王忠星，黨光輝，劉虹秀，臧鑫鑫，崔瑩瑩，崔子寅，宋寧寧，陳利蘋，劉思國

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 吉林長春130118；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150069)

副結(jié)核病(Paratuberculosis)是由禽分枝桿菌副結(jié)核亞種(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis，MAP)引起的多種動物共患的慢性消耗性疾病。該病主要在反芻動物中流行，以奶牛和黃牛最為易感。牛感染MAP 后以持續(xù)性腹瀉、進(jìn)行性消瘦、腸黏膜增厚及形成皺襞為主要特征，因此該病又稱副結(jié)核性腸炎[1]。副結(jié)核病目前已遍布全世界，尤其對奶牛和肉牛養(yǎng)殖業(yè)危害很大。

半胱氨酸蛋白酶在病原微生物侵入宿主的過程中發(fā)揮了重大作用，尤其是微生物在宿主體內(nèi)定植和逃避宿主免疫方面[2-4]。MAP1068 蛋白是MAP 一種保守性和種屬差異性較高的蛋白，生物信息學(xué)預(yù)測表明MAP1068 蛋白為一種半胱氨酸蛋白酶的假定蛋白，但具體功能未知。本研究通過對副結(jié)核分枝桿菌MAP1068 蛋白的表達(dá)純化、多克隆抗體的制備、亞細(xì)胞定位和酶活性測定，同時研究其生物學(xué)特性，以期為副結(jié)核病的致病機(jī)制研究、疫苗的研制、藥物的開發(fā)等領(lǐng)域研究提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)動物E.coliDH5α 和E.coliBL21 感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技(北京)有限公司；MAP K10 參考株和pET-28a 載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA 膠回收試劑盒均購自O(shè)MEGA 公司；LB 固體、液體培養(yǎng)基購自美國BD 公司；Primer-STAR Max 聚合酶購自TaKaRa 公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、Hind Ⅲ和T4 DNA 連接酶購自Thermo Scientific 科技(中國)有限公司；弗氏不完全佐劑、酪蛋白、Anti-His Tag 抗體、兔抗鼠IgG-FITC 抗體、山羊抗鼠IgG-HRP 抗體均購自Sigma-Adlrich 公司；Ni-NTA 樹脂購自GE 公司。6 周齡～8 周齡BABL/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank 中MAP K10參考株map1068的基因序列(MAP_RS05455)，利用Generunner 軟件設(shè)計(jì)一對特異性引物F：5'-GGA ATTCCATATGGTGCCCGAAGCCGATCAGCAG-3'(NdeⅠ)/R：5'-TCCAAGCTTTCACGCATAGGGCACC ACGTC-3' (Hind Ⅲ)，引物由吉林省庫美生物公司合成。

1.3 目的基因的擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 按照DNA 提取試劑盒說明書提取MAP 參考株K10 DNA，以此為模板利用引物F/R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收連接至表達(dá)載體pET-28a，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-map1068。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落提取質(zhì)粒，進(jìn)行測序分析。

1.4 MAP1068 蛋白的表達(dá)與純化 參照文獻(xiàn)[5]，將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素(50 μg/mL)的固體LB 平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃180 r/min 震蕩培養(yǎng)至OD600nm約0.6， 加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，37 ℃180 r/min 誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心收集茵體超聲破碎，分別收集超聲破碎后的混合物以及離心后的菌體上清和沉淀，進(jìn)行SDSPAGE 分析。用變性劑重懸離心后的菌體沉淀，至包涵體完全溶解后轉(zhuǎn)入透析袋，透析復(fù)性48 h。復(fù)性后的上清經(jīng)Ni-NTA 柱純化后利用超濾管濃縮除鹽，測定蛋白濃度。

1.5 MAP1068 蛋白western blot 和質(zhì)譜分析 以Anti-His Tag 抗體(1 ∶1 000)為一抗，山羊抗鼠IgG-HRP 抗體(1∶10 000)為二抗，western blot 檢測純化的MAP1068 蛋白。純化后的蛋白由賽信生物公司進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜分析。

1.6 多克隆抗體的制備及效價評定 純化的MAP1068 蛋白(100 μg/只)與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后接種6 周齡～8 周齡的BALB/c 小鼠10 只，每隔兩周免疫一次。三免一周后尾部采血檢測抗體效價，抗體效價檢測陽性的鼠加強(qiáng)免疫一次，2 d后收獲鼠血清，同法檢測抗體效價。血清抗體效價檢測以MAP1068 蛋白為包被抗原(5 μg/mL)，陽性鼠血清為一抗(1∶100～1∶204 800 2 倍比稀釋)，山羊抗鼠IgG-HRP (1∶10 000)為二抗進(jìn)行ELISA 試驗(yàn)，評價該抗體效價，同時設(shè)置陰性血清對照組和PBS空白對照組。

1.7 MAP1068 蛋白的亞細(xì)胞定位 參照文獻(xiàn)[6]方法制備MAP K10 菌株的亞細(xì)胞組分：將菌液4 ℃15 000 r/min 離心30 min，上清用濾膜過濾后，即為培養(yǎng)濾液(CF)；菌體沉淀用PBS 重懸后超聲裂解，4 ℃15 000 r/min 離心60 min 后以10 mmol/L 的碳酸氫銨重懸沉淀，此為細(xì)胞壁(CW)成分，收集離心后的上清，4 ℃30 000 r/min 離心4 h，上清即為細(xì)胞漿(CP)，沉淀為細(xì)胞膜(CM)。收集各組分，以1.6中制備的抗MAP1068 蛋白小鼠多克隆抗體(1∶1 000)為一抗，兔抗鼠IgG-FITC 抗體(1∶10 000)為二抗，檢測MAP1068 蛋白在MAP 中的定位。

1.8 MAP1068 蛋白的酶活性測定 參照文獻(xiàn)[7]方法，在20 μL 反應(yīng)體系中，以20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)為反應(yīng)buffer，分別以5 μg 的MAP1068 蛋白、20 μg 的酪蛋白作為空白對照組，實(shí)驗(yàn)組加入5 μg 的MAP1068 蛋白和20 μg 的酪蛋白，37 ℃共孵育過夜，SDS-PAGE 電泳檢測其活性。

2 結(jié) 果

2.1map10 68基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pET28amap1068的鑒定 以MAP K10 株DNA 為模板，F(xiàn)/R 為引物擴(kuò)增map1068基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段長度與預(yù)期相符(圖1)。重組質(zhì)粒pET28a-map1068經(jīng)測序分析，結(jié)果顯示目的基因無堿基的突變、插入和缺失。表明重組質(zhì)粒pET28a-map1068正確構(gòu)建。

圖1 map1068 基因的PCR 擴(kuò)增Fig.1 Amplification of map1068 by PCR

2.2 MAP1068 蛋白的表達(dá)與純化 將重組質(zhì)粒pET28a-map1068轉(zhuǎn)化至E.coliBL21，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后利用SDS-PAGE 檢測表達(dá)情況。結(jié)果顯示，MAP1068 蛋白以包涵體形式表達(dá)(圖2)，包涵體經(jīng)變性、復(fù)性后純化，通過不同濃度的咪唑洗脫，獲得高純度蛋白，經(jīng)測定蛋白濃度為10 mg/mL。

圖2 MAP1068 蛋白表達(dá)的SDS-PAGE 檢測Fig.2 Identification of MAP1068 protein expression by SDS-PAGE

2.3 MAP1068 蛋白的western blot 和質(zhì)譜分析將純化后的MAP1068 蛋白進(jìn)行western blot 分析，結(jié)果顯示目的條帶大小與預(yù)期一致(圖3)。純化后的MAP1068 蛋白經(jīng)肽質(zhì)量指紋圖譜分析，結(jié)果顯示純化后的蛋白即為MAP1068 蛋白。

圖3 MAP1068 蛋白的western blot 鑒定Fig.3 Verification of MAP 1068 protein by western blot

2.4 MAP1068 蛋白多克隆抗體效價的測定及其亞細(xì)胞定位 純化后的MAP1068 蛋白免疫小鼠得到陽性血清，經(jīng)ELISA 檢測，結(jié)果顯示其效價為1∶204 800(在某一個稀釋度下OD450nm的值≥陰性血清2.0 倍以上即判定為有效價)，表明MAP1068 蛋白具有良好的抗原性。經(jīng)western blot 分析結(jié)果顯示，MAP1068蛋白主要定位于MAP K10 標(biāo)準(zhǔn)株的細(xì)胞壁(圖4)，表明MAP1068 蛋白是一種胞外蛋白。

圖4 MAP1068 蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.4 Localization of MAP1068 protein in MAP K10 strain

2.5 MAP1068 蛋白酶的活性測定 通過設(shè)置MAP1068 蛋白對照、酪蛋白底物對照以及實(shí)驗(yàn)組MAP1068 蛋白與酪蛋白緩沖體系中過夜孵育，經(jīng)SDS-PAGE 檢測結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，酪蛋白的量明顯減少(圖5)，表明MAP1068 蛋白具有良好的蛋白酶活性。

圖5 MAP1068 蛋白的酶活性測定Fig.5 Determination of MAP1068 proteion activity

3 討 論

多種病原微生物均能產(chǎn)生胞外半胱氨酸蛋白酶，且在病原體生物學(xué)功能中發(fā)揮作用，如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)半胱氨酸蛋白酶RipA 可能與子代細(xì)胞的分離相關(guān)[2]；豬鏈球菌(Streptococcus suis)分泌的半胱氨酸蛋白酶IgdE，能夠特異性的切割豬的IgG，該蛋白酶在感染期間表達(dá)上調(diào)，可能參與豬鏈球菌在宿主體內(nèi)的定植與致病過程[3]；寄生蟲分泌的半胱氨酸蛋白酶能夠阻止宿主抗體活性效應(yīng)，如阻止補(bǔ)體結(jié)合，使補(bǔ)體失去效應(yīng)，從而在寄生蟲逃避宿主免疫過程中發(fā)揮重要作用[4]。

本研究利用分子克隆和蛋白表達(dá)純化方法獲得了MAP1068 蛋白，通過亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)其位于細(xì)菌胞壁上，蛋白酶活性分析其具有降解酪蛋白底物的功能，結(jié)合MAP1068 的預(yù)測分析結(jié)果，證明MAP1068 蛋白屬于一種胞外半胱氨酸蛋白酶，推測MAP1068 蛋白可能與結(jié)核分枝桿菌RipA、豬鏈球菌IgdE 和寄生蟲半胱氨酸蛋白酶一樣，參與子代細(xì)菌的分裂以及在宿主體內(nèi)的定植和免疫逃避等過程。

酪蛋白是哺乳動物奶中的主要蛋白質(zhì)，牛奶中的蛋白質(zhì)主要以酪蛋白為主。酪蛋白也常作為底物用于測定蛋白酶的水解活性[8]。本研究以酪蛋白為底物，通過對MAP1068 蛋白的水解活性分析發(fā)現(xiàn)，MAP1068 蛋白可以顯著降解酪蛋白，表明該蛋白酶和其它酶類似[9]，具有降解某些特定底物的能力。本研究通過對MAP1068 蛋白的特性研究，確定了其具有胞外半胱氨酸蛋白酶的特性，從抗原和酶學(xué)角度為MAP 致病機(jī)制的研究奠定了良好基礎(chǔ)。