任節(jié)紅 （上海市崇明區(qū)林業(yè)站 202150）

上海地區(qū)是我國適合柑橘栽培的最北緣地區(qū)，現(xiàn)有柑橘種植面積約4 000 hm2，主要集中在崇明三島。近年來，柑橘黑點?。ㄒ卜Q樹脂病、砂皮?。┰谏虾５貐^(qū)的發(fā)生逐年加重，已成為影響當?shù)馗涕俟焚|(zhì)量和商品價值的最主要病害。為了解上海市柑橘黑點病侵染來源，從而為黑點病的防治提供科學(xué)依據(jù)，筆者于2013—2014年進行上海地區(qū)柑橘黑點病發(fā)生現(xiàn)狀與侵染來源分析?，F(xiàn)將相關(guān)結(jié)果報道如下。

1 上海地區(qū)柑橘黑點病發(fā)生現(xiàn)狀

柑橘是南方地區(qū)最主要的水果之一，主要栽培于長江以南各?。ㄊ校?，上海地區(qū)是適合柑橘栽培的最北緣地區(qū)。上海市柑橘生產(chǎn)主要集中在崇明三島，其柑橘種植面積占全市種植總面積的80%以上，在南匯、奉賢、金山、青浦等區(qū)也有一定的種植面積。據(jù)統(tǒng)計，2012 年，上海市柑橘投產(chǎn)總面積達7 000 hm2，總產(chǎn)量為2.13×105t，總產(chǎn)值達2.5 億元。

目前，上海地區(qū)柑橘栽植品種主要為溫州蜜柑早熟品種“宮川”，其他還有少量“宮本”“興津”“尾張”等品種種植；柑橘樹的樹齡大多在20～30年之間，樹齡較老，橘樹株行距多為3 m×3.5 m、3 m×3 m，也有少數(shù)株行距為2 m×2.5 m。上海地區(qū)橘園土質(zhì)為黃夾沙土，橘園防風(fēng)林帶多為水杉和法國冬青，但大多數(shù)橘園田間管理粗放，病枝、枯枝隨處可見，病害普遍發(fā)生。

近年來，柑橘黑點病在上海地區(qū)的發(fā)生逐年加重，如1999年上海地區(qū)柑橘黑點病大發(fā)生，2009年崇明區(qū)長興島前衛(wèi)農(nóng)場的柑橘黑點病再度大面積發(fā)生，2012年崇明三島柑橘黑點病全面爆發(fā)，果實平均感病率在30%左右，果實商品價值大大降低。

2 上海地區(qū)柑橘黑點病侵染來源分析

2.1 試驗方法

2.1.1 橘園取樣

為明確柑橘樹體各部位及橘園周邊防護林上柑橘黑點病的侵染來源，選擇上海前衛(wèi)柑橘公司的常年柑橘黑點病發(fā)生嚴重的橘園及其周邊防護林。于2014 年6 月29 日進行采樣，采樣對象為：CA，“宮川”病葉；CB，枳枯枝，CC，“宮川”葉；CD，香樟枯枝；CE，法國冬青枯枝；CF，水杉枯枝；CG，“宮川”花；CH，“宮川”病樹皮；CI，“宮川”枯枝；CJ，“宮川”幼果。將采集的10 種樣本，按照DNA提取方法獲得DNA，用于后續(xù)檢測。

2.1.2 DNA 提取方法

鑒于腐生微生物和病原菌均存在于植物體表，選取樣本各200 g，每個樣本各2 份；每份加2 mL去離子無菌水，室溫下浸泡30 min；在旋渦振蕩器上振蕩10 min；收集液體1000 μL；選用真核生物DNA 試劑盒(廣州美基生物科技有限公司)，按照手冊DNA提取方法提取總的DNA，定容至50 μL；取1 μL 進行電泳檢測，標記含量；其余放置在-80℃的低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 引物設(shè)計

柑橘黑點病的病原是柑橘間座殼菌[1]。按照Feng Huang、D. Udayanga、R.R. Gomes 等人所用引物設(shè)計引物（分別以病菌的延伸因子EF 基因、微管蛋白tubulin 基因、16SRNA 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)為靶標設(shè)計引物），主要檢測柑橘黑點病病菌的16 SRNA 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)。見表1。

表1 柑橘黑點病病菌PCR檢測所用引物

2.1.4 PCR 體系

按照表2 中PCR 體系進行基因PCR 擴增；PCR儀購自德國eppendorf公司；PCR擴增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，52 ℃復(fù)性30 min，℃，再倒入加有適量EB 的模具中，攪拌均勻，插入塑料梳子，自然冷卻約30 min后，取出樣孔梳，將凝膠置于盛有相同濃度的TAE 緩沖液的電泳槽中，將DNA 樣品與適量6×Loading Buffer 混合，吸取適量加入點樣孔，電泳至溴酚藍帶移到凝膠的2/3處，取出凝膠，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并用刀片切下所需要的條帶。

表2 柑橘黑點病病菌PCR體系

2.2 結(jié)果與分析

圖1 柑橘“宮川”及周邊防護林柑橘黑點病病菌的DNA凝膠電泳結(jié)果

由圖1 可知，來源于柑橘“宮川”病葉（CA）、香樟枯枝(C D)、法國冬青枯枝(C E)、水杉枯枝（CF）、“宮川”花（CG）、“宮川”病皮（CH）和“宮川”枯枝（CI）的gDNA的PCR電泳結(jié)果可看出明顯的gDNA 條帶，其中“宮川”花（CG）來源的gDNA 含量豐富，而“宮川”幼果（CJ）幾乎看不出有明顯的gDNA 條帶。這表明凡是gDNA 條帶明顯的樣品，均有可能含有柑橘黑點病病菌。

以上述樣品的gDNA 為模板，以病菌的延伸因子EF 基因為靶標設(shè)計引物進行PCR 擴增。由圖1可知，在500 bp 位置僅顯示香樟枯枝（CD）、法國冬青枯枝（CE）、“宮川”花（CG）和“宮川”枯枝（CI）有PCR 產(chǎn)物，而且條帶大小不一。同時，測序顯示，僅“宮川”枯枝（CI）的PCR 產(chǎn)物吻合柑橘黑點病病菌EF基因的序列。這表明，以病菌的延伸因子EF 基因為靶標，采用PCR 檢測不同樣品的柑橘黑點病病菌存在與否，并不是有效的檢測方法。

以上述樣品的gDNA 為模板，以病菌的微管蛋白tubulin 基因設(shè)計引物進行PCR 擴增。由圖1 可知，在500 bp大小處顯示條帶的樣本有柑橘“宮川”病葉（CA）、枳枯枝（CB）、“宮川”葉（CC）、香樟枯枝(CD)、法國冬青枯枝(CE)、水杉枯枝（CF）、“宮川”花（CG）、“宮川”病皮（CH）和“宮川”枯枝（CI），同時，460 bp 處的條帶經(jīng)測序，顯示為不正確條帶。這表明，除健康幼果外，均可從樣72 ℃延伸30～60 s，32 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

2.1.5 DNA 凝膠電泳

采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，即在100 mL 1 000倍的TAE 緩沖液中加入瓊脂糖1.0 g，在微波爐中高火條件下加熱2～3 min至沸騰，并使瓊脂糖凝膠充分溶解至溶液澄清，然后在室溫下冷卻至約60本中檢測出柑橘黑點病病菌。因此，無論是柑橘還是防護林，其殘體部分均是柑橘黑點病的侵染來源。

以上述樣品的g DNA為模板，以病菌的1 6 SRNA 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)為靶點設(shè)計引物進行PCR 擴增。由圖1可知，在550 bp處均能顯示條帶，而大于550 bp的條帶經(jīng)測序驗證是非特異性條帶。這表明，除健康幼果外，均可從樣本中檢測出柑橘黑點病病菌。由此說明，柑橘黑點病的侵染來源主要是來自柑橘及周邊防護林的枯枝[2-4]。

2.3 結(jié) 論

PCR 檢測結(jié)果表明：在被檢測的樣本中，除柑橘幼果外，均能檢測到柑橘黑點病病菌，說明柑橘黑點病的侵染來源主要來自柑橘及周邊防護林的枯枝。因此，在控制柑橘黑點病的發(fā)生和流行時，應(yīng)注意對橘園及其周邊環(huán)境的病害防治。

雖然PCR 檢測結(jié)果表明柑橘及其周邊防護林的枯枝是構(gòu)成柑橘黑點病的侵染來源，但該結(jié)論仍需進一步的活體試驗來證實。例如，應(yīng)從這些殘體中分離到病原菌，并經(jīng)柯赫氏法則驗證致病性，方能最終確定侵染來源。