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        野生和栽培藍(lán)靛果中花色苷含量的測定及分析*

        2019-08-21 10:34:54齊會娟劉德文李中賓張利軍張春英
        特種經(jīng)濟動植物 2019年8期
        關(guān)鍵詞:大興安嶺地區(qū)藍(lán)靛矢車菊

        ●齊會娟 劉德文 李中賓 張利軍 張春英 高 尊

        (大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院 黑龍江 大興安嶺 165100)

        藍(lán)靛果(Lonicera caerulea L.var.edulis Turcz.exHerd.)是忍冬科忍冬屬藍(lán)果忍冬的變種。漿果味道酸甜可口,可生食,又可提供色素,亦可釀酒、作飲料和果醬,富含維生素、有機酸、抗壞血酸、糖類,果實中還含有豐富的活性物質(zhì),如單寧、花色苷、黃酮、皂苷等,具有降血壓、抗疲勞、保肝、心腦血管保護、抗菌、抗氧化、改善免疫功能、調(diào)節(jié)膽固醇等藥理作用[1,2],有極高的藥用價值。據(jù)報道,藍(lán)靛果花色苷可降低乙醇對肝臟所造成的損傷[3],藍(lán)靛果花色苷通過提高高脂血癥大鼠肝臟內(nèi)LXR、CYP7a1 m RNA表達,降低PPARmRNA表達來調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的血脂水平,預(yù)防動脈硬化的發(fā)生[4],因此花色苷除了作為食用色素外,它還對人類的腫瘤、衰老、心血管病等疾病的預(yù)防與治療有重要的意義[5];藍(lán)靛果忍冬相較于其他植物含有更為豐富的花色苷,因而受到各國學(xué)者的高度重視[6],但是藍(lán)靛果果實中有益于健康的活性物質(zhì)的含量與其生長環(huán)境、地理位置密切相關(guān),不同的生長環(huán)境果實中的花色苷含量不同[7]。本文以大興安嶺地區(qū)同一資源圃中野生藍(lán)靛果、栽培藍(lán)靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB為材料,采用pH示差法、O.D.法和高效液相色譜法對9 種漿果中的總花色苷進行測定,并進行對比分析,擬為進一步開發(fā)利用大興安嶺地區(qū)藍(lán)靛果漿果資源提供數(shù)據(jù)支撐。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 材料 大興安嶺地區(qū)野生藍(lán)靛果、栽培藍(lán)靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB(2018年6月20日采摘于大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院實驗基地藍(lán)靛果資源圃),放置于 20℃冰箱中保存。

        標(biāo)準(zhǔn)品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(Cy3G)(美國Chromadex);色譜純乙腈、甲醇(J&K.SCITIFIC LTD.北京百靈威科技有限公司),色譜純甲酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鉀、醋酸鈉等均為分析純。

        1.1.2 儀器設(shè)備 765 紫外可見分光光度計(INESA),上海精密科學(xué)儀器有限公司;BA110S精密電子天平,Sartorius儀器(上海)有限公司;UP-30 純水機,上海本昂科學(xué)儀器有限公司;沃特世e2695 高效液相色譜儀(Waters);VOSHIN-1000DW超聲細(xì)胞破碎儀,無錫沃信儀器有限公司;DS-1 高速組織搗碎機,上海精科實業(yè)有限公司。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 藍(lán)靛果果實花色苷的提取 準(zhǔn)確稱取勻漿后的樣品5g于150mL燒杯中,加入95%的乙醇:1.5mol/L的鹽酸為85:15(體積比)的提取劑100mL,靜止30min后,超聲15min兩次,合并抽濾液轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶,濾渣加入30~40mL提取劑浸提3~4 次,過濾洗滌后用提取劑定容至250mL[8]。

        1.2.2 O.D.法測定總花色苷含量 準(zhǔn)確移取1.2.1 中提取液稀釋25 倍后在波長535nm處測定吸光值[8],計算公式如下:

        總花色苷含量 (mg/100g)=OD×DV×100×TEV/CrW×1/98.2

        式中,OD為稀釋后溶液的吸光值;DV為稀釋倍數(shù);TEV為提取液總體積;CrW為樣品質(zhì)量(g)。

        1.2.3 pH示差法測定總花色苷含量

        1.2.3.1 緩沖液的配制。pH1.0 緩沖液:精密稱取1.49g氯化鉀,用蒸餾水定容至100mL,精密量取1.7mL鹽酸,用蒸餾水定容至100mL;將0.2mol/L氯化鉀與0.2mol/L鹽酸按體積比25:67 的比例混合,用氯化鉀溶液調(diào)節(jié)pH(1.0±0.1)。pH4.5 緩沖液:精密稱取1.64g乙酸鈉,用蒸餾水定容至100mL,用鹽酸調(diào)節(jié)pH(4.5±0.1)。

        1.2.3.2 總花色苷含量測定方法。根據(jù)花色苷在pH1.0 時,在 520nm波長處有最大光吸收,而在pH4.5 時,花色苷轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色查爾酮形式,在520nm波長處無吸收,所以可以利用pH示差法計算溶液中總花色苷的含量。準(zhǔn)確移取1.2.1 中的提取液樣品1mL 2 份,將pH1.0 的氯化鉀和pH4.5 的醋酸鈉緩沖溶液分別定容至10mL,放置2h,在520nm和700nm處分別測定其吸光度,計算總花色苷含量(以矢車菊素-3-葡萄糖苷表示)[9]。計算公式如下:

        總花色苷含量(mg/100g)=(A×V×n×M)/( ×m)×100

        式中,A=pH 1.0-pH4.5;V為提取液總體積;n為稀釋倍數(shù);M為矢車菊-3-葡萄糖苷(Cy-3-Glu)的相對分子質(zhì)量 (449);為Cy-3-Glu的消光系數(shù) (29 600);m為樣品質(zhì)量(g)。

        1.2.4 HPLC法測定總花色苷含量

        1.2.4.1 色譜條件。色譜柱為島津C18 柱,4.6mm(內(nèi)徑)×250mm(長)×5m(粒徑)?;ㄇ嗨兀òɑㄇ嗨剀蘸突ㄇ嗨剀赵┑臋z測波長為525nm。流動相組成為,A相:乙腈:甲醇=85:15;B相:10%甲酸水溶液。洗脫比例為:0min,8%A;15min,25%A;20min,8%A。柱溫35℃,流速0.8mL/min,進樣體積10L,采用waters 2489 UV檢測器,用empower(3.0 版本)軟件分析[10]。

        1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)系列。準(zhǔn)確稱取矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品用2%的甲酸甲醇溶液定容稀釋至濃度為0.5mg/mL,分別稀釋至濃度為0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.03125mg/mL。

        1.2.4.3 樣品分析。取1.2.1 中提取液過0.45m濾膜后,按照1.2.4.1 中色譜條件進樣。通過檢測出的總峰面積與已知標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積進行比對,計算出相對于標(biāo)準(zhǔn)品Cy3G的總花色苷含量和對應(yīng)的矢車菊素-3-葡萄糖苷的含量。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        采用Excel 2010 對上述數(shù)據(jù)進行處理,所有指標(biāo)均進行了3 次平行樣測定。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 花色苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

        見圖1、圖2和圖3。

        圖1 標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

        以5 個濃度系列為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)得到峰1 和峰2 對應(yīng)的兩個擬合方程如下:

        兩個方程擬合系數(shù)R2均接近于1,適合用于各藍(lán)靛果樣品中對總花色苷含量和對應(yīng)的矢車菊素-3-葡萄糖苷的含量的計算。

        圖中由上往下依次為野生藍(lán)靛果、栽培藍(lán)靛果DN-2、BLY、DN-3、BL、EF、ED、RB、DN-1、矢車菊-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)(Cy3G)譜圖。

        圖2 不同品種藍(lán)靛果果實中花色苷高效液相色譜法定量譜圖對比

        圖3 不同品種藍(lán)靛果果實中花色苷高效液相色譜法重疊譜圖

        由圖2、圖3 可以看出9 種藍(lán)靛果果實中都有矢車菊-3-葡萄糖苷單體,各種果實的色譜圖中看出峰的個數(shù)不同,野生藍(lán)靛果、栽培藍(lán)靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中峰的個數(shù)分別為 8、11、9、8、9、8、7、3、4,因此各種果實中花色苷種類不同。

        2.2 藍(lán)靛果果實中總花色苷比較分析

        見表1。

        表1 藍(lán)靛果果實中總花色苷比較分析

        由表1 可以看出,采用O.D.法測定野生藍(lán)靛果、栽培藍(lán)靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中總花色苷含量按照含量高低排序為DN-1 >BLY>BL>EF>DN-2 >DN-3 >野生藍(lán)靛果>ED>RB;采用pH示差法測定野生藍(lán)靛果、栽培藍(lán)靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中總花色苷含量按照含量高低排序為DN-1>BLY>BL>EF>DN-3 >DN-2 >野生藍(lán)靛果>ED>RB;采用HPLC法測定野生藍(lán)靛果、栽培藍(lán)靛果BLY、DN-1、DN-2、DN-3、BL、EF、ED、RB中總花色苷含量按照含量高低排序為DN-1 >BLY>DN-3 >野生藍(lán)靛果>DN-2 >BL>EF>ED>RB;矢車菊-3-葡萄糖苷含量按照含量高低排序為DN-1>BLY>DN-3 >野生藍(lán)靛果>DN-2 >BL>EF>ED>RB;其中矢車菊-3-葡萄糖苷含量分別占pH示差法測定總花色苷含量的96.44%、70.77%、72.32%、48.34%、73.90%、35.99%、33.47%、27.83%、30.23%,按照比率高低排序為野生藍(lán)靛果>DN-3 >DN-1 >BLY>DN-2 >BL>EF>RB>ED;矢車菊-3-葡萄糖苷含量分別占HPLC法測定總花色苷含量的 76.24%、68.86%、74.25%、73.08%、73.47%、73.63%、74.35%、71.06%、65.32%,按照比率高低排序為野生藍(lán)靛果>EF>DN-1 >BL>DN-3 >DN-2 >ED>BLY>RB。

        同時采用3 種方法測定,栽培品種DN-1 每百克中總花色苷和矢車菊-3-葡萄糖苷的含量最高分別為502.991mg、363.75mg,其中矢車菊-3-葡萄糖苷占總花色苷含量的72.32%,與其他8 種藍(lán)靛果相比差異極顯著;栽培品種RB每百克中總花色苷和矢車菊-3-葡萄糖苷的含量最低分別為 118.109mg、35.70mg,其中矢車菊-3-葡萄糖苷占總花色苷含量的30.23%。因此栽培品種DN-1 從花色苷含量角度來看有較高的營養(yǎng)價值,野生藍(lán)靛果居中,而RB營養(yǎng)價值較低。

        圖4 藍(lán)靛果果實中不同方法測定花色苷含量對比

        由圖4 可以看出,同一樣品用PH示差法測定藍(lán)靛果中總花色苷含量數(shù)值高于O.D.法測定結(jié)果,不同品種藍(lán)靛果中矢車菊-3-葡萄糖苷的含量各不相同,矢車菊-3-葡萄糖苷的含量占pH示差法測定總花色苷含量的比率也各不相同,不成正比例關(guān)系;矢車菊-3-葡萄糖苷的含量占HPLC法測定總花色苷含量的比率相近,最大差值為10.93%;根據(jù)HPLC總面積法測定野生藍(lán)靛果總花色苷含量高于PH示差法和O.D.法,測定栽培品種BLY、DN-1 和DN-3 中總花色苷含量與PH示差法基本一致,測定栽培品種DN-2、BL、EF、ED和RB中總花色苷含量均低于PH示差法和O.D.法,同時采用三種方法測定栽培品種ED和RB中總花色苷含量和矢車菊-3-葡萄糖苷單體含量都是最低的。EF、ED和RB中PH示差法和O.D.法測定總花色苷含量結(jié)果基本一致,均高于HPLC法;因此,O.D.法不適用于測定總花色苷和矢車菊-3-葡萄糖苷含量高的果實。3 種方法測定結(jié)果的差異性可能與果實中色素和花色苷單體種類不同有關(guān)。

        3 結(jié)論

        大興安嶺地區(qū)每百克野生藍(lán)靛果中花色苷含量為273.25mg,高于伊春地區(qū)野生藍(lán)靛果的花色苷含量174.220mg[11],大興安嶺地區(qū)栽培品種DN-1 中每百克花色苷含量為502.991mg,高于黑河栽培品種“加洛奇卡”花色苷含量322.64mg[12],說明大興安嶺地區(qū)特殊的地理位置有利于藍(lán)靛果樹種中活性物質(zhì)花色苷的積累;同時采用PH示差法、O.D.法和高效液相色譜法測定各品種之間總花色苷含量差異性顯著,花色苷含量豐富的果實宜采用PH示差法測定。栽培品種DN-1 中總花色苷含量最高,RB中總花色苷含量最低;為大興安嶺地區(qū)藍(lán)靛果的開發(fā)和利用提供了數(shù)據(jù)支撐,而每個品種中花色苷的具體類型是需要再進一步研究的課題。

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