衛(wèi)治金，李 曉，王皓楠，趙倩倩，于道永，葛保勝

(中國(guó)石油大學(xué)(華東) 生物工程與技術(shù)中心，山東 青島 266580)

化石燃料的大量使用使得能源危機(jī)和溫室效應(yīng)問(wèn)題日益突出，因此開發(fā)可再生、無(wú)污染的新型能源越來(lái)越受到人們的關(guān)注[1]。生物柴油作為化石能源的替代燃料，具有燃燒性好、穩(wěn)定性高及含硫量低等特點(diǎn)，已成為目前國(guó)際上發(fā)展最快、應(yīng)用最廣的可再生綠色能源[2]。

微藻作為一種新型生物質(zhì)能源，具有生長(zhǎng)周期短、生物產(chǎn)量高及占地面積小等特點(diǎn)[3]。微藻為光合自養(yǎng)生物，可以通過(guò)光合作用吸收大氣中的CO2，在緩解溫室效應(yīng)的同時(shí)能夠生成蛋白質(zhì)、葉綠素、油脂等物質(zhì)[4]，被認(rèn)為是生產(chǎn)生物柴油和生物產(chǎn)品最有希望的原料之一[5]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)微藻制備生物柴油做了許多基礎(chǔ)研究，但是微藻生物柴油的高成本制約了其規(guī)模化的生產(chǎn)[6]，而優(yōu)良藻種的篩選是降低成本的首個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前，大多數(shù)優(yōu)良藻種的選育一般采用物理、化學(xué)或生物學(xué)手段。其中物理誘變方法因污染小、操作簡(jiǎn)便及安全性高，已成為工業(yè)微生物育種中最常用且最有效的技術(shù)。常用的物理誘變手段主要包括紫外線、X射線和離子束等[7]。然而常規(guī)誘變選育的藻株常存在突變效率低、突變譜窄并易產(chǎn)生抗性飽和等問(wèn)題[8]。近年來(lái)，隨著等離子體交叉學(xué)科研究的快速發(fā)展，其在等離子體刻蝕、材料表面改性、消毒滅菌及微生物誘變育種等領(lǐng)域的研究深受關(guān)注[9]。低溫等離子體是指在低溫狀態(tài)下，利用外加電壓將氣體分子擊穿，產(chǎn)生包括電子、離子、原子和自由基在內(nèi)的混合體，這些物質(zhì)能與生物體內(nèi)大分子發(fā)生相互作用，從而引起各種各樣的變異[10]。王純陽(yáng)等[11]通過(guò)研究低溫等離子體對(duì)水稻種子生長(zhǎng)的影響，表明低溫等離子體對(duì)水稻糙米種子的生長(zhǎng)活力具有促進(jìn)作用。桂芳等[9]利用低溫空氣等離子體對(duì)產(chǎn)黃青霉菌進(jìn)行誘變育種，正突變率高達(dá)44.19%，同時(shí)青霉素效價(jià)較出發(fā)菌提高了42.1%。金麗華等[12]利用等離子體快速誘變產(chǎn)油酵母使得突變株產(chǎn)油量較原始株提高了2.2倍，生物量也提高了1.5倍，而低溫等離子體技術(shù)應(yīng)用于微藻誘變育種的相關(guān)研究報(bào)道較少。

本研究以小球藻(Chlorellavulgaris)為研究對(duì)象進(jìn)行低溫等離子體誘變，測(cè)定培養(yǎng)過(guò)程中的生物量、油脂含量等指標(biāo)，旨在篩選獲得生長(zhǎng)速度快且油脂含量高的藻株，以期為實(shí)現(xiàn)微藻生物柴油的規(guī)模化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藻種及培養(yǎng)基

小球藻(C.vulgaris)，中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所；BG11培養(yǎng)基。

1.1.2 主要試劑

正己烷、硫酸、氯仿、甲醇、二甲基亞砜(DMSO)，索萊寶公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白(BSA)，天根生化科技有限公司；尼羅紅染料，Sigma公司。

1.1.3 主要儀器

Agilent 7890B氣相色譜儀，UV-1700紫外分光光度計(jì)，GXZ恒溫光照培養(yǎng)箱，DK-S24電熱恒溫水浴鍋，5810R臺(tái)式冷凍離心機(jī)，F(xiàn)luoro Max-4熒光光譜儀，KQ-100KDE超聲波清洗器，CTP-2000K低溫等離子體實(shí)驗(yàn)電源。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻種培養(yǎng)

取藻液接種于含有40 mL BG11液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，接種量20%，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照周期為光14 h/暗10 h，光照強(qiáng)度210 μmol/(m2·s)。

1.2.2 低溫等離子體誘變預(yù)實(shí)驗(yàn)

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小球藻藻液，用無(wú)菌0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0)調(diào)整OD750至0.2，制成懸浮液[13]。取5 mL藻懸液，在低溫等離子體實(shí)驗(yàn)電源電壓40 kV、電流2 A放電條件下分別誘變照射1、2、3、4、5 min，然后置于暗環(huán)境培養(yǎng)24 h，取100 μL藻液涂布于BG11固體平板上，光暗交替培養(yǎng)(培養(yǎng)條件同1.2.1)，7 d后根據(jù)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的藻落數(shù)計(jì)算致死率，確定適合的誘變時(shí)間。

1.2.3 低溫等離子體誘變實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.2.2預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定的誘變參數(shù)對(duì)野生株小球藻進(jìn)行誘變后，光暗交替培養(yǎng)7 d，挑取體積較大、顏色濃綠的單克隆藻株，接種于BG11液體培養(yǎng)基中并置于恒溫光照培養(yǎng)箱中光暗交替培養(yǎng)(培養(yǎng)條件同1.2.1)。以油脂含量為指標(biāo)，篩選誘變?cè)逯?。同時(shí)，以野生藻株為對(duì)照，對(duì)誘變株的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 生物量的測(cè)定

用烘干稱重法測(cè)定。取一定體積的藻液，8 000×g離心15 min去掉上清，沉降藻泥置于預(yù)先干燥稱重的離心管中，70℃烘箱烘干恒重，冷卻后稱量，設(shè)置3個(gè)平行樣。生物量(DCW)以單位體積的藻液中藻細(xì)胞干重表示。

1.2.5 葉綠素含量的測(cè)定

用96%甲醇提取法測(cè)定。取適量藻液8 000×g離心15 min去掉上清，沉降藻泥加入10 mL 96%甲醇，渦旋混勻3 min后超聲浸提40 min，期間避光加冰防止葉綠素受熱見光分解。待藻體顏色變白，離心取上清液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)得OD653和OD666，根據(jù)下式計(jì)算葉綠素含量[14]。同時(shí)，計(jì)算葉綠素產(chǎn)率(以單位培養(yǎng)時(shí)間、單位體積的藻液中葉綠素增加的質(zhì)量表示)。

Ca=15.65×OD666-7.34×OD653

Cb=27.05×OD653-11.21×OD666

Ca+b=(Ca+Cb)/(10DCW)

式中：Ca為藻液中葉綠素a的質(zhì)量濃度，mg/L；Cb為藻液中葉綠素b的質(zhì)量濃度，mg/L；Ca+b為藻細(xì)胞中葉綠素a與葉綠素b的含量，%；DCW為藻細(xì)胞干重，g/L。

1.2.6 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

用Bradford法測(cè)定[15]。以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)樣，繪制蛋白質(zhì)量濃度與OD595的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取適量藻液8 000×g離心15 min去掉上清，沉降藻泥加入2 mL PBS(pH 7.2)，渦旋混勻3 min后進(jìn)行超聲破碎，待藻體澄清，離心，取適當(dāng)體積的上清液用PBS補(bǔ)足至150 μL后加入2.85 mL考馬斯亮藍(lán)，混勻，室溫放置5 min后測(cè)定OD595。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量。同時(shí)，計(jì)算蛋白質(zhì)產(chǎn)率(以單位培養(yǎng)時(shí)間、單位體積的藻液中蛋白質(zhì)增加的質(zhì)量表示)。

1.2.7 總脂含量的測(cè)定

用氯仿-甲醇法測(cè)定[16]。取干燥的藻粉于10 mL離心管中，加入3 mL氯仿-甲醇溶液(體積比2∶1)，渦旋混勻3 min后超聲浸提40 min，8 000×g離心15 min收集上清至已稱重的玻璃試管中，沉淀繼續(xù)用氯仿-甲醇溶液萃取至無(wú)色，最后合并上清，用氮?dú)鈱⒉Ａг嚬苤械挠袡C(jī)溶劑吹干，并置于60℃烘箱干燥3 h，冷卻后稱重，計(jì)算總脂含量和總脂產(chǎn)率(以單位培養(yǎng)時(shí)間、單位體積的藻液中總脂增加的質(zhì)量表示)。

1.2.8 中性脂含量的測(cè)定

用尼羅紅(NR)熒光染色法測(cè)定[17]。取適量藻液8 000×g離心15 min去掉上清，沉降藻泥加入20% DMSO懸浮，然后用紫外分光光度計(jì)調(diào)節(jié)OD540至1.0[18]，同時(shí)通過(guò)干重法測(cè)定該藻液的生物量。取2 mL調(diào)節(jié)好OD540的藻液，40℃水浴30 min后加入10 μL 0.24 mg/mL尼羅紅染料，避光染色5 min 后用熒光光譜儀以520 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，574 nm 為消散波長(zhǎng)測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成中性脂含量。同時(shí)，計(jì)算中性脂產(chǎn)率(以單位培養(yǎng)時(shí)間、單位體積的藻液中中性脂增加的質(zhì)量表示)。

1.2.9 脂肪酸組成及含量的測(cè)定

取1.2.7過(guò)程中獲得的總脂，加入0.4 mL 50%硫酸和2 mL無(wú)水甲醇，混勻封口，60℃水浴30 min后加入1 mL正己烷，混勻離心取上清。以正十九酸為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行氣相色譜分析[19]。根據(jù)樣品中各組分保留時(shí)間定性，采用面積歸一化法定量。

氣相色譜條件：HP-5毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度280℃；檢測(cè)器溫度300℃；柱溫50℃，保持2 min，以10℃/min升溫至280℃，保持10 min；載氣為氮?dú)?，流?.3 mL/min；分流比3∶1；進(jìn)樣量1 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 低溫等離子體誘變時(shí)間的確定及誘變?cè)逯甑暮Y選

用低溫等離子體誘變處理野生型小球藻后，藻液顏色由深綠色變淺甚至變白，誘變時(shí)間越長(zhǎng)，顏色越淺。誘變培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)藻細(xì)胞誘變致死率，結(jié)果見圖1。

圖1 不同低溫等離子體誘變時(shí)間的致死率

由圖1可見，等離子體誘變4 min的致死率為83%，誘變5 min的致死率為91%，表明低溫等離子體能在短時(shí)間內(nèi)造成微藻細(xì)胞的突變，從而產(chǎn)生較為明顯的誘變效果。根據(jù)80%～90%的致死率為最適誘變劑量，選擇4 min為本實(shí)驗(yàn)的誘變時(shí)間。通過(guò)對(duì)野生型小球藻進(jìn)行誘變共得到1 000株誘變株，以BG11培養(yǎng)基進(jìn)行篩選得到3株油脂含量較高的藻株，分別命名為M1、M4和M7，對(duì)這3株誘變株的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

2.2 誘變株生物量的變化(見圖2)

圖2 誘變株及野生株生物量的變化

由圖2可見，藻株培養(yǎng)10 d，3株誘變株生物量較野生株發(fā)生了改變，誘變株M1的生物量積累最高，為0.22 g/L，較野生株的0.17 g/L增加了29.4%，誘變株M4和M7生物量積累次之，分別為0.19 g/L和0.20 g/L，較野生株分別增加了11.8%和17.6%。該結(jié)果說(shuō)明3株誘變株的生長(zhǎng)速率較野生株有了一定程度的提高。

2.3 誘變株葉綠素含量及產(chǎn)率的變化(見圖3)

圖3 誘變株及野生株培養(yǎng)10 d葉綠素含量及產(chǎn)率的變化

由圖3可見，誘變株M1、M4和M7的葉綠素含量分別為12.74%、12.94%和13.27%，較野生株的14.39%均有一定程度的降低。分析原因可能是低溫等離子體誘變致使藻細(xì)胞內(nèi)部分原料物質(zhì)流向合成油脂等組分的比例增高，從而使得細(xì)胞內(nèi)葉綠素含量降低。誘變株M1和M7的葉綠素產(chǎn)率分別為2.80、2.65 mg/(L·d)，較野生株的2.45 mg/(L·d)分別提高了14.3%和8.2%，而誘變株M4則無(wú)顯著變化。誘變株M1和M7的葉綠素含量降低，但2株誘變株生物量增高明顯，因此其葉綠素產(chǎn)率也有了一定程度的提高。

2.4 誘變株蛋白質(zhì)含量及產(chǎn)率的變化

微藻細(xì)胞蛋白質(zhì)含量豐富，能夠?yàn)槿撕蛣?dòng)物提供所必需的氨基酸，可用作食品和動(dòng)物飼料添加劑[20]，因此對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中各藻株蛋白質(zhì)含量及產(chǎn)率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖4。

圖4 誘變株及野生株培養(yǎng)10 d蛋白質(zhì)含量及產(chǎn)率的變化

由圖4可見，誘變株M1的蛋白質(zhì)含量為31.22%，較野生株的27.11%提高了15.2%，其余2株誘變株蛋白質(zhì)含量則略有降低。3株誘變株的蛋白質(zhì)產(chǎn)率均有一定程度的提高，其中M1和M7的蛋白質(zhì)產(chǎn)率分別為6.87 mg/(L·d)和5.34 mg/(L·d)，較野生株的4.61 mg/(L·d)分別提高了49.0%和15.8%。

2.5 誘變株總脂含量及產(chǎn)率的變化(見圖5)

由圖5可見，3株誘變株的總脂含量較野生株均有明顯的提高，誘變株M1、M4和M7的總脂含量分別為37.28%、24.83%和27.11%，較野生株的18.32%分別提高了103.5%、35.5%和48.0%。誘變株M1的總脂產(chǎn)率最高，為8.20 mg/(L·d)，較野生株的3.11 mg/(L·d)提高了163.7%，誘變株M4和M7的總脂產(chǎn)率也較野生株分別提高了51.8%和74.3%。該結(jié)果說(shuō)明低溫等離子體誘變篩選的3株藻株油脂含量均有較為顯著的提高。

圖5 誘變株及野生株培養(yǎng)10 d總脂含量及產(chǎn)率的變化

2.6 誘變株中性脂含量及產(chǎn)率的變化

微藻生物柴油生產(chǎn)過(guò)程中的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)主要是微藻細(xì)胞中的甘油三酯即中性脂與甲(乙)醇反應(yīng)生成脂肪酸甲(乙)酯，后者為生物柴油的主要成分。而大多數(shù)海洋微藻的主要脂類為極性脂，中性脂更多的是以儲(chǔ)存脂質(zhì)的形式存在。因此，提高微藻細(xì)胞內(nèi)中性脂含量對(duì)微藻制備生物柴油具有重要意義。對(duì)3株誘變株的中性脂含量及產(chǎn)率進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見圖6。

圖6 誘變株及野生株培養(yǎng)10 d中性脂含量及產(chǎn)率的變化

由圖6可見，3株誘變株的中性脂含量較野生株均有明顯的提高，其中誘變株M1的中性脂含量最高，為19.12%，較野生株的8.19%提高了133.5%，誘變株M4和M7也分別提高了30.3%和39.9%。誘變株M1的中性脂產(chǎn)率最高，為4.21 mg/(L·d)，較野生株的1.39 mg/(L·d)提高了202.9%；誘變株M4和M7的中性脂產(chǎn)率也分別提高了45.6%和64.7%。以上結(jié)果說(shuō)明，誘變株M1的中性脂含量及產(chǎn)率均有顯著的提高，具有一定的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用潛力。

2.7 誘變株脂肪酸組成及含量的變化

微藻油脂中含有多種形式的脂肪酸成分，包括飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)。其中MUFA的十八烯酸C18∶1為生物柴油的指標(biāo)[21]，PUFA中的EPA和DHA組分對(duì)人體具有很高的營(yíng)養(yǎng)學(xué)和藥學(xué)價(jià)值。因此，提高微藻細(xì)胞內(nèi)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值脂肪酸的含量對(duì)生產(chǎn)生物柴油及生物產(chǎn)品具有重要意義。

對(duì)培養(yǎng)10 d的3株誘變株及野生株的油脂脂肪酸組成及含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 誘變株及野生株油脂脂肪酸組成及含量 %

由表1可見，C16與C18脂肪酸在誘變株M1、M4和M7中的含量分別為80.8%、66.5%和67.9%，高于野生株的62.8%，而這兩種脂肪酸是生物柴油的主要組分。同時(shí)作為生物柴油指標(biāo)的十八烯酸C18∶1在3株誘變株中的含量分別為27.7%、22.8%和20.9%，較野生株分別提高了64.9%、35.7%和24.4%。3株誘變株MUFA含量為37.4%～44.0%，PUFA含量為15.4%～19.8%，均高于野生株的35.6%和14.9%，而SFA含量有所下降。誘變株M1藻細(xì)胞油脂PUFA中的亞油酸C18∶2和α-亞麻酸C18∶3含量也均有所提高，前者在人體內(nèi)被吸收利用最終生成花生四烯酸，后者在人體內(nèi)則會(huì)轉(zhuǎn)化生成EPA和DHA，EPA能降低人體血液黏稠度，促進(jìn)血液循環(huán)，而DHA能促進(jìn)人體大腦的成長(zhǎng)和發(fā)育。以上結(jié)果表明3株誘變株中飽和脂肪酸含量降低，而不飽和脂肪酸含量有所提高，這對(duì)微藻生物柴油的制備及生物產(chǎn)品的加工具有重要意義。

3 結(jié) 論

本文以小球藻(C.vulgaris)為研究對(duì)象進(jìn)行低溫等離子體誘變，測(cè)定培養(yǎng)過(guò)程中生物量、油脂含量和脂肪酸組成等指標(biāo)，旨在篩選具有產(chǎn)業(yè)化潛力的能源藻株。結(jié)果表明，誘變篩選得到3株油脂含量高且生物量高的藻株，其中最具產(chǎn)業(yè)化潛力藻株M1的總脂含量、中性脂含量、總脂產(chǎn)率及中性脂產(chǎn)率分別為37.28%、19.12%、8.20 mg/(L·d)和4.21 mg/(L·d)，較野生株分別提高了103.5%、133.5%、163.7%和202.9%，M1的生物量及蛋白質(zhì)含量分別為0.22 g/L和31.22%，較野生株也有一定程度的提高。誘變株M1藻細(xì)胞中的MUFA和PUFA 含量分別為44.0%和19.8%，高于野生株的35.6%和14.9%；MUFA中作為生物柴油指標(biāo)的C18∶1組分含量為27.7%，較野生株的16.8%提高了64.9%；同時(shí)PUFA中的亞油酸C18∶2和α-亞麻酸C18∶3含量也均有所提高。

致謝：本文中低溫等離子體誘變實(shí)驗(yàn)在中科院合肥物質(zhì)研究院離子束生物工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，感謝課題組成員對(duì)本研究提供技術(shù)和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。