劉起昆 鮑興 李浩 蔡卓 李覓 楊彩虹

骨巨細胞瘤（giant cell tumor of bone,GCTB）是一種具有局部侵襲性的交界性腫瘤。在亞洲人群中發(fā)病率相對較高，約占骨腫瘤的20%［1］。目前骨巨細胞瘤的治療以手術刮除或瘤段切除為主。非手術治療策略如雙磷酸鹽類、放化療、干擾素等，能夠在一定程度上緩解病人的癥狀、控制腫瘤的進展，避免出現更嚴重的并發(fā)癥，但存在復發(fā)率高甚至惡性病變的可能。因為腫瘤部位及治療手段的不同，腫瘤的復發(fā)率差異較大，約為15%～50%［2，3］。

2013年美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批準新藥地諾單抗用于治療成人或骨骼成熟的青少年中不能手術或手術可能導致嚴重功能障礙的骨巨細胞瘤，隨后大量的臨床隨訪和研究證明其良好的有效性及安全性。地諾單抗作為一種人源性的單克隆抗體，通過模仿機體內源性骨保護素（Osteoprotegerin,OPG）的作用機制，特異性地結合RANKL使其溶解，阻止RANKL/RANK介導的破骨細胞的分化、成熟及活化，減少骨質破壞、抑制腫瘤的進展。目前認為骨巨細胞瘤中的多核巨細胞是一種反應性細胞，類似于炎性反應，我們通過Genecards在線數據庫分析預測發(fā)現RANKL（TNFSF11）的啟動子區(qū)中關聯性最強的5個轉錄因子為STAT3、STAT1β、STAT1α、STAT1、FOXO4，其中信號轉錄因子STAT3與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，STAT3信號通路介導許多炎性反應過程。通過生物信息學分析（http://genemania.org）發(fā)現RANKL與STAT3信號通路關系密切（圖1）。臨床經驗提示使用地諾單抗治療后，骨巨細胞瘤病人骨質破壞被抑制，同時腫瘤基質細胞也大量消失，在此猜測STAT3及相關信號通路參與地諾單抗的抗骨巨細胞瘤作用。本研究擬通過免疫組化法檢測地諾單抗治療的骨巨細胞瘤組織與未經地諾單抗治療的病變組織中RANKL、STAT3分子及下游相關分子指標的變化，同時利用TUNEL法檢測經地諾單抗治療后腫瘤細胞的凋亡情況并與未經治療的腫瘤組織對比，明確STAT3及下游的相關分子是否參與骨巨細胞瘤的增殖和凋亡，并探究相關的分子作用機制。

圖1 生物信息學分析結果圖

材料與方法

一、一般資料

收集我院2013年1月至2018年12月手術治療的31例骨巨細胞瘤病人，其中28例未經地諾單抗治療（對照組），3例經地諾單抗治療（研究組），男13例，女18例，年齡為21～78歲；股骨、脛骨部位23例，其他部位8例；共33個石蠟組織標本（對照組未經地諾單抗治療的切片樣本數30個；研究組經地諾單抗治療的切片樣本數3個），全部標本均經病理組織學證實為骨巨細胞瘤。

二、方法

蘇木素-伊紅染色（hematoxylin and eosin,HE）、Rankl、STAT3、Bcl-2、Cyclin D1羊抗兔單克隆抗體，即用型SABC檢測試劑盒及TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。①腫瘤石蠟切片組織HE染色：按HE染色標準流程操作，石蠟切片烘箱烤片，常規(guī)脫蠟、梯度酒精水化，滴加蘇木素染核，1%的鹽酸酒精分化、PBS反藍，滴加伊紅染胞質，依次脫水、透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察染色結果。②免疫組化檢測：腫瘤組織標本用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，冷卻，4℃保存制成蠟塊，4 μm連續(xù)切片，采用SABC法進行免疫組織化學染色，嚴格按試劑盒說明書進行操作。所有切片常規(guī)脫蠟，PBS沖洗，3%的H2O2室溫下孵育10 min，使內源性過氧化物酶失去活性，微波爐進行抗原修復，正常山羊血清封閉，滴加適當比例稀釋的一抗，置于4℃冰箱過夜，然后滴加生物素化二抗及過氧化物酶標記的抗體，PBS清洗，DAB顯色，蘇木素對比染色。以PBS代替一抗作陰性對照。③TUNEL法檢測石蠟切片病理組織中細胞的凋亡情況，嚴格按照試劑盒說明書操作，切片常規(guī)脫蠟，3%的H2O2室溫下孵育10 min，滅活內源性過氧化物酶，滴加酶室溫消化15 min，后加標記緩沖夜室溫孵育2 h，滴加適當比例稀釋生物素化抗地高辛一抗?jié)窈袃仁覝胤磻?0 min，然后滴加稀釋的SABC室溫反應30 min，PBS清洗，DAB顯色，蘇木素對比染色，中性樹脂封片，鏡下觀察結果。

三、染色結果判斷

Rankl、STAT3、Bcl-2和Cyclin D1陽性著色為棕黃色顆粒，位于細胞質、細胞膜或細胞核內。先在低倍鏡下確定腫瘤組織內陽性表達部位，后用200/400倍鏡觀察蛋白分子表達的部位及陽性情況。腫瘤組織細胞凋亡檢測細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡的細胞。著色程度：不著色記0分，著淺棕色記1分，著棕色記2分，著深棕色記3分；著色細胞百分比（每個標本在高倍鏡下取10個視野計算陽性著色細胞數占全部細胞數百分比）：25%以下記1分，25%～50%記2分，50%～75%記3分，75%以上記4分。上述兩項參數相乘≥2分即認為有陽性表達。

結 果

一、石蠟切片HE染色結果

如圖2所示，a為對照組骨巨細胞瘤病變組織，鏡下主要由梭形腫瘤基質細胞和多核破骨樣巨細胞組成，基質細胞散在分布于巨細胞周圍；b為研究組病變組織，鏡下見多核破骨樣巨細胞幾乎消失，殘留部分細長單核基質細胞，大量的細網狀纖維組織及編織骨形成，替代腫瘤組織。

二、免疫組化SABC法檢測結果

對照組的腫瘤組織中RANKL、STAT3、Bcl-2和Cyclin D1的分子表達情況，如圖3所示，RANKL主要表達于單核基質細胞；STAT3主要表達于多核破骨樣巨細胞胞漿和腫瘤基質細胞胞膜；Bcl-2主要表達于多核破骨樣巨細胞胞漿，散在表達于細胞核內；Cycin D1主要表達于多核破骨樣巨細胞胞核。RANKL、STAT3、Bcl-2和Cyclin D1在對照組腫瘤組織中的陽性表達率分別為70%、53%、77%、73%（表1）。

圖2 骨巨細胞瘤組織HE染色情況 a：未經地諾單抗治療（×400）；b：地諾單抗治療后（×200）

表1 對照組骨病變組織樣本免疫組化結果［例（%）］

研究組的腫瘤組織中RANKL、STAT3、Bcl-2和Cyclin D1的分子表達情況，如圖4所示，RANKL在殘留的腫瘤基質細胞中散在表達，較未經治療的腫瘤組織表達量明顯下降；STAT3、Bcl-2、Cyclin D1未見表達。

三、TUNEL法檢測腫瘤細胞的凋亡情況

圖3 未經地諾單抗治療的腫瘤組織中RANKL（a）、STAT3（b）、Bcl-2（c）和Cyclin D1（d）的分子表達情況（SABC法染色，×200）

圖4 經地諾單抗治療后腫瘤組織中RANKL（a）、STAT3（b）、Bcl-2（c）和Cyclin D1（d）分子表達情況（SABC法染色，×200）

如圖5所示，對照組的腫瘤組織中多核破骨樣巨細胞和梭形基質細胞核可見棕黃色顆粒，僅有少量腫瘤細胞存在凋亡；研究組病變組織中殘留的腫瘤基質細胞可見明顯凋亡。

四、地諾單抗臨床治療病例

病例1，女，27歲，因“左膝關節(jié)疼痛，活動受限2天”入院。第一次入院行活檢術，病理證實為骨巨細胞瘤，病人出院規(guī)律地進行地諾單抗治療半年后返院行病灶刮除+骨水泥填充治療（圖6）。

病例2，男，38歲，因“左股骨遠端骨巨細胞瘤術后10個月復發(fā)”入院。在我院行病灶刮除+骨水泥填充+鋼板內固定手術治療，術后1周開始自行規(guī)律地進行地諾單抗治療（圖7）。

病例3，女，25歲，因“右小腿近端包塊1年伴疼痛4月余”入院?；顧z證實為脛骨近端骨巨細胞瘤，病人出院自行規(guī)律進行地諾單抗藥物治療3個月后復查X線片發(fā)現病灶明顯縮小、纖維鈣化包殼形成，后再次入院行病灶刮除植骨治療（圖8）。

討 論

圖5 TUNEL法檢測結果（×200） a：未經過地諾單抗治療的腫瘤組織；b：地諾單抗治療的腫瘤組織

圖6 女，27歲，骨巨細胞瘤 a、b：地諾單抗治療前X線片，可見股骨外髁病灶破壞骨質出現病理性骨折；c、d：地諾單抗治療4個月后復查X線片，可見病灶較治療前明顯縮小，病灶邊緣大量致密骨質形成；e、f：手術后第2天復查X線片，腫瘤病灶充分刮除，異體骨及骨泥填充殘留空腔

正常人體內骨骼的維持取決于骨重塑過程中骨形成與骨吸收之間的動態(tài)平衡，而骨質的重塑主要由破骨細胞和成骨細胞參與，如果成骨與破骨之間失去平衡就會出現骨質溶解及骨質硬化等病變［4］，其中破骨細胞的分化和成熟在這一過程中起關鍵性作用。破骨細胞的形成主要通過RANKL-RANKOPG信號通路來完成，在細胞因子、生長因子、激素等活性分子輔助參與下M-CSF、RANKL與破骨前體細胞膜表面的受體結合，招募和誘導胞內的結合分子如TRAF6，從而調節(jié)下游的信號通路如Src-PI3KAkt信號通路、MAPKs信號通路、NFATc1信號通路等［5，6］，最終激活核轉錄因子AP-1和NFATc1，促進破骨前體細胞的分化和骨吸收相關的基因如TRACP、MMMP-9、組織蛋白酶K的表達［7-9］。

STAT3是STAT家族的一種蛋白，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切，屬于致癌基因［10］。STAT3蛋白能活化參與細胞周期進展的基因如Fos、Myc、Cyclin D1，上調抗凋亡基因如Bcl-2和Bcl-XL的表達，對細胞的增殖、存活起重要作用［11，12］。在多種腫瘤組織中STAT3能夠上調VEGF的表達，刺激腫瘤血管的生成。而VEGF可以通過經典和非經典的通路參與調節(jié)破骨細胞的形成［13］。此外，有研究發(fā)現JAK2/STAT3信號通路對RANKL誘導的破骨前體細胞的分化成熟具有關鍵影響［10］。Park等［14］的研究發(fā)現過氧化物酶Ⅱ能通過抑制STAT3信號通路負性調節(jié)脂多糖誘導的破骨細胞的形成。Xiong等［12］的研究表明茯苓多糖能夠通過抑制NFATc1D的活性和ERK/STAT3的磷酸化來減弱RANKL誘導的破骨細胞的產生。這些研究結果說明STAT3及其相關的信號通路可能參與了RANKL介導的破骨細胞的形成過程。我們研究觀察發(fā)現STAT3大量表達于多核巨細胞漿和腫瘤基質細胞胞膜，陽性表達率約為53%；地諾單抗治療后的組織中未見有STAT3表達。

圖7 男，38歲，左股骨遠端骨巨細胞瘤術后復發(fā) a、b：骨巨細胞瘤術后復發(fā)入院時X線片，可見股骨下段干骺端骨質破壞，腫瘤復發(fā)；c、d：行病灶刮除+骨水泥填充+鋼板內固定術后4天復查X線片，腫瘤病灶充分刮除，骨水泥填充完全，內固定位置良好、牢固；e～h：術后地諾單抗治療3個月（e、f）、6個月（g、h）復查X線片，可見病灶部位骨質愈合良好，大量新鮮致密骨質形成；i、j：術后10個月復查X線片，術后病灶恢復良好，未見腫瘤復發(fā)

圖8 女，25歲，脛骨近端骨巨細胞瘤 a、b：地諾單抗治療前X線片，可見脛骨上段骨質呈肥皂泡樣溶骨性破壞；c、d：地諾單抗治療2個月后，可見破壞灶明顯縮小，周圍形成致密骨質；e、f：地諾單抗治療4個月后復查，顯示病灶繼續(xù)縮小、周圍新生骨質及鈣化灶繼續(xù)形成擴大；g～n：術后3個月（g、h）、7個月（i、j）、13個月（k、l）及17個月（m、n）復查結果，可見骨質愈合良好，大量新鮮骨質及鈣化灶形成，未見腫瘤復發(fā)跡象

Bcl-2蛋白是最早發(fā)現的細胞凋亡調節(jié)Bcl蛋白家族成員之一，在細胞凋亡的調控中起重要作用。Yamashita等［15］的研究發(fā)現Bcl-2（-/-）小鼠中破骨細胞減少、骨量增加，說明Bcl-2可能在破骨細胞的形成中扮演重要作用。同時有研究發(fā)現胰島素能通過上調Cyclin D1和Bcl-2A1（抗凋亡蛋白）的表達促進破骨細胞的增殖［16］。這些研究說明Bcl-2蛋白家族對破骨細胞的形成具有重要影響，可能參與骨巨細胞瘤中破骨樣巨細胞的形成并調節(jié)其功能。我們的研究發(fā)現Bcl-2主要表達于多核破骨樣巨細胞胞漿、散在表達于胞核，陽性表達率約為77%，而經過地諾單抗治療后未見明顯的Bcl-2蛋白表達。

Cyclin D1是一種關鍵的細胞周期調節(jié)因子，主要功能是促進細胞增殖、驅動細胞周期由G1期進入到S期。有研究［17，18］發(fā)現Cyclin D1高表達于骨巨細胞瘤中的多核巨細胞核內，并推測是P21導致其在巨細胞核中的累積，甚至調節(jié)巨細胞的形成。Matsubayashi等［19］的研究表明Cyclin D1主要表達于骨巨細胞瘤的多核巨細胞胞核中，同時可能對巨細胞的形成而非細胞增殖產生重要作用。這些與本研究觀察到的研究結果一致，Cyclin D1高表達于多核破骨樣巨細胞胞核中，陽性表達率約為73%；地諾單抗治療后病變組織破骨巨細胞消失，未見Cyclin D1分子的表達，這說明地諾單抗治療能下調其表達。

地諾單抗作為一種人源性單克隆抗體，對RANKL有高度親和力及特異性，通過阻斷RANKL與RANK的結合，從而抑制破骨細胞的形成。本研究通過免疫組化檢測發(fā)現RANKL主要表達于骨巨細胞瘤中的單核基質細胞內，而經地諾單抗治療后病灶組織中多核破骨細胞消失、大量纖維骨組織形成，邊緣區(qū)域殘留部分梭形基質細胞，散在陽性表達RANKL分子，這與Yonezawa等［20］報道的病例研究結果吻合。同時觀察到骨巨細胞瘤組織中STAT3及下游的Bcl-2、Cyclin D1分子表達量與RANKL的表達存在一定的聯系，在RANKL表達量高的組織中，這三種信號分子表達量也相對較高，反之情況亦然。同時本研究利用TUNEL法檢測地諾單抗治療前后腫瘤細胞的凋亡情況，結果發(fā)現未經地諾單抗治療的腫瘤組織中僅有少量腫瘤細胞凋亡，而治療后多核破骨巨細胞完全消失、大量纖維編織骨形成替代病灶組織，殘留的腫瘤基質細胞明顯凋亡，說明地諾單抗治療能夠促進腫瘤細胞凋亡，但不能完全清除腫瘤基質細胞，地諾單抗可能通過抑制RANKL介導的STAT3信號通路，下調Bcl-2、Cyclin D1關鍵分子的表達，最終導致腫瘤細胞凋亡。

綜上所述，我們推測STAT3信號通路可能參與了地諾單抗治療骨巨細胞瘤的過程，地諾單抗可能通過抑制RANKL介導的STAT3的磷酸化，進而下調STAT3信號通路中抗凋亡蛋白Bcl-2和細胞周期調節(jié)蛋白Cyclin D1的表達，最終抑制破骨樣巨細胞的形成、促進腫瘤基質細胞的凋亡（圖9）。此外，需要指出的是本研究收集的研究組樣本數量較少，結果不足以進行統計學分析，單純的進行組間結果差異比較可能會存在一定的偏倚。后續(xù)如果有足夠的病例標本及新鮮的樣本組織，我們將進一步驗證這一機制。

圖9 地諾單抗通過抑制RANKL介導的STAT3信號通路抑制破骨細胞的形成機制