陳洪群，鄭梅，晏乘曦，黃鵬，趙興山

(1民航總醫(yī)院，北京100123；2北京積水潭醫(yī)院；3首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院)

隨著現(xiàn)代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，原代細(xì)胞的分離提取已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域的研究[1～4]。成年小鼠的心臟成纖維細(xì)胞，在研究心臟纖維化[5～7]、心衰、心臟重構(gòu)[8～10]等方面應(yīng)用廣泛。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，但細(xì)胞系是永生化的細(xì)胞，其基因型、生理特性等都已發(fā)生變化，不能完全反映細(xì)胞真實(shí)狀態(tài)[11]。國(guó)內(nèi)偶有原代小鼠心臟成纖維細(xì)胞的提取方法，但大多是乳鼠。既往提取小鼠心臟成纖維細(xì)胞的方法多為聯(lián)合酶室溫下消化法[12]或利用提取心肌細(xì)胞后剩余殘液培養(yǎng)成纖維細(xì)胞。聯(lián)合酶室溫下消化法受室內(nèi)溫度影響較大，在不同季節(jié)、不同實(shí)驗(yàn)室難以重復(fù)；消化提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，大量成纖維細(xì)胞被消化酶損傷，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞產(chǎn)量少，難以傳代。利用提取心肌細(xì)胞后剩余殘液培養(yǎng)成纖維細(xì)胞法提取殘液中混雜內(nèi)皮細(xì)胞等導(dǎo)致成纖維細(xì)胞純度低。2017年12月～2018年4月，我們?cè)诼?lián)合酶消化法的基礎(chǔ)上改進(jìn)了消化溫度、提取液儲(chǔ)存方式(改良聯(lián)合酶消化法)穩(wěn)定地提取了成年小鼠原代心臟成纖維細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑 C57BL/6 小鼠，雌雄不限，SPF 級(jí)，42～46日齡，體質(zhì)量15～20 g，購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。主要試劑：HG/DMEM、胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素均為美國(guó) Gibco公司產(chǎn)品，Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。HE染色試劑盒為北京索萊寶公司產(chǎn)品，盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體 2(DDR2)一抗(ab203128)、熒光二抗(ab150080)，波形蛋白一抗(ab92547)、熒光二抗(ab150077)為美國(guó)Abcam 公司產(chǎn)品。

1.2 試劑準(zhǔn)備 液體配制：10% FBS 100 mL，分別裝在2個(gè)50 mL離心管里(依次加入500 μL雙抗，5 mL FBS，44.5 mL DMEM)；消化酶：40 mg 胰酶、24 mg Ⅱ 型膠原酶溶于40 mL PBS中(在50 mL離心管中配制)，顛倒混勻之后，用50 mL注射器+一次性濾器過(guò)濾到新的50 mL離心管中，封口膜封口放入37 ℃水浴待用。將配好的10% FBS加入15 mL離心管中(每管加6 mL，共加10管)，加完封口膜封口放入冰盒待用。將冰冷的PBS加入100 mL的培養(yǎng)皿中(每皿加 20 mL，三個(gè)皿都加)，放在操作臺(tái)待用。

1.3 心臟的獲取 6只C57 BL/6成年小鼠拉頸處死后，放在含75%酒精的容器中浸泡5 s取出，固定在泡沫板上，固定四肢，依次剪開(kāi)皮膚、剪開(kāi)胸骨劍突，暴露心臟，用另一個(gè)鑷子在主動(dòng)脈根部薅下心臟，立即放入含有冰冷PBS的100 mL皿里。清洗心臟，洗凈血污，修剪結(jié)締組織和心房，保留心室(在3個(gè)皿中洗凈血污)。用鑷子將心室塊加入50 mL離心管中，用彎頭剪剪碎，大約 1 mm3方塊。

1.4 改良聯(lián)合酶消化法提取心臟成纖維細(xì)胞 消化：向含有心室碎塊的50 mL離心管中加入預(yù)熱好的消化酶 5 mL，封口后，置于37 ℃溫育，輕搖6 min，靜置10 s，用3 nL塑料吸管吸取上清，加到含有10% FBS的15 mL離心管中，輕輕顛倒混勻幾次，擰緊蓋子，封口，放入冰盒。剩余心室碎塊，繼續(xù)加入5 mL 消化液，重復(fù)上述消化步驟，直至將組織消化(大約消化 10 次)。所得細(xì)胞懸液拿進(jìn)操作臺(tái)，用70 μm細(xì)胞篩過(guò)濾到50 mL離心管中，每個(gè)50 mL離心管中裝30 mL。 離心：將裝有細(xì)胞懸液的50 mL離心管配平后，1 200 r/min離心7 min。取出后，棄掉上清，用10% FBS輕輕吹打混勻細(xì)胞，接種到T25培養(yǎng)瓶中,放入溫箱培養(yǎng)。差速貼壁：2 h后，取出T25培養(yǎng)瓶，吸出上清棄掉，用3 mL移液管加5 mL 10% FBS至瓶底，然后輕輕放平培養(yǎng)瓶，做好標(biāo)記，放入溫箱。隔天換液一次。傳代：3 d后，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，使用0.25%胰酶(含EDTA)消化細(xì)胞：將分裝的胰酶放入37 ℃水浴箱待用，取出長(zhǎng)滿細(xì)胞的T25培養(yǎng)瓶，吸棄培養(yǎng)基，加入2 mL胰酶，室溫下消化3～5 min，邊消化邊振蕩，顯微鏡下觀察細(xì)胞開(kāi)始脫落時(shí)，加入培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打后將細(xì)胞懸液吸入50 mL離心管，以1 200 r/min 離心5 min，棄上清，使用培養(yǎng)基混勻細(xì)胞沉淀，種植于新的T25培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 心臟成纖維細(xì)胞鑒定 ①蘇木精-伊紅染色:爬片準(zhǔn)備：培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞按 1×105/孔接種于6孔板(孔中提前放入玻片)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，1×PBS洗3次，每次5 min。細(xì)胞固定：往爬片上加入4%多聚甲醛2 mL，蓋過(guò)爬片即可，固定20 min，之后1×PBS洗3次，每次5 min染核：加入蘇木素溶液2 mL，室溫下染核8 min。吸棄蘇木素溶液，自來(lái)水洗滌爬片，注意輕柔，避免大量細(xì)胞被洗掉。洗完之后不需分化。染胞質(zhì)：加入伊紅溶液，室溫下染色1 min。吸棄伊紅溶液，自來(lái)水洗滌爬片。封片：爬片室溫下自然晾干后，中性樹(shù)膠封片。此步驟必須避免氣泡。 鏡下觀察拍照。②免疫熒光法:6孔板里的細(xì)胞長(zhǎng)到90%,吸棄培養(yǎng)基，PBS輕輕洗2次，每次1 min。每孔加入4%多聚甲醛2 mL，室溫下放置30 min(固定細(xì)胞)，之后吸棄多聚甲醛后用PBS洗3次，每次5 min。每孔加入0.3% Triton-X100 2 mL，室溫下30 min(細(xì)胞打孔)，之后PBS洗3次，每次5 min。5% BSA封閉液，每孔1 mL，室溫下封閉30 min，吸棄BSA，用濾紙吸掉多余BSA。滴加200 μL 1∶00稀釋的一抗，錫箔紙嚴(yán)密包裹，4 ℃過(guò)夜。之后PBS洗3次，每次5 min。滴加200 μL 1∶100 的熒光標(biāo)記二抗，37 ℃避光溫育20 min。之后吸棄二抗，取出玻片，室溫盡快晾干后用含 DAPI 的封片劑封片：此步驟不可有氣泡，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

顯微鏡下可見(jiàn)大量細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈橢圓形或圓形，立體感較強(qiáng)(見(jiàn)圖1)，24 h后細(xì)胞伸展呈梭形，貼壁生長(zhǎng)，排列緊密，細(xì)胞之間連接緊密，較扁平(見(jiàn)圖2)。3 d后細(xì)胞平鋪長(zhǎng)滿，呈梭形，細(xì)胞間排列緊密(見(jiàn)圖3)。

經(jīng)蘇木精-伊紅染色染色后，顯微鏡下觀察，見(jiàn)細(xì)胞呈梭形，單層排列，細(xì)胞質(zhì)紅染，細(xì)胞核藍(lán)染。免疫熒光鑒定可見(jiàn)細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)波形蛋白(圖4)和DDR2(圖5)，陽(yáng)性表達(dá)率可達(dá)90%以上。

圖1 顯微鏡下原代心臟成纖維細(xì)胞形態(tài)(100×)

圖2 顯微鏡下首次傳代24 h后心臟成纖維細(xì)胞形態(tài)(100×)

圖3 顯微鏡下首次傳代3 d后心臟成纖維細(xì)胞形態(tài)(100×)

圖4 波形蛋白陽(yáng)性心臟成纖維細(xì)胞(免疫熒光法,400×)

圖5 DDR2陽(yáng)性心臟成纖維細(xì)胞(免疫熒光法,400×)

3 討論

心肌成纖維細(xì)胞是心臟非心肌細(xì)胞的主要組成部分，占正常心臟組織細(xì)胞總數(shù)的 60%～70%，其功能主要是合成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，是合成心肌膠原的主要細(xì)胞。正常情況下，心肌成纖維細(xì)胞數(shù)量較少且基本處于非活化狀態(tài);在缺血、壓力負(fù)荷、炎癥等多種病理性條件的刺激下，成纖維細(xì)胞活化，發(fā)生增殖、遷移、轉(zhuǎn)化、合成細(xì)胞外基質(zhì)等功能改變。心肌成纖維細(xì)胞的活化是心肌纖維化的關(guān)鍵步驟,其在心室重構(gòu)的發(fā)展中起著非常重要的作用[13]。心肌成纖維細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)刺激下，增殖分化為肌纖維細(xì)胞后，遷移、增殖及分化膠原的能力增強(qiáng)，同時(shí)肌纖維細(xì)胞特征性標(biāo)物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)增加。激活的肌纖維細(xì)胞可產(chǎn)生Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維，增加細(xì)胞外基質(zhì)的聚集及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，造成心室重構(gòu)[9,10]。

聯(lián)合酶消化法是利用胰酶和Ⅱ型膠原酶對(duì)原代組織進(jìn)行消化，獲取相應(yīng)原代細(xì)胞的方法，此方法廣泛應(yīng)用于犬心房肌細(xì)胞[14]、新生大鼠心肌細(xì)胞[15]、成年小鼠心臟成纖維細(xì)胞[12]等的提取。對(duì)于成年小鼠原代心臟成纖維細(xì)胞，既往多采用室溫下消化，消化時(shí)間多由實(shí)驗(yàn)者根據(jù)實(shí)時(shí)消化情況決定，難以在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室以及不同室溫情況下重復(fù)。關(guān)于既往報(bào)道的37 ℃水浴消化30～40 min的消化條件，本實(shí)驗(yàn)組多次重復(fù)證實(shí)，此消化方法會(huì)導(dǎo)致大量心臟成纖維細(xì)胞破壞，無(wú)法貼壁生長(zhǎng)或傳代，于是改良了聯(lián)合酶消化法，于37 ℃恒溫箱內(nèi)進(jìn)行6 min消化，并將細(xì)胞的消化液進(jìn)行冰上儲(chǔ)存。

正常情況下心臟成纖維細(xì)胞呈梭形，HE染色可清晰顯示其形態(tài)，并能觀察細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核。在細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定的前提下，進(jìn)一步進(jìn)行免疫熒光鑒定。波形蛋白是一種成纖維細(xì)胞標(biāo)記物，是間質(zhì)細(xì)胞中最主要的中間纖維，它存在于中胚層起源的細(xì)胞中[16]，并與微管、微絲共同形成了一個(gè)細(xì)胞支架網(wǎng)絡(luò)而維持細(xì)胞完整性。實(shí)驗(yàn)表明，可根據(jù)抗波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性來(lái)鑒定心臟成纖維細(xì)胞。心臟成纖維細(xì)胞的一種更為特異性的標(biāo)記物為DDR2[17]，是膠原特異性受體酪氨酸激酶家族的典型代表，這些受體介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)、移行、結(jié)構(gòu)形成及分化等功能，在心肌細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞中無(wú)表達(dá)。本研究證實(shí)，改良聯(lián)合酶消化法得到的細(xì)胞呈梭形，單層排列，細(xì)胞質(zhì)紅染，細(xì)胞核藍(lán)染；免疫熒光鑒定可見(jiàn)波形蛋白，DDR陽(yáng)性表達(dá)率可達(dá)90%以上，提示此法可成功地提取心臟成纖維細(xì)胞，且細(xì)胞純度很高。

綜上所述，改良聯(lián)合酶消化法可以穩(wěn)定地提取成年小鼠原代心臟成纖維細(xì)胞， 此方法可推廣應(yīng)用于原代心臟細(xì)胞纖維化、心衰、心臟重構(gòu)等方面的研究。聯(lián)合酶消化本身對(duì)成纖維細(xì)胞有一定損害，有可能改變細(xì)胞特性，因此，更高效、無(wú)害的提取方法有待于研究者進(jìn)一步探索。