.3 抗氧化活性分析

2.3.1 ABTS自由基清除能力 石斛提取物的ABTS自由基清除能力結(jié)果如圖2所示,隨著石斛提取物質(zhì)量濃度的增加,ABTS自由基清除能力逐漸增強,且呈濃度依賴性?；羯绞崛∥顰BTS自由基清除能力顯著優(yōu)于其他樣品。

圖2 石斛提取物對ABTS自由基清除能力的影響Fig.2 Effects on ABTS radical scavenging ability of Dendrobium extracts

2.3.2 總抗氧化能力(FRAP)分析 FRAP分析廣泛運用于食品與保健品的抗氧化能力測定,為驗證ABTS自由基模型測定的結(jié)果,采用FRAP試驗來評價樣品的抗氧化能力。如圖3所示,當(dāng)樣品質(zhì)量濃度從1 mg·mL-1增至4 mg·mL-1時,總抗氧化能力FRAP逐漸增強,且呈濃度依賴性。另外,樣品的FRAP與清除ABTS自由基的能力具有良好的正相關(guān)性,與已有文獻[24]報道類似。結(jié)合ABTS抗氧化模型的試驗結(jié)果(圖2)可以得出,霍山石斛提取物相較于鐵皮石斛提取物具有更好的抗氧化活性。

圖3 石斛提取物對總抗氧化能力的影響Fig.3 Effect on total antioxidant capacity of Dendrobium extracts

2.4 石斛提取物對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷的保護作用

由活性氧介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷在神經(jīng)退行性疾病中起了至關(guān)重要的作用,H2O2是體內(nèi)代謝產(chǎn)生的一種ROS,能夠與多種生物靶標(biāo)分子(如DNA、蛋白、脂質(zhì))反應(yīng),可以透過細(xì)胞膜,通過多種途徑造成線粒體的損傷,導(dǎo)致一系列類似衰老現(xiàn)象出現(xiàn)。如圖4所示,不同濃度霍山石斛提取物預(yù)處理后,對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)率顯著優(yōu)于其他樣品,且呈劑量依懶性,在濃度200 μg·mL-1時修復(fù)率達(dá)到40.52%,可以顯著提高細(xì)胞活力,具有明顯的抗衰老活性。

圖4 石斛提取物對H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷的保護作用Fig.4 Protective effect of Dendrobium extractson oxidative damage in PC12 cells induced by H2O2

2.5 石斛提取物對HepG2細(xì)胞增殖抑制的影響

如圖5所示,在試驗所選濃度范圍內(nèi),石斛提取物具有一定的抗腫瘤活性,且霍山石斛提取物(500 μg·mL-1)對HepG2的抑制作用最高為22.1%。

圖5 石斛提取物對HepG2增殖的抑制作用Fig.5 The inhibition of Dendrobium extractson the proliferation of HepG2 cells

2.6 對胰島素抵抗HepG2模型細(xì)胞內(nèi)α-葡萄糖苷酶的影響

張超等[22]研究表明,HepG2細(xì)胞經(jīng)過胰島素誘導(dǎo)發(fā)生胰島素抵抗后,丙酮酸激酶和己糖激酶的酶活相對于正常細(xì)胞組明顯降低,α-葡萄糖苷酶活出現(xiàn)顯著升高,經(jīng)二甲雙胍處理后α-葡萄糖苷酶活出現(xiàn)顯著性下降,能夠準(zhǔn)確模擬藥物治療狀態(tài)下糖尿病患者的酶活狀態(tài)。如圖6所示,在100 μg·mL-1低濃度時,3種樣品均對α-葡萄糖苷酶活無抑制作用;在中高濃度時霍山石斛提取物(200和400 μg·mL-1)具有一定的抑制活性,表明霍山石斛提取物具有較好的抑制α-葡萄糖苷酶酶活的作用。

圖6 石斛提取物對α-葡萄糖苷酶酶活的抑制作用Fig.6 Effects on α-glucosidase ability in insulin-resistant HepG2cells of Dendrobium extracts

3 結(jié)論與討論

石斛屬植物具有顯著的體內(nèi)、體外抗藥理活性。體外活性比較結(jié)果表明,霍山石斛相較于鐵皮石斛具有更好的提高免疫力、抗氧化、抗衰老、降血糖等生物活性?；羯绞崛∥镌诘蜐舛?50 μg·mL-1)時具有良好的提高免疫力活性,而鐵皮石斛提取物在試驗濃度下基本沒有活性?；羯绞崛∥锞哂懈玫腁BTS自由基清除能力和FRAP能力,其物質(zhì)基礎(chǔ)有待進一步確認(rèn)。郝杰等[25]發(fā)現(xiàn)霍山石斛多糖(分子量最大的組分S1)具有最強的還原力、抗脂質(zhì)過氧化能力及清除H2O2和羥基自由基的能力,而霍山石斛中寡糖、多酚、黃酮、縮合單寧等小分子物質(zhì)也可能具備很好地抗氧化活性。

抗衰老活性分析表明,霍山石斛提取物在濃度200 μg·mL-1時修復(fù)率達(dá)到40.52%,可以顯著提高細(xì)胞活力,而兩種鐵皮石斛提取物的修復(fù)率分別為25.29%和29.88%。降血糖結(jié)果表明,在中高濃度時霍山石斛提取物(200和400 μg·mL-1)具有較好的降血糖作用,而鐵皮石斛提取物基本沒有活性?；羯绞鳛橐环N常用的名貴中藥,廣泛的藥理活性是其成為一種名貴中藥的前提[26]。通過體外活性比較分析,對霍山石斛不同生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)有進一步認(rèn)識,為后期活性物質(zhì)的篩選、生物活性的作用機制及臨床應(yīng)用提供有價值參考。