王 悅,楊貝貝,王 浩,楊 程,張 菊,朱 濛,楊如意

1 安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 蕪湖 241002 2 安徽省水土污染治理與修復(fù)工程實驗室, 蕪湖 241002

丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)是唇形科(Lamiaceae)鼠尾草屬的一種多年生草本植物,以干燥的根和根狀莖入藥(Danshen)。丹參是一味常用的傳統(tǒng)中藥材,對冠心病、心膠痛、心肌梗死和高血壓等心血管系統(tǒng)疾病具有顯著療效[1],其植株浸提液還具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤和抗炎癥等功能[2- 5]。丹參屬大宗中藥材,市場需求量大,但野生資源稀缺,適宜人工栽培的道地產(chǎn)區(qū)也非常有限,導(dǎo)致其栽培地重茬連作現(xiàn)象十分普遍。長期連作造成丹參枯萎病、根腐病、根結(jié)線蟲病加劇,生長勢減弱,黃苗、死苗、裂根等現(xiàn)象嚴重,有效成分含量和商品率逐年下降,產(chǎn)生連作障礙(continuous cropping obstacles)[6]。連作障礙在人參(PanaxginsengC. A. Meyer)、地黃(Rehmanniaglutinosa(Gaetn.) Libosch. ex Fisch. et Mey.)、三七(Panaxnotoginseng(Burk.) F.H. Chen)、黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、當(dāng)歸(Angelicasinensis(Oliv.) Diels)等其他中藥材栽培過程中也普遍存在,且影響非常嚴重。因此,研究連作障礙的發(fā)生機理對于提出合理有效的消減措施,保障中藥材生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展和藥材資源供應(yīng)的安全性具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

丹參連作障礙的發(fā)生機理十分復(fù)雜,包括化感自毒作用、根際理化環(huán)境失衡,以及微生物區(qū)系的變化[7- 8]等。近年來,從植物-土壤-微生物組成的根際微生態(tài)系統(tǒng)探討連作障礙的成因和消減措施已成為一個新的研究思路和重要的發(fā)展趨勢[9- 11]。丹參根際次生代謝物的產(chǎn)生與釋放,以及在環(huán)境介質(zhì)中的遷移、轉(zhuǎn)化、降解等過程與根際微生物之間存在密切的相互作用。研究發(fā)現(xiàn),蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、叢枝菌根真菌(Glomusmosseae)和內(nèi)生菌等不僅能夠促進丹參根系的生長,而且會誘導(dǎo)其產(chǎn)生更多丹參酮和丹酚酸B[12- 14]。但是,連作條件下大量次生代謝物的積累將改變土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu),使根際微生態(tài)系統(tǒng)失衡,從而對植物產(chǎn)生負反饋[15]。已有研究證實,丹參酮和丹酚酸B等均具有很強的抑菌作用[2,16],會導(dǎo)致根際放線菌和真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化[8],有益微生物數(shù)量減少,致病菌增加,使丹參更易受病原菌侵染,抗逆性降低[9, 17]。在農(nóng)林生產(chǎn)實踐中,輪作、間作、套作可以有效緩解連作障礙,這與植物根系之間的地下化學(xué)作用有關(guān)[18],但相關(guān)的微生態(tài)機理尚不清楚。

安徽省亳州市是國家科技部批準建立的中藥特色產(chǎn)業(yè)基地,具有多年從事丹參栽培和加工的歷史。本課題組于2016年6月調(diào)研發(fā)現(xiàn),連作兩年以上丹參即出現(xiàn)黃苗和枯萎現(xiàn)象(枯苗率10%—20%),產(chǎn)量和品質(zhì)嚴重下降,與玄參(ScrophularianingpoensisHemsl.)、桔梗(Platycodonisradix)等其他根類藥材實行輪作方可緩解(枯苗率<5%)。本研究通過高通量測序?qū)Ρ确治隽溯喿?、連作、套作3種栽種模式下丹參根際微生物群落的變化,嘗試從微生態(tài)系統(tǒng)的變化闡明丹參連作障礙的發(fā)生機理,為緩解這一重大生產(chǎn)難題,加快建立道地中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范化(Good Agricultural Practice, GAP)基地提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣點概況和樣品采集

本研究采樣點位于安徽省亳州市譙城區(qū)十八里鎮(zhèn)的一處中藥材種植基地(33°52′48″N, 115°46′12″E)。該地位于皖豫交界處,地勢平坦,屬于暖溫半濕潤季風(fēng)性氣候,雨熱同季,年均降水量約821.3 mm,年均氣溫約14.9℃,年均日照約2184 h。土壤質(zhì)地屬沙質(zhì)或沙淤兩合土質(zhì),種植有丹參、白芍(PaeonialactifloraPall.)、桑(MorusalbaL.)、桔梗、亳菊(Chrysanthemummorifoliumcv. Boju)等中藥材,種植歷史悠久。

本研究采集的丹參包括3種種植模式：即與桔梗輪作1年(rotation cropping monoculture, RCMO),連作2年(continuous cropping monoculture, CCMO)和與白芍連續(xù)套作2年(intercropping mix-culture, ICMI)。輪作或連作丹參的密度約為112500—120000株/hm2,套作丹參的密度約為60000株/hm2,白芍密度約為45000株/hm2。白芍種植時間為10月,次年3—4月套作丹參。

每種種植模式隨機選取3個面積為2 m×2 m的樣方,將樣方內(nèi)的丹參整株取出,采用抖根法收集根際土壤,同一樣方內(nèi)的土樣混合均勻作為一個混合樣,所有土壤樣品立即帶回實驗室,4℃冰箱保存?；靹虻耐翗右徊糠诛L(fēng)干保存,測定土壤理化性質(zhì),另一部分新鮮土壤用于提取微生物總DNA進行高通量測序。

1.2 實驗方法

1.2.1土壤理化性質(zhì)測定

稱取過1 mm篩孔的風(fēng)干土10 g,加入1 mol/L的KCl溶液25 mL(土水比為1∶2.5),搖勻30 min后用pH計測定土壤pH。土壤氧化還原電位(oxidation reduction potential, ORP)采用鉑電極法測定。土壤有機質(zhì)采用K2Cr2O7-H2SO4稀釋熱法測定[19]。土壤全磷和速效磷濃度分別采用H2SO4-HClO4消解和HCl-H2SO4浸提,鉬銨藍比色法進行測定[19]。同時,稱量100 g新鮮土壤在105℃烘箱干燥8小時計算土壤含水率。

1.2.2細菌宏基因組16S rDNA測序

利用土壤基因組DNA提取試劑盒(E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit, OMEGA)提取細菌總DNA。總DNA用瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性,然后用于 PCR擴增。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量,以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測序平臺的V3—V4通用引物(341F/805R)。

PCR體系包括2×Taq master Mix 15 μL、Bar-PCR primer F (10 μmol/L) 1 μL、primer R (10 μmol/L) 1 μL、Genomic DNA 10—20 ng,補充無菌水至30 μL。PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,45℃退火20 s、65℃延伸30 s,共5個循環(huán);94℃變性20 s,55℃退火30 s、72℃延伸30 s,共20個循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR結(jié)束后,引入Illumina橋式PCR兼容引物進行第二輪擴增。PCR體系包括2×Taq master Mix 15 μL、primer F (10 μmol/L) 1 μL、primer R (10 μmol/L) 1 μL、Genomic DNA 20 ng,補充無菌水至30 μL。PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性30 s;95℃變性15 s,55℃退火15 s,72℃延伸30 s,共5個循環(huán);最后72度延伸5 min。PCR結(jié)束后對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳,并對DNA進行回收?；厥债a(chǎn)物用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒定量,根據(jù)測得的DNA濃度,將所有樣品按照1∶1的比例進行混合,混合后充分震蕩均勻。等量混合時,每個樣品DNA量取10 ng,最終測序濃度為20 pmol。該混合樣品由上海生工生物工程有限公司進行后續(xù)的樣品建庫與宏基因測序。

1.2.3真菌宏基因組18S rDNA測序

真菌總DNA提取、檢測方法與細菌相同,18S V4區(qū)通用引物為V43NDF/Euk_V4_R。

PCR體系包括10×PCR buffer 5 μL、dNTP (10 mmol/L each) 0.5 μL、Genomic DNA10 ng、Bar-PCR primer F(50 μmol/L) 0.5 μL、primer R (50 μmol/L) 0.5 μL、Plantium Taq (5 U/μL) 0.5 μL,補充無菌水至50 μL。PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,45℃退火20 s、65℃延伸30 s,共5個循環(huán);94℃變性20 s,55℃退火30 s、72℃延伸30 s,共20個循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR結(jié)束后,引入Illumina橋式PCR兼容引物進行第二輪擴增。PCR體系包括10×PCR buffer 5 μL、dNTP (10 mmol/L each) 0.5 μL、DNA 20 ng、primer F (50 μmol/L) 0.5 μL、primer R (50 μmol/L) 0.5 μL、Plantium Taq (5 U/μL) 0.5 μL,補充無菌水至50 μL。PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性30 s;95℃變性15 s,55℃退火15 s,72℃延伸30 s,共5個循環(huán);最后72℃延伸5 min。真菌PCR擴增產(chǎn)物的后續(xù)檢測、回收、混合、建庫、測序等處理與細菌的方法相同。

1.2.4叢枝菌根真菌侵染率測定

將新鮮丹參的須根剪下,用自來水將根部土壤沖洗干凈,然后放置在FAA固定液(甲醛∶醋酸∶50%酒精=5∶ 5∶90)中固定,洗凈固定液,加入10%的KOH溶液,90℃下水浴加熱10 min,之后在10%的鹽酸中酸化15 min,最后用酸性品紅染色過夜。將須根剪成約2 cm的小段,用十字交叉法計算侵染率[20]。

1.3 分析方法

1.3.1數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0對土壤理化性質(zhì)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析(SPSS, Inc., Chicago, IL),先進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(Normal distribution and homogeneity of variance test),然后做單因素方差分析(One way ANOVA)。不同處理的均值在5%的顯著性水平下做LSD(Least significant difference)多重比較。

1.3.2微生物多樣性、網(wǎng)絡(luò)及相互作用分析

將多條序列按其序列間的距離進行聚類,根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元(Operational taxonomic unit, OTU),序列相似性域值設(shè)為0.97。采用uclust軟件(v1.1.579)對OTU進行聚類,uclust首先篩選出序列中最長的reads作為種子序列,找出所有與該序列的相似度在閾值范圍內(nèi)的序列,并歸為一個類,而后依次執(zhí)行此步驟,直到所有序列均完成聚類,每一個類作為一個OTU。

微生物Alpha多樣性指標包括ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)(Shannon-Wiener index)、豐富度指數(shù)(richness)、均勻度和覆蓋度,各指數(shù)的計算方法參見邵宗圓等人的方法[21]。

細菌群落Beta多樣性可以用來比較多組樣本之間的差別,本研究利用Fast UniFrac軟件進行主坐標分析(Principal co-ordinates analysis, PCoA)。

選取豐富度高于1%或豐富度排序在前100位的物種,利用QIIME(v1.8.0)和SparCC軟件(v1.0.0)分別進行網(wǎng)絡(luò)(network)分析和微生物之間相互作用關(guān)系分析。

1.3.3基于Canoco軟件的冗余分析(RDA)

利用Canoco(v 4.5, Centre for Biometry, Wageningen, The Netherlands)軟件分析土壤理化因子和細菌群落之間的關(guān)系。首先,對丹參根際土壤細菌群落做降趨勢對應(yīng)分析(Detrended correspondence analysis, DCA)。結(jié)果顯示,細菌的第一排序軸長度為0.594,真菌的第一排序軸長度為0.783,均小于3,因此本研究選擇基于線性模型的冗余分析(Reundancy analysis, RDA)進行排序[22]。

蒙特卡羅置換檢驗(Monte Carlo permutation)用以檢驗限制性排序模型的顯著性,置換次數(shù)選擇默認值499次。預(yù)篩選(Forward selections)可以檢驗?zāi)姆N環(huán)境因子對微生物群落組成有顯著性的影響。根據(jù)預(yù)篩選的結(jié)果,通過偏冗余分析(partial RDA)的variation partitioning能夠確定具有顯著性影響的各因子的貢獻率[22]。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化性質(zhì)

土壤理化性質(zhì)見表1。結(jié)果顯示,所有土壤均屬于酸性土,不同樣點的酸度有顯著差異(P<0.05),其中連作兩年的土壤pH最低,而輪作土壤pH最高。土壤呈氧化狀態(tài),輪作和連作土壤的ORP無顯著差異,但套作土壤的ORP明顯低于其他兩種種植模式。土壤有機質(zhì)在12.92—21.51 g/kg之間,含量較高,且呈現(xiàn)輪作<連作<套作的規(guī)律。連作兩年的丹參根際土壤總磷和總鉀均最低,但有效磷和有效鉀的變化趨勢與總磷和總鉀有所不同。3種種植模式下,丹參根際土壤微生物量(以DNA含量計)沒有明顯差異,但呈現(xiàn)連作<套作<輪作的趨勢。

表1 土壤理化性質(zhì)

表中數(shù)據(jù)為平均值±標準偏差, 不同字母標記的數(shù)值表示在5%的顯著性水平下有顯著性差異; RCMO: 輪作, Rotation cropping monoculture; CCMO: 連作, Continuous cropping monoculture; ICMI: 套作, Intercropping mix-culture

2.2 丹參根部AMF真菌的侵染率

本研究未單獨分析丹參根際AMF的群落變化,僅測定了其侵染率。從表2可以看出,3種種植模式下丹參根部AMF真菌的侵染率有明顯差異(P<0.05),其中連作兩年的丹參根部AMF侵染率最低,僅為23.57%,而輪作丹參的侵染率最高,達44.67%。

表2 3種種植模式下叢枝菌根真菌對丹參的侵染率/%

2.3 丹參根際細菌群落結(jié)構(gòu)變化

2.3.1細菌群落Alpha多樣性

3種種植模式下測序文庫的覆蓋度均達到97%以上,說明絕大部分細菌的序列可以被測出,測序結(jié)果有較好的代表性。細菌豐富度指數(shù)通過OTU的個數(shù)來計算,可以衡量細菌的物種數(shù),數(shù)量均在5000條以上,表明細菌豐富度非常高。輪作條件下,丹參根際細菌群落的香農(nóng)-威納指數(shù)顯著高于連作和套作(P<0.05,表3),其他Alpha多樣性指數(shù)在3種種植模式之間均無顯著差異,但均呈現(xiàn)輪作>套作>連作的變化趨勢。雖然都是種植兩年,但套作丹參根際的細菌多樣性明顯好于連作。

表3 土壤細菌Alpha多樣性指標

2.3.2細菌主要類群及分布

3種種植模式下,相對豐富度排名前10的優(yōu)勢細菌所占比例均達到94%以上,盡管排序有所差異,但前10個優(yōu)勢細菌門在3種種植模式中是相同的(圖1),包括Proteobacteria(變形菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Planctomycetes(浮霉菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Verrucomicrobia(疣微菌門)、Unclassified(未分類門)、Firmicutes(厚壁菌門)和Chloroflexi(綠彎菌門)。芽單胞菌門在輪作模式下占比僅為5.01%,與連作和套作相比明顯下降(P<0.05)。其他細菌門在3種種植模式之間無明顯差異,但是浮霉菌門和擬桿菌門在連作模式下的相對豐富度均低于其他兩種模式。

圖1 3種種植模式下主要細菌類群相對豐度Fig.1 Relative abundance of the major bacterial phylogenetic groups under three cropping modesRCMO: 輪作, Rotation cropping monoculture; CCMO: 連作, Continuous cropping monoculture; ICMI: 套作, Intercropping mix-culture

2.3.3細菌群落PCoA分析

由圖2可見,3種種植模式中3 個重復(fù)并不聚類于同一象限,表明組內(nèi)變異較大,3種種植模式之間細菌群落沒有發(fā)生明顯的分化。PCoA分析結(jié)果表明,細菌群落結(jié)構(gòu)的變異受 8 個主坐標成分的控制(累積解釋的總方差達100%),主坐標成分的特征值均大于0.769,其中前兩個主坐標成分影響最大,分別能夠解釋 15.08%和 13.97%的變異,累積解釋能力達 29.05%。但是,所有主坐標成分的特征值相差不大,說明本研究中影響土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因子并不明顯。

圖2 3種種植模式下細菌群落PCoA聚類分析 Fig.2 Principal coordinates analysis (PCoA) of bacterial communities under three cropping modes

2.4 丹參根際真菌群落結(jié)構(gòu)變化

2.4.1真菌群落 Alpha多樣性

真菌群落的豐富度均在600條以上,數(shù)量顯著低于細菌。由于數(shù)量相對較少,3種種植模式下測序文庫的覆蓋度均達到100%,表明測序結(jié)果有較好的代表性。真菌群落的所有Alpha多樣性指數(shù)在3種種植模式之間均無明顯差異(P>0.05,表4),但是除了覆蓋度和辛普生指數(shù)以外,均呈現(xiàn)輪作>套作>連作的變化趨勢。

表4 土壤真菌Alpha多樣性指標

2.4.2真菌的主要類群及分布

共發(fā)現(xiàn)9個真菌門,其中未分類門相對豐富度最高,除此之外其他所有真菌門的相對豐富度在31.96%—51.48%,說明土壤中已知真菌類群較少,尤其是連作模式(圖3)。已知真菌主要包括Ascomycota(子囊菌門)、Basidiomycota(擔(dān)子菌門)、Zygomycota(接合菌門)、Chytridiomycota(壺菌門)、Neocallimastigomycota(新麗鞭毛菌門)、Glomeromycota(球囊菌門)、Fungi_Incertae_Sedis(未知菌門)和Blastocladiomycota(芽枝霉菌門)等。除未分類門以外,子囊菌門在所有種植模式中的相對豐富度最高,但是套作(15.22%)顯著高于連作(9.31%)。同樣,輪作模式下接合菌門和壺菌門的相對豐富度也顯著高于連作模式(P<0.05)。

圖3 3種種植模式下主要真菌類群相對豐富度Fig.3 Relative abundance of the major fungi phylogenetic groups under three cropping modes

2.4.3真菌群落PCoA分析

與細菌群落類似,3種種植模式中真菌群落的3個重復(fù)也較分散,種植模式之間沒有明顯分化。PCoA分析結(jié)果表明,真菌群落組成的變異受8個主坐標成分的控制,主坐標成分的特征值均大于0.890,其中前兩個主坐標成分影響最大,分別能夠解釋14.12%和13.63%的變異,累積解釋能力達27.75%(圖4)。但是,所有主坐標成分的特征值相差不大,說明本研究中影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因子并不明顯。

圖4 3種種植模式下真菌群落PCoA聚類分析 Fig.4 Principal coordinates analysis (PCoA) of fungi communities under three cropping modes

2.5 土壤微生物群落網(wǎng)絡(luò)分析和相互作用關(guān)系

網(wǎng)絡(luò)分析表明,優(yōu)勢細菌門在3種種植模式之間變化不大,只有芽單胞菌門在輪作模式下的豐富度顯著低于連作和套作(P<0.05);而非優(yōu)勢細菌門的變化較大,尤其是熱脫硫桿菌門(Thermodesulfobacteria),但其變化趨勢與芽單胞菌門剛好相反(P<0.01)。連作模式下Ignavibacteriae門和Deinococcus-Thermus門之間存在顯著的負相互作用(P<0.05),而套作和輪作模式下只有正相互作用,如變形菌門、酸桿菌門和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)(套作,P<0.05),衣原體門(Chlamydiae)和藍藻門(Cyanobacteria/Chloroplast)(輪作,P<0.01)。但是,未發(fā)現(xiàn)細菌門之間的相互作用關(guān)系在不同種植模式下發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變的情況。

套作模式下球囊菌門和子囊菌門的優(yōu)勢度較高,而輪作模式下新麗鞭毛菌門、壺菌門和接合菌門占優(yōu)勢,但連作模式下未發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢真菌門。雖然真菌門數(shù)量很少,它們之間的相互作用卻更加復(fù)雜。連作模式下球囊菌門與子囊菌門、未知菌門均有負相互作用,但在輪作模式下球囊菌門與子囊菌門之間轉(zhuǎn)變?yōu)檎嗷プ饔?P<0.01);套作模式下未知菌門與接合菌門、新麗鞭毛菌門有負相互作用,但在輪作模式下均轉(zhuǎn)變?yōu)檎嗷プ饔?P<0.01)。

2.6 土壤細菌群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系

蒙特卡羅置換檢驗結(jié)果顯示,第一典范軸P值為0.087(F=0.487),所有典范軸的P值為0.027(F=1.458),表明該排序模型的解釋變量(即土壤環(huán)境因子)可以很好地解釋響應(yīng)變量(即土壤細菌群落結(jié)構(gòu))的變化,但第一典范軸的影響不顯著。丹參根際土壤細菌群落與根際土壤環(huán)境因子的冗余分析結(jié)果見表5,其中RDA前兩個排序軸的特征值分別為0.328和0.133,分別解釋了32.8%和13.3%的細菌群落變化。本文所選的8個土壤環(huán)境因子共解釋了86.2%的總特征值,說明對丹參根際土壤細菌群落有顯著影響。

表5 土壤細菌群落冗余分析

圖5 3種種植模式下細菌群落和土壤理化因子間的RDA雙序圖Fig.5 The RDA biplots generated from bacterial communities under three cropping modes and soil physicochemical properties圖中黑線和實心箭頭表示顯著性因子, 黑線和空心箭頭表示非顯著性因子;OM: 有機質(zhì), Organic matter; TP: 總磷, Total phosphorus; AP: 有效磷, Available phosphorus; TN: 總氮, Total nitrogen; TK: 總鉀, Total potassium; AK: 有效鉀, Available potassium; ORP: 氧化還原電位, Oxidation reduction potential

為了研究影響丹參根際細菌群落結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因素,對8個土壤理化因子進行預(yù)篩選。結(jié)果表明,只有土壤總鉀(TK,P=0.034,F=2.24)對細菌群落的構(gòu)建有顯著性影響(P<0.05)。RDA雙序圖(圖5)顯示,TK對套作模式下丹參根際細菌群落有正向影響,相反對連作模式下的細菌群落不利。

2.7 土壤真菌群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系

蒙特卡羅置換檢驗結(jié)果顯示,第一典范軸P值為0.332(F=0.961),所有典范軸的P值為0.604(F=0.979),表明該排序模型的解釋變量(即土壤環(huán)境因子)與響應(yīng)變量(即土壤真菌群落結(jié)構(gòu))的變化關(guān)系不大。丹參根際土壤真菌群落與土壤環(huán)境因子的冗余分析結(jié)果見表6,其中RDA前兩個排序軸的特征值分別為0.490和0.239,分別解釋了49.0%和23.9%的真菌物種變化。本文所選的8個土壤環(huán)境因子共解釋了87.3%的總特征值,對丹參根際土壤真菌群落有顯著影響。

偏冗余分析的結(jié)果表明,8個土壤因子中只有有效鉀(AK)和ORP對真菌群落的構(gòu)建有顯著性影響(表7,P<0.05),分別可以解釋19.7%和4.40%的真菌群落變化。從雙序圖中可以看出,影響真菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵土壤因子在不同種植模式下有明顯差異,套作丹參根際真菌群落主要受AK影響,而輪作和連作主要受ORP影響(圖6)。

表7 土壤環(huán)境因子偏冗余分析(pRDAs)

圖6 3種種植模式下真菌群落和土壤理化因子間的RDA雙序圖Fig.6 The RDA biplots generated from fungi communities under three cropping modes and soil physicochemical properties

3 討論

根際土壤微生物對植物的生長繁殖、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收運輸和殘體分解等方面具有重要影響,它們與植物之間存在著十分緊密的相互作用,也是環(huán)境土壤學(xué)研究的熱點問題之一。植物在連作后其根系分泌物、殘根和凋落物的質(zhì)與量會發(fā)生顯著變化,從而對根際土壤微生物產(chǎn)生明顯的影響[23-24]。

3.1 不同種植模式下丹參根際微生物群落的變化

本研究利用高通量測序法對丹參根際土壤中的微生物群落進行了測序和分析。從種植時間上來看,細菌的豐富度、香農(nóng)-威納指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)隨丹參種植年限增加而降低,其中香農(nóng)-威納指數(shù)顯著降低。但是,真菌的Alpha多樣性指數(shù)均無顯著變化,變化規(guī)律與細菌相似。真菌Simpson指數(shù)雖然隨種植年限增加呈上升趨勢,但變異主要來自組內(nèi)。從種植模式而言,套作在一定程度上能夠提高土壤微生物群落多樣性,因為大多數(shù)Alpha多樣性指標都高于連作。由于亳州地區(qū)丹參連作障礙非常嚴重,因此很少連作兩年以上,這可能是多數(shù)微生物群落多樣性指標沒有發(fā)生顯著變化的原因之一。相比而言,新疆的棉花連作時間可長達30年,根際細菌群落多樣性的變化要明顯的多[23]。除連作時間的影響以外,土壤性質(zhì)和丹參品種也可能導(dǎo)致土壤微生物群落多樣性的變化有所差異。Tang等發(fā)現(xiàn),四川中江縣的丹參連作1—3年,其根際真菌群落的豐富度和香農(nóng)-威納指數(shù)與未耕作地相比均顯著降低[8]。

從根際微生物聚類分析的結(jié)果來看,無論細菌還是真菌群落在3種種植模式之間均沒有發(fā)生顯著分化。但是,出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能與各種種植模式組內(nèi)差異較大有關(guān),微生物群落組成的細微差別,以及由此造成的根際微生物與丹參相互作用關(guān)系的變化仍然值得關(guān)注。由于微生物,尤其是細菌的種類較多,本研究從門這一較高的分類單元進行了統(tǒng)計和分析。芽單胞菌門在輪作模式下的相對豐富度顯著低于連作和套作,表明該門的細菌對連作環(huán)境的耐受性較強,有可能成為連作模式下的優(yōu)勢菌。與此相反,輪作和套作時浮霉菌門和擬桿菌門的相對豐富度則高于連作,說明這兩個門的細菌對連作環(huán)境較為敏感,保持根際微環(huán)境的多樣性對它們有利。真菌的數(shù)量遠小于細菌,套作模式下占優(yōu)勢的子囊菌門的相對豐富度顯著高于連作。與此類似,輪作模式下接合菌門和壺菌門的相對豐富度也顯著高于連作模式。

AMF是一種普遍存在的專性內(nèi)共生真菌,可以通過侵染植物根系和植物形成共生體系。AMF需要依靠宿主獲得C源,同時能夠增強植物獲取P等礦質(zhì)營養(yǎng)的能力,從而實現(xiàn)互利共生。被AMF真菌侵染可以提高植物的抗逆性、抗病蟲害等能力,促進植物的生長,提高作物的質(zhì)量和產(chǎn)量[25]。研究發(fā)現(xiàn),AMF不僅可以改善連作丹參的生長,而且能夠增加丹酚酸B、丹參酮的產(chǎn)量和對鐵、錳等微量元素的積累[13, 26]。本研究表明,隨著種植年限的增加,無論是連作還是套作,AMF真菌對丹參根部的侵染率均顯著下降。另外,與套作相比,連作丹參的AMF真菌侵染率降低,但未達到顯著水平。

3.2 丹參根際微生物群落變化的原因及與連作障礙的關(guān)系

大量研究結(jié)果表明,陸地生態(tài)系統(tǒng)中地上的植物多樣性,以及土地利用方式或耕作方式的變化是驅(qū)動地下微生物群落多樣性、代謝類型多樣性變化的重要因素[18, 23, 27-28]。丹參連作會導(dǎo)致土壤酸化,團聚體結(jié)構(gòu)破壞,土壤營養(yǎng)失衡等現(xiàn)象[6]。本研究結(jié)果表明,輪作和套作不僅提高了土壤pH,降低了ORP,改善了部分土壤礦質(zhì)營養(yǎng),而且能夠在一定程度上影響丹參根際的微生物群落組成,從而可能對緩解連作障礙起到積極作用。微生物群落結(jié)構(gòu)受8個主坐標成分的影響,但前兩個主坐標成分的綜合解釋能力均小于30%,表明沒有顯著的主導(dǎo)因子。本研究將8個土壤環(huán)境因子通過冗余分析投影成4個典范軸。結(jié)果表明,土壤性質(zhì)的變化對細菌群落的影響較大,但對真菌群落的影響不明顯。因此,真菌群落變化的主導(dǎo)因素并非土壤理化性質(zhì)。研究表明,植物根際分泌物可以直接或間接影響微生物群落[8, 23- 24],但由于丹參根際分泌物組成復(fù)雜本研究未將此因子納入冗余分析?？傗浐陀行р浛梢蕴岣咛鬃髂Ｊ较录毦驼婢郝涞亩鄻有?說明丹參和白芍套作形成的根際微環(huán)境更適合喜鉀微生物的生長。而輪作和連作模式下的真菌群落與此剛好相反,它們更適應(yīng)低鉀和高ORP的環(huán)境。

研究表明,在低P環(huán)境下AMF對宿主的侵染率較高[29- 30]。但本研究發(fā)現(xiàn),連作條件下丹參根際土壤的總磷和有效磷均低于輪作。因此,土壤營養(yǎng)條件的變化可能不是導(dǎo)致AMF侵染率下降的主要原因。由于丹參是根類藥材,根際分泌物將隨著種植時間的增加在土壤中發(fā)生積累,并引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著變化[8, 23- 24],這可能是導(dǎo)致AMF侵染率下降的潛在原因之一,但具體機制還要進一步的研究來證實。AMF侵染率的下降可能會造成連作丹參的品質(zhì)和產(chǎn)量降低[13, 26],抗病能力下降,進一步加劇連作障礙。鐮刀菌屬(Fusariumgenus)是丹參枯萎病和根腐病的主要病原菌。雖然該屬在真菌中的相對豐富度很低(0.01%),但間作和套作兩種模式下均未發(fā)現(xiàn)該菌,僅在連作模式下有檢出。另外,有研究發(fā)現(xiàn)枯草桿菌屬(Bacillusgenus)和AMF可以有效控制枯萎病的發(fā)生[31-32],屬有益菌。但本研究發(fā)現(xiàn),連作模式下枯草桿菌屬的相對豐富度(0.18%)低于套作(0.22%)和輪作(0.26%),AMF的侵染率也同樣顯著下降。微生物組成和功能群的變化會影響根際有機質(zhì)的代謝和循環(huán),改變根際微環(huán)境,以及微生物與植物之間的關(guān)系,這也可能是導(dǎo)致連作障礙的重要原因之一[33]。此外,本研究表明,不同的丹參種植模式下微生物之間的相互關(guān)系有明顯差異。細菌在輪作和套作模式下均表現(xiàn)為正相互作用,但在連作模式下存在負相互作用,而輪作甚至還會造成真菌之間的相互關(guān)系發(fā)生逆轉(zhuǎn)。這種現(xiàn)象與丹參連作障礙是否有關(guān)值得進一步深入研究

本研究的結(jié)果僅基于一次性取樣,只能表征一個時間斷面上的變化。未來應(yīng)開展不同種植模式下丹參根際微生態(tài)環(huán)境的動態(tài)監(jiān)測,這對于揭示連作障礙發(fā)生機理和探索應(yīng)對策略具有重要意義。