田 地，任 健

(1.齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.黑龍江省玉米主食工業(yè)化工程技術(shù)研究中心， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 3.黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

黑豆主要產(chǎn)于中國、日本、韓國、美國等國家。由于黑豆具有耐旱、耐瘠、適應(yīng)性廣、營養(yǎng)價值高等特點(diǎn)，在我國的大部分地區(qū)都有栽培，以東北產(chǎn)量最多[1]。研究表明[2]，黑豆蛋白質(zhì)含量比黃豆高24.5%，相當(dāng)于雞蛋的3.38倍。黑豆蛋白的氨基酸組成與動物蛋白相似，含有18種氨基酸，必需氨基酸占氨基酸總量的40%以上，符合FAO/WTO均衡模式標(biāo)準(zhǔn)[3]，能滿足人類強(qiáng)體益智的需求。

超濾是一種新型生物分離技術(shù)，具有操作簡單、易于放大等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和多肽的分離[4-6]。作為一種膜分離方法，通過壓力差的推動可選擇性地將溶液中較大溶質(zhì)分子截留于微孔濾膜上[7]。將超濾技術(shù)應(yīng)用于蛋白肽的分離純化，有利于提高肽的生理活性。田少君等[8]發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量小于3 kDa的小分子大豆肽具有較高的自由基清除率。張宇昊等[9]發(fā)現(xiàn)經(jīng)超濾分離后，相對分子質(zhì)量小于1 kDa的花生短肽降血壓活性很強(qiáng)。周麗珍等[10]采用先超濾后納濾聯(lián)用工藝制備的花生短肽液具有較強(qiáng)的ACE抑制活性和體外抗氧化活性。

本試驗以黑豆分離蛋白為原料，利用Alcalase對其進(jìn)行酶解，得到制備抗氧化肽的最佳酶解條件，隨后利用超濾法對所得酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離，探究不同相對分子質(zhì)量組分的抗氧化性，為擴(kuò)大黑豆分離蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

黑豆，購于黑龍江省齊齊哈爾市；Alcalase(酶活力≥20萬U/g)，上海寶曼生物科技有限公司；水楊酸，分析純，天津市科密歐化學(xué)制劑有限公司；DPPH，分析純，上海生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

ZNCL-GS智能磁力攪拌器；TU-1810型紫外可見光分光光度計；PB-10型酸度計；323E型膜過濾系統(tǒng)，瑞典。

1.2 試驗方法

1.2.1 Alcalase酶解黑豆分離蛋白

參照王小慶等[11]的方法提取黑豆分離蛋白。以黑豆分離蛋白為底物配制一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋白分散液，放入磁力攪拌器中水浴至試驗所需的溫度，調(diào)節(jié)pH至9.5，加入Alcalase并攪拌。反應(yīng)過程中以1 mol/L NaOH維持pH恒定。酶解至預(yù)定時間后，將酶解液置沸水浴中滅酶10 min，冷卻后于4 000 r/min條件下離心15 min，所得上清液即為黑豆分離蛋白酶解液。

1.2.2 超濾法分離黑豆分離蛋白酶解產(chǎn)物

黑豆分離蛋白酶解液依次采用10、5 kDa和3 kDa截留相對分子質(zhì)量的超濾膜進(jìn)行超濾，得到大于10 kDa、5～10 kDa、3～5 kDa及小于3 kDa的組分，測定各組分的抗氧化性。

1.2.3 水解度(DH)的測定

采用pH-stat法測定酶解產(chǎn)物的水解度[12]。

1.2.4 抗氧化性測定

(1)羥基自由基(·OH)清除率：參照Fenton反應(yīng)方法建立反應(yīng)體系模型[13]。取2 mL 2 mg/mL黑豆分離蛋白酶解產(chǎn)物，加入2 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵、2 mL6 mmol/L的雙氧水，混勻后靜置10 min，加入2 mL6 mmol/L的水楊酸，振蕩混勻，靜置30 min，在510 nm處測定吸光值，記為Ai，用去離子水替代水楊酸測定的吸光值記為Aj，空白對照組以去離子水代替樣品，測定的吸光值記為A0。按下式計算·OH清除率(K)。

K=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(2)DPPH自由基清除率：參照Zhang等[14]的方法測定。取2 mL 2 mg/mL黑豆分離蛋白酶解產(chǎn)物，加入2 mL 0.1 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液，混勻，避光反應(yīng)30 min后，在517 nm處測定的吸光值為Ai；另取2 mL 2 mg/mL黑豆分離蛋白酶解產(chǎn)物，加入無水乙醇2 mL，避光反應(yīng)30 min后，在517 nm處測定的吸光值為Aj；以2 mL 0.1 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液和2 mL無水乙醇作參考，避光反應(yīng)30 min后，在517 nm處測定的吸光值為A0。按下式計算DPPH自由基清除率(K)。

K=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(3)還原力(OD值)測定：取2 mL 2 mg/mL的樣品溶液，加入2 mL磷酸鹽緩沖液、2 mL鐵氰化鉀溶液，均勻混合，在50℃水浴下保溫20 min，再加入2 mL三氯乙酸溶液，振蕩搖勻后離心。取上清液2 mL，加入2 mL去離子水和0.4 mL三氯化鐵溶液，振蕩搖勻后在50℃水浴下保溫10 min，在波長為700 nm下進(jìn)行比色。以去離子水代替樣品重復(fù)以上操作，作為空白。還原力以O(shè)D值表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 Alcalase酶解黑豆分離蛋白單因素試驗

2.1.1 加酶量的確定

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的黑豆分離蛋白分散液，在酶解溫度50℃、酶解時間100 min、pH 9.5條件下，分別選擇加酶量為1%、2%、4%、6%、8%進(jìn)行酶解，測定酶解產(chǎn)物的抗氧化性(·OH清除率)及水解度，結(jié)果見圖1。

注：不同字母代表差異顯著，p<0.05。下同。圖1 加酶量對酶解產(chǎn)物的水解度和抗氧化性的影響

由圖1可知，加酶量達(dá)到4%之前，隨著加酶量的增加，蛋白質(zhì)肽鍵斷裂的速度增加，導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的水解度增加，抗氧化性也逐漸增強(qiáng)，當(dāng)加酶量繼續(xù)增大時，水解度并未顯著增加，·OH清除率反而下降。因此，選擇加酶量4%進(jìn)行下一步試驗。

2.1.2 酶解時間的確定

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的黑豆分離蛋白分散液，在加酶量4%、酶解溫度50℃、pH 9.5條件下，分別選擇酶解時間為60、80、100、120、140 min進(jìn)行酶解，測定酶解產(chǎn)物的抗氧化性及水解度，結(jié)果見圖2。

圖2 酶解時間對酶解產(chǎn)物的水解度和抗氧化性的影響

由圖2可知，在反應(yīng)的最初階段，隨著酶解時間的延長，酶解產(chǎn)物的水解度和抗氧化性都增加。當(dāng)酶解時間達(dá)到80 min時，水解度和抗氧化性都較高，分別為27.19%和22.25%。這是因為隨著酶解時間的延長，蛋白質(zhì)水解生成的肽增加，延長酶解時間，·OH清除率和水解度升高；此后，·OH清除率和水解度都趨于平緩，在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異。因此，選擇酶解時間80 min進(jìn)行下一步試驗。

2.1.3 酶解溫度的確定

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的黑豆分離蛋白分散液，在加酶量4%、pH 9.5、酶解時間80 min條件下，分別選擇酶解溫度為45、50、55℃進(jìn)行酶解，測定酶解產(chǎn)物的抗氧化性及水解度，結(jié)果見圖3。

圖3 酶解溫度對酶解產(chǎn)物的水解度和抗氧化性的影響

由圖3可知，酶解溫度為50℃時，酶解產(chǎn)物對·OH清除率達(dá)到20.47%，水解度達(dá)到25.81%，在酶解溫度高于50℃后，·OH清除率和水解度均無顯著性差異。Alcalase最適溫度在40～55℃范圍內(nèi)，溫度過高或過低都會影響酶活力。因此，選擇酶解溫度50℃進(jìn)行下一步試驗。

2.1.4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

配制底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、5%、6%、7%、8%的黑豆分離蛋白分散液，在加酶量4%、酶解溫度50℃、pH 9.5、酶解時間80 min條件下進(jìn)行酶解，測定酶解產(chǎn)物的抗氧化性及水解度，結(jié)果見圖4。

圖4 底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酶解產(chǎn)物的水解度和抗氧化性的影響

由圖4可知，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于5%時，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酶解產(chǎn)物的水解度和抗氧化性增加。根據(jù)酶促反應(yīng)原理[15]，底物濃度較小時，隨著底物濃度的增加，能夠被酶利用的底物增加，此時水解產(chǎn)生的肽段增多，因此·OH清除率升高。而當(dāng)?shù)孜餄舛冗^高時，由于體系濃度過高，使酶與底物的接觸面積減小，蛋白酶無法完全作用于底物，·OH清除率下降。因此，選擇底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2 Alcalase酶解黑豆分離蛋白正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以抗氧化性(·OH清除率)為指標(biāo)，以酶解時間、加酶量、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解溫度為考察因素，設(shè)計四因素三水平的正交試驗，正交試驗因素水平見表1，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

由表2可知，影響抗氧化性的因素主次順序為加酶量>酶解溫度>酶解時間>底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，各因素水平的最優(yōu)組合為A1B1C2D2，即酶解時間70 min、加酶量3%、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、酶解溫度55℃，在此條件下進(jìn)行驗證試驗，·OH清除率為21.62%。

2.3 超濾對黑豆分離蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響

對上述優(yōu)化條件下所得的酶解產(chǎn)物經(jīng)過超濾分級后，測定不同截留相對分子質(zhì)量的酶解產(chǎn)物的抗氧化性，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同相對分子質(zhì)量組分的黑豆分離蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化性

由圖5可知，超濾處理對黑豆分離蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化性影響較大。與未超濾酶解產(chǎn)物相比，相對分子質(zhì)量3～5 kDa和小于3 kDa組分的抗氧化性都有明顯增加。尤其是相對分子質(zhì)量小于3 kDa 的組分，與未超濾酶解產(chǎn)物相比，其·OH清除率由21.62%增加至29.54%，DPPH·清除率由9.06%增加至22.05%，還原力(OD值)由0.362增加至1.298。隨著相對分子質(zhì)量的減小，體系內(nèi)短肽鏈逐漸增多，能夠發(fā)揮抗氧化作用的端基逐漸暴露出來，因此抗氧化性明顯增強(qiáng)。

3 結(jié) 論

Alcalase酶解黑豆分離蛋白制備抗氧化肽的最優(yōu)條件為：加酶量3%，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，酶解溫度55℃，酶解時間70 min。在最優(yōu)條件下酶解產(chǎn)物對·OH清除率為21.62%；酶解產(chǎn)物的超濾分級組分表現(xiàn)出不同的抗氧化性，相對分子質(zhì)量小于3 kDa的組分抗氧化性最高，·OH清除率為29.54%，對DPPH·清除率為22.05%，還原力(OD值)為1.298。