任節(jié)紅 (上海市崇明區(qū)林業(yè)站 202150)
上海地區(qū)是我國適合柑橘栽培的最北緣地區(qū),現(xiàn)有柑橘種植面積約4 000 hm2,主要集中在崇明三島。近年來,柑橘黑點病(也稱樹脂病、砂皮?。┰谏虾5貐^(qū)的發(fā)生逐年加重,已成為影響當(dāng)?shù)馗涕俟焚|(zhì)量和商品價值的最主要病害。為了解上海市柑橘黑點病侵染來源,從而為黑點病的防治提供科學(xué)依據(jù),筆者于2013—2014年進(jìn)行上海地區(qū)柑橘黑點病發(fā)生現(xiàn)狀與侵染來源分析。現(xiàn)將相關(guān)結(jié)果報道如下。
柑橘是南方地區(qū)最主要的水果之一,主要栽培于長江以南各省(市),上海地區(qū)是適合柑橘栽培的最北緣地區(qū)。上海市柑橘生產(chǎn)主要集中在崇明三島,其柑橘種植面積占全市種植總面積的80%以上,在南匯、奉賢、金山、青浦等區(qū)也有一定的種植面積。據(jù)統(tǒng)計,2012 年,上海市柑橘投產(chǎn)總面積達(dá)7 000 hm2,總產(chǎn)量為2.13×105t,總產(chǎn)值達(dá)2.5 億元。
目前,上海地區(qū)柑橘栽植品種主要為溫州蜜柑早熟品種“宮川”,其他還有少量“宮本”“興津”“尾張”等品種種植;柑橘樹的樹齡大多在20~30年之間,樹齡較老,橘樹株行距多為3 m×3.5 m、3 m×3 m,也有少數(shù)株行距為2 m×2.5 m。上海地區(qū)橘園土質(zhì)為黃夾沙土,橘園防風(fēng)林帶多為水杉和法國冬青,但大多數(shù)橘園田間管理粗放,病枝、枯枝隨處可見,病害普遍發(fā)生。
近年來,柑橘黑點病在上海地區(qū)的發(fā)生逐年加重,如1999年上海地區(qū)柑橘黑點病大發(fā)生,2009年崇明區(qū)長興島前衛(wèi)農(nóng)場的柑橘黑點病再度大面積發(fā)生,2012年崇明三島柑橘黑點病全面爆發(fā),果實平均感病率在30%左右,果實商品價值大大降低。
2.1.1 橘園取樣
為明確柑橘樹體各部位及橘園周邊防護(hù)林上柑橘黑點病的侵染來源,選擇上海前衛(wèi)柑橘公司的常年柑橘黑點病發(fā)生嚴(yán)重的橘園及其周邊防護(hù)林。于2014 年6 月29 日進(jìn)行采樣,采樣對象為:CA,“宮川”病葉;CB,枳枯枝,CC,“宮川”葉;CD,香樟枯枝;CE,法國冬青枯枝;CF,水杉枯枝;CG,“宮川”花;CH,“宮川”病樹皮;CI,“宮川”枯枝;CJ,“宮川”幼果。將采集的10 種樣本,按照DNA提取方法獲得DNA,用于后續(xù)檢測。
2.1.2 DNA 提取方法
鑒于腐生微生物和病原菌均存在于植物體表,選取樣本各200 g,每個樣本各2 份;每份加2 mL去離子無菌水,室溫下浸泡30 min;在旋渦振蕩器上振蕩10 min;收集液體1000 μL;選用真核生物DNA 試劑盒(廣州美基生物科技有限公司),按照手冊DNA提取方法提取總的DNA,定容至50 μL;取1 μL 進(jìn)行電泳檢測,標(biāo)記含量;其余放置在-80℃的低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
2.1.3 引物設(shè)計
柑橘黑點病的病原是柑橘間座殼菌[1]。按照Feng Huang、D. Udayanga、R.R. Gomes 等人所用引物設(shè)計引物(分別以病菌的延伸因子EF 基因、微管蛋白tubulin 基因、16SRNA 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)為靶標(biāo)設(shè)計引物),主要檢測柑橘黑點病病菌的16 SRNA 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)。見表1。
表1 柑橘黑點病病菌PCR檢測所用引物
2.1.4 PCR 體系
按照表2 中PCR 體系進(jìn)行基因PCR 擴(kuò)增;PCR儀購自德國eppendorf公司;PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,52 ℃復(fù)性30 min,℃,再倒入加有適量EB 的模具中,攪拌均勻,插入塑料梳子,自然冷卻約30 min后,取出樣孔梳,將凝膠置于盛有相同濃度的TAE 緩沖液的電泳槽中,將DNA 樣品與適量6×Loading Buffer 混合,吸取適量加入點樣孔,電泳至溴酚藍(lán)帶移到凝膠的2/3處,取出凝膠,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并用刀片切下所需要的條帶。
表2 柑橘黑點病病菌PCR體系
圖1 柑橘“宮川”及周邊防護(hù)林柑橘黑點病病菌的DNA凝膠電泳結(jié)果
由圖1 可知,來源于柑橘“宮川”病葉(CA)、香樟枯枝(C D)、法國冬青枯枝(C E)、水杉枯枝(CF)、“宮川”花(CG)、“宮川”病皮(CH)和“宮川”枯枝(CI)的gDNA的PCR電泳結(jié)果可看出明顯的gDNA 條帶,其中“宮川”花(CG)來源的gDNA 含量豐富,而“宮川”幼果(CJ)幾乎看不出有明顯的gDNA 條帶。這表明凡是gDNA 條帶明顯的樣品,均有可能含有柑橘黑點病病菌。
以上述樣品的gDNA 為模板,以病菌的延伸因子EF 基因為靶標(biāo)設(shè)計引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。由圖1可知,在500 bp 位置僅顯示香樟枯枝(CD)、法國冬青枯枝(CE)、“宮川”花(CG)和“宮川”枯枝(CI)有PCR 產(chǎn)物,而且條帶大小不一。同時,測序顯示,僅“宮川”枯枝(CI)的PCR 產(chǎn)物吻合柑橘黑點病病菌EF基因的序列。這表明,以病菌的延伸因子EF 基因為靶標(biāo),采用PCR 檢測不同樣品的柑橘黑點病病菌存在與否,并不是有效的檢測方法。
以上述樣品的gDNA 為模板,以病菌的微管蛋白tubulin 基因設(shè)計引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。由圖1 可知,在500 bp大小處顯示條帶的樣本有柑橘“宮川”病葉(CA)、枳枯枝(CB)、“宮川”葉(CC)、香樟枯枝(CD)、法國冬青枯枝(CE)、水杉枯枝(CF)、“宮川”花(CG)、“宮川”病皮(CH)和“宮川”枯枝(CI),同時,460 bp 處的條帶經(jīng)測序,顯示為不正確條帶。這表明,除健康幼果外,均可從樣72 ℃延伸30~60 s,32 個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。
2.1.5 DNA 凝膠電泳
采用1%的瓊脂糖凝膠電泳,即在100 mL 1 000倍的TAE 緩沖液中加入瓊脂糖1.0 g,在微波爐中高火條件下加熱2~3 min至沸騰,并使瓊脂糖凝膠充分溶解至溶液澄清,然后在室溫下冷卻至約60本中檢測出柑橘黑點病病菌。因此,無論是柑橘還是防護(hù)林,其殘體部分均是柑橘黑點病的侵染來源。
以上述樣品的g DNA為模板,以病菌的1 6 SRNA 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)為靶點設(shè)計引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。由圖1可知,在550 bp處均能顯示條帶,而大于550 bp的條帶經(jīng)測序驗證是非特異性條帶。這表明,除健康幼果外,均可從樣本中檢測出柑橘黑點病病菌。由此說明,柑橘黑點病的侵染來源主要是來自柑橘及周邊防護(hù)林的枯枝[2-4]。
PCR 檢測結(jié)果表明:在被檢測的樣本中,除柑橘幼果外,均能檢測到柑橘黑點病病菌,說明柑橘黑點病的侵染來源主要來自柑橘及周邊防護(hù)林的枯枝。因此,在控制柑橘黑點病的發(fā)生和流行時,應(yīng)注意對橘園及其周邊環(huán)境的病害防治。
雖然PCR 檢測結(jié)果表明柑橘及其周邊防護(hù)林的枯枝是構(gòu)成柑橘黑點病的侵染來源,但該結(jié)論仍需進(jìn)一步的活體試驗來證實。例如,應(yīng)從這些殘體中分離到病原菌,并經(jīng)柯赫氏法則驗證致病性,方能最終確定侵染來源。