趙曉敏 郭穎 李?yuàn)檴?李雯 崔洪艷 常穎

(天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院 產(chǎn)科、天津市人類發(fā)育與生殖調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300100)

NIPT(non-invasive prenatal testing, NIPT)，即利用母體外周血中胎兒游離細(xì)胞DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)進(jìn)行大規(guī)模平行測序[1, 2]。自從2011年NIPT正式引入臨床[3, 4]，其應(yīng)用價(jià)值就備受臨床醫(yī)生和科研人員的關(guān)注。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，目前NIPT的篩查范圍已不僅僅是常見染色體三體(21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征)，還包括性染色體非整倍體、罕見染色體異常以及特定微缺失、微重復(fù)綜合征的篩查[5]。然而，隨著篩查范圍的不斷擴(kuò)大，迫切需要大量數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)其臨床可行性[6, 7]。NIPT的準(zhǔn)確率受多種因素影響，統(tǒng)一的篩查標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格的質(zhì)控是NIPT應(yīng)用于臨床的重要前提。

隨著研究的不斷進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)染色體亞顯微結(jié)構(gòu)的缺失和重復(fù)并不少見，有報(bào)道指出在常見三體高風(fēng)險(xiǎn)而超聲結(jié)構(gòu)正常的胎兒中，有臨床意義的微缺失、微重復(fù)綜合征的發(fā)生率為1%～1.7%[8]。 微缺失、微重復(fù)綜合征在產(chǎn)前較難發(fā)現(xiàn)的原因分為以下兩點(diǎn)：①產(chǎn)前異常較為微小或者常規(guī)的產(chǎn)前超聲檢查難以發(fā)現(xiàn)，目前產(chǎn)前超聲異常小于40%是在中期超聲篩查中發(fā)現(xiàn)，而早期并無結(jié)構(gòu)異常發(fā)生；②不同于非整倍體，存在高齡等明確的危險(xiǎn)因素。大多數(shù)拷貝數(shù)變異(copy number variants，CNVs)缺乏明確的危險(xiǎn)因素。因此，目前將cffDNA用于微缺失、微重復(fù)綜合征的篩查對于產(chǎn)前遺傳咨詢專家和患者來說都面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

本研究的目的是對影響NIPT準(zhǔn)確性的相關(guān)因素進(jìn)行分析。明確其適用人群，加強(qiáng)質(zhì)量管理，進(jìn)一步提高其陽性預(yù)測值。

1 資料與方法

1.1 基本資料 選取2015年1月至2017年11月因胎兒NIPT結(jié)果異常(多家檢測公司)進(jìn)一步于天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院行羊膜腔穿刺進(jìn)行產(chǎn)前診斷的病例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①單胎、活胎妊娠；②羊水清亮，無混血；③父母無家族性遺傳性疾病、無血液系統(tǒng)傳播疾病及先天性免疫缺陷?。虎茏匀皇茉?，排除促排卵、胚胎移植等輔助生殖技術(shù)的妊娠。

1.2 研究方法 收集的數(shù)據(jù)包括人群的基本信息(身高、體重、 年齡、孕周、孕次、產(chǎn)次)，部分胎兒頸部透明層厚度、NIPT結(jié)果和羊膜腔穿刺結(jié)果。由于納入病例NIPT檢測公司不同，對于性染色體異常并無統(tǒng)一報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)，然而NIPT對于不同類型性染色體數(shù)目異常的檢出率并不相同，因此將NIPT結(jié)果分類為：常見染色體三體(21-三體、18-三體、13-三體)高風(fēng)險(xiǎn)、性染色體數(shù)目偏多、性染色體數(shù)目偏少、性染色體數(shù)目異常、罕見染色體異常,將產(chǎn)前診斷結(jié)果與產(chǎn)前篩查結(jié)果進(jìn)行對比分析。同時(shí)，研究孕婦年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)等因素是否影響篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 樣本分布分析 最終納入NIPT異常結(jié)果病例共441例，人群一般特征見表1。 對441例患者進(jìn)行羊膜腔穿刺產(chǎn)前診斷并對NIPT和羊膜腔穿刺結(jié)果進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，計(jì)算其真陽性(true positive,TP)例數(shù)，陽性預(yù)測值(positive predictive value, PPV)和假陽性率(false positive rate, FPR)(表2)，本研究對于真陽性例數(shù)的納入標(biāo)準(zhǔn)包括：①篩查結(jié)果與產(chǎn)前診斷結(jié)果完全相符；②診斷結(jié)果為高度嵌合(如：NIPT為13三體，而產(chǎn)前診斷結(jié)果為13三體的高度嵌合)；③部分相符：如NIPT結(jié)果為13三體，而產(chǎn)前診斷結(jié)果為三體中的一部分為13-三體。符合以上任意一項(xiàng)即為真陽性。真陰性病例則為NIPT與產(chǎn)前診斷結(jié)果完全不符。NIPT 21-三體高風(fēng)險(xiǎn)、18-三體高風(fēng)險(xiǎn)、13-三體高風(fēng)險(xiǎn)、性染色體數(shù)目偏多、性染色體數(shù)目偏少、性染色體數(shù)目異常、罕見染色體異常納入例數(shù)分別為149例、49例、24例、81例、53例、26例、59例，最終產(chǎn)前診斷確診的例數(shù)分別為116例(78.0%)、22例(45.05%)、5例(21.0%)、54例(67.0%)、9例(17.0%)、9例(35.0%)、7例(12.0%)。

隨著NIPT技術(shù)水平的不斷提高，罕見染色體異常正逐漸被納入其篩查范圍， 本研究中NIPT發(fā)現(xiàn)罕見染色體異常59例(染色體數(shù)目異?；蚩截悢?shù)變異)，產(chǎn)前診斷最終證實(shí)7例與篩查結(jié)果一致，準(zhǔn)確率較低，因此NIPT用于罕見染色體異常的篩查仍然需要進(jìn)一步研究。

2.2 孕婦年齡因素對于篩查結(jié)果準(zhǔn)確性的影響 為了進(jìn)一步探討年齡因素對于篩查結(jié)果準(zhǔn)確率的影響，將NIPT提示21-三體、18-三體、13-三體以及性染色體異常的441例患者根據(jù)年齡分為兩組：高齡組(≥35歲)和適齡組(18～34歲)，高齡組139例，羊膜腔穿刺核型分析最終結(jié)果39例為46，XN，100 例為染色體非整倍體且與篩查結(jié)果相符；適齡組243例，羊膜腔穿刺核型分析最終結(jié)果127例為46XN，116例為染色體非整倍體且與篩查結(jié)果相符(表3)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果最終P=0(P<0.05)，孕婦年齡與篩查準(zhǔn)確率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明高齡是影響NIPT準(zhǔn)確率的因素之一。此外，兩組間孕次、產(chǎn)次統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果P<0.05，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，對于年齡>35歲的妊娠婦女推薦直接進(jìn)行產(chǎn)前診斷，本研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果與我國母嬰保健法建議相一致。

2.3 孕婦BMI、胎兒頸項(xiàng)透明層厚度對于篩查結(jié)果準(zhǔn)確性的影響 為了研究孕婦BMI對于產(chǎn)前篩查準(zhǔn)確度的影響，我們隨機(jī)調(diào)查了187例孕婦的BMI(其中NIPT結(jié)果為常見染色體非整倍體或性染色體非整體的孕婦為105例)，根據(jù)BMI分類標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表4)。此外，本研究通過對比胎兒頸項(xiàng)透明層厚度(nuchal translucency, NT)，進(jìn)一步驗(yàn)證NIPT對于染色體非整倍體篩查的應(yīng)用價(jià)值。441例NIPT異?；颊咧须S機(jī)調(diào)查了48例患者的早期NT數(shù)據(jù)，其中6例NT≥3.0mm的患者產(chǎn)前診斷最終證實(shí)5例為非整倍體，且與NIPT結(jié)果相符，1例為46XN。42例NT小于3.0mm的患者產(chǎn)前診斷最終證實(shí)21例為46XN，21例為染色體非整倍體，且與NIPT結(jié)果相符(表5)，采用Fisher確切概率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P=0.199(P>0.05)，因此，本研究中48例患者NT值的差異NIPT準(zhǔn)確率的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 人群一般特征

表2 cffDNA與產(chǎn)前診斷結(jié)果

表3 孕婦年齡與NIPT準(zhǔn)確率的關(guān)系

注：由于NIPT用于罕見染色體異常的效果尚無確切數(shù)據(jù)，本表格中數(shù)據(jù)僅對NIPT提示21-三體高風(fēng)險(xiǎn)、18-三體高風(fēng)險(xiǎn)、13-三體高風(fēng)險(xiǎn)以及性染色體異常的病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

表4 孕婦BMI對于NIPT準(zhǔn)確率的影響

(注：表中數(shù)據(jù)僅對NIPT提示21-三體高風(fēng)險(xiǎn)、18-三體高風(fēng)險(xiǎn)、13-三體高風(fēng)險(xiǎn)以及性染色體異常的病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì))

表5 48例NIPT高風(fēng)險(xiǎn)患者NT值與產(chǎn)前診斷結(jié)果的關(guān)系

3 討論

染色體非整倍體是導(dǎo)致遺傳缺陷的主要原因，在活產(chǎn)兒中最常見的染色體非整倍體是21-三體(唐氏綜合征)，18-三體(Edwards綜合征)、13-三體(Patau綜合征)和性染色體非整倍體。大量研究表明，每800例新生兒中就有1例唐氏綜合征患兒[9]， 而且隨著二孩政策的開放，高齡產(chǎn)婦逐漸增多，染色體非整倍體的發(fā)生率逐漸增加，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)對于一位45歲的妊娠女性，胎兒發(fā)生21-三體綜合征的概率上升至1/35[10, 11].。 研究表明，NIPT對于21-三體和18-三體的敏感度高于99%，對于13-三體的敏感度為 78.6%～91.7%[12, 13]，而關(guān)于性染色體非整倍體敏感度的研究相對較少。本研究再一次驗(yàn)證了NIPT對于21-三體的準(zhǔn)確率最高(78.0%)，其次是18-三體(45.0%)，13-三體最低為21.0%。然而相對于大樣本研究數(shù)據(jù)，本研究中21-三體的準(zhǔn)確率仍然較低，分析其可能的原因主要為以下幾個(gè)方面：①NIPT檢測公司不同，其準(zhǔn)確率不同；②cffDNA的濃度受采血孕周的影響，孕周偏小會(huì)導(dǎo)致cffDNA濃度偏低，影響NIPT的準(zhǔn)確率，本研究中所納入病例的采血孕周未知；③孕婦年齡、BMI等也是影響cffDNA濃度以及NIPT準(zhǔn)確率的重要因素[14]，例如本研究中1例肥胖Ⅱ級和1例極度肥胖孕婦并不屬于進(jìn)行NIPT的適應(yīng)證，造成了假陽性的結(jié)果。因此，在產(chǎn)前篩查和診斷中應(yīng)該進(jìn)一步關(guān)注質(zhì)控問題，減少假陽性和假陰性率的發(fā)生，更好地提高NIPT在臨床應(yīng)用中的效力。近來，關(guān)于NIPT對于性染色體非整體準(zhǔn)確率較低的原因分析備受關(guān)注，可能的原因是NIPT篩查的遺傳信息即cffDNA，來源于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞而不是真正的胎兒細(xì)胞[15]。因此，當(dāng)存在性染色體的局限性胎盤嵌合時(shí)會(huì)造成NIPT假陰性或假陽性結(jié)果[16]。所以，這也是NIPT篩查相對于傳統(tǒng)核型分析的局限性之一。

目前將NIPT用于篩查微缺失、微重復(fù)綜合征引發(fā)熱議。不同于非整倍體篩查，大多數(shù)常見的微缺失、微重復(fù)綜合征不受年齡因素影響。有研究認(rèn)為，NIPT篩查特定的微缺失、微重復(fù)綜合征可以減少不必要的產(chǎn)前診斷以及減少臨床意義不明的CNVs出現(xiàn)，有效降低了遺傳咨詢的壓力，減少患者及家屬不必要的焦慮。然而值得提出的是，臨床中尚不能提供充足的數(shù)據(jù)以證明其敏感度、陽性預(yù)測值等。本研究中441例NIPT高風(fēng)險(xiǎn)中59例為罕見染色體數(shù)目異常或CNVs，產(chǎn)前診斷最終證實(shí)7例存在異常且與NIPT結(jié)果一致，4例存在異常但與NIPT結(jié)果不一致。 NIPT對于罕見染色體異常的準(zhǔn)確率較低，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)論一致[17]。由于本研究中例數(shù)較少且CNVs自身發(fā)生率較低，因此，尚不能說明NIPT用于這一領(lǐng)域的準(zhǔn)確性。此外，相關(guān)指南目前尚不推薦將NIPT用于篩查所有CNVs，僅用于特定的CNVs。因此，對于選擇NIPT進(jìn)行微缺失、微重復(fù)綜合征篩查的孕婦，應(yīng)告知NIPT技術(shù)目前的局限性，以便更好的進(jìn)行遺傳咨詢工作。

伴隨二孩政策的開放，高齡產(chǎn)婦逐漸增加。本研究中高齡孕婦占總體的35.8%，NIPT高風(fēng)險(xiǎn)的高齡組孕婦與適齡組孕婦發(fā)生染色體非整倍體的概率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P=0(P<0.05)。高齡組的染色體非整倍體發(fā)生率較適齡組高。因此，本研究認(rèn)為NIPT對于非整倍體產(chǎn)前篩查有著很大的優(yōu)勢，ACOG指南[18]指出NIPT適用于35歲以上所有孕婦,但是，我國目前尚無相關(guān)共識(shí)及指南,仍需大數(shù)據(jù)的積累,同時(shí)需考慮其經(jīng)濟(jì)成本效益。

總之，相對于傳統(tǒng)的篩查方法，NIPT有著更多的優(yōu)勢，而且隨著NIPT技術(shù)水平的不斷提高，其在產(chǎn)前篩查中會(huì)有著更加廣闊的應(yīng)用前景。當(dāng)然，這一技術(shù)帶來效益的同時(shí)，也對臨床工作帶來了極大的挑戰(zhàn)。在臨床中應(yīng)更加注重質(zhì)控問題，應(yīng)向患者及家屬告知NIPT篩查的局限性以及做好對篩查結(jié)果的遺傳咨詢工作[19]。 NIPT目前仍然主要用于常見染色體非整倍體以及性染色體異常的篩查。對于微缺失、微重復(fù)綜合征以及罕見染色體異常的篩查有待進(jìn)一步驗(yàn)證。需要說明的是，本研究例數(shù)較少，并且納入病例來源于多家NIPT檢測公司，仍然需要更多的數(shù)據(jù)進(jìn)行支持。