楊貝貝，符 芳，薛 美，馮 力，劉平黃

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150069)

IL-21 屬于多效性I 型細(xì)胞因子，主要由CD4+T細(xì)胞和自然殺傷T (NKT)細(xì)胞產(chǎn)生，在固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中均發(fā)揮著重要作用[1]。IL-21 與其受體結(jié)合后可以介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)：(1)在B 細(xì)胞中，IL-21 可以強(qiáng)力促進(jìn)初始B 細(xì)胞、漿細(xì)胞、記憶性B 細(xì)胞的增殖和分化[2-4]，進(jìn)而促進(jìn)抗體的產(chǎn)生、抗體類別轉(zhuǎn)換；(2)在濾泡輔助性T (Tfh)細(xì)胞中，IL-21 可以上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子BCL-6 和MAF 的表達(dá)，二者是控制Tfh 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵，因此IL-21可以調(diào)節(jié)Tfh 細(xì)胞的發(fā)育[5]；(3)在CD4+T 細(xì)胞中，IL-21 可以促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞分泌IL-22[6]，分泌的IL-22 在粘膜修復(fù)和防御感染中起著重要作用[7-8]；(4)在CD8+T 細(xì)胞中，IL-21 可以作為輔助CD8+T細(xì)胞活化的第三信號，增強(qiáng)CD8+T 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。

豬IL-21 最早發(fā)現(xiàn)于2003 年，其基因定位于豬第8 號染色體(8q22→q23)，豬IL-21 cDNA 由456個堿基對組成，編碼152 個氨基酸[9]。豬IL-21 的氨基酸序列與牛、人和鼠IL-21 分別具有86.2%、77 %和58.4 %的同源性[9]。目前對于人和鼠IL-21 已經(jīng)有許多的研究，而豬IL-21 在免疫應(yīng)答中的作用相關(guān)研究并不多。本研究通過將豬IL-21 序列3' 端加上Fc 標(biāo)簽，構(gòu)建含有豬IgG Fc 標(biāo)簽序列的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)/IL-21-Fc，表達(dá)并純化了具有生物學(xué)活性的豬IL-21 融合蛋白，并對其生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步探究豬IL-21 在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與載體 293T 細(xì)胞和pcDNA3.1 載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；含有豬IL-21-Fc 基因(內(nèi)含豬IL-21 信號肽序列)的pUC57-pigIL-21-Fc 質(zhì)粒(添加NheⅠ與XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn))由南京金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 主要試劑 DL2000 DNA Marker、 Primer STAR DNA 聚合酶和PrimeScript II1st strand cDNA Synthese Kit 購自TaKaRa 公司；T4 DNA 連接酶與限制性內(nèi)切酶購自NEB 公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker、Alexa Fluor 546 標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L)抗體購自Thermo Fisher 公司；Attractene 轉(zhuǎn)染試劑購自QIAGEN 公司；Alexa Fluor 488 標(biāo)記的羊抗豬IgG(H+L)抗體購自SouthernBiotech 公司；IRDye700DX驢抗鼠IgG 購自LI-COR 公司；鼠抗豬IL-21 單克隆抗體(MAb)、建立ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線所用的豬IgG 標(biāo)準(zhǔn)品為本實(shí)驗(yàn)室制備；Biotin 化的鼠抗豬IL-21 MAb 通過將上述IL-21 MAb 標(biāo)記所得；鼠抗豬IgG 購自Bio-Rad 公司；兔抗豬HRP-IgG 多抗購自Abcam 公司；protein A 親和層析樹脂和人CD40L 蛋白購自南京金斯瑞公司；Glycine 與TMB 購自Amresco 公司；HRP-Streptavidin、Tris、DAPI、淋巴細(xì)胞活化劑lipopolysaccharide (LPS)購自Sigma 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 pcDNA3.1(-)/IL-21-Fc 真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 將pUC57-pig IL-21-Fc 質(zhì)粒經(jīng)NheⅠ與XhoⅠ雙酶切后將目的片段亞克隆于pcDNA3.1(-)載體，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-IL-21-Fc。重組質(zhì)粒經(jīng)NheⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定后，由吉林庫美生物科技有限公司測序鑒定。

1.4 豬IL-21 融合蛋白(rpIL-21-Fc)的表達(dá)與檢測將pcDNA3.1/IL-21-Fc 瞬時轉(zhuǎn)染HEK 293T 細(xì)胞，設(shè)置pcDNA3.1(-)空載體轉(zhuǎn)染對照組。在轉(zhuǎn)染36 h 后收集細(xì)胞，經(jīng)4 %多聚甲醛4 ℃固定后，從以下兩個角度驗(yàn)證rpIL-21-Fc 的表達(dá)：以Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗豬IgG (1:100)為直標(biāo)抗體檢測豬Fc 標(biāo)簽的表達(dá)；另以鼠抗豬IL-21 MAb (5 μg/mL)為一抗、Alexa Fluor 546 標(biāo)記的羊抗鼠IgG (1∶200)為二抗檢測豬IL-21 的表達(dá)。DAPI 染核10 min 后，于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光，通過間接免疫熒光(IFA)驗(yàn)證融合蛋白的表達(dá)。

1.5 rpIL-21-Fc 純化效果檢測

1.5.1 純化的rpIL-21-Fc 的western blot 檢測利用protein A 通過親和層析法分離純化1.4 轉(zhuǎn)染上清中的豬IL-21 融合蛋白，SDS-PAGE 檢測純化效果。以鼠抗豬IL-21 MAb (1∶1 000)為一抗，驢抗鼠IgG (1∶10 000)為二抗，western blot 檢測純化的rpIL-21-Fc。

1.5.2 純化的rpIL-21-Fc 的ELISA 檢測以5 μg/mL純化的rpIL-21-Fc 作為包被抗原，Biotin 標(biāo)記的鼠抗豬IL-21 MAb (1 ∶1 000)為一抗，HRP-Streptavidin(1∶600)為二抗，同時沒未包被融合蛋白的孔為空白對照，經(jīng)ELISA 檢測純化的rpIL-21-Fc。

1.6 rpIL-21-Fc 的生物學(xué)活性測定 取新鮮豬外周血，利用密度梯度離心法分離PBMCs[10]。計數(shù)后用PBMC 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個細(xì)胞/mL，同時加入終濃度為10 ng/mL 的LPS 預(yù)刺激PBMCs，200 μL/孔鋪于96 孔板。24 h 后，棄掉原有培養(yǎng)液，向各孔分別加入含不同濃度的豬IL-21 融合蛋白(25 ng/mL、50 ng/mL)與人CD40L(人CD40L 與豬CD40L 高度同源，可以用于刺激豬PBMCs)(1 μg/mL)的培養(yǎng)液，同時設(shè)置正常細(xì)胞對照(不加IL-21+CD40L 刺激)與僅用CD40L 刺激的對照組。參照文獻(xiàn)[11]，通過ELISA 定量檢測刺激后不同時間點(diǎn)(1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、7 d)各組PBMCs 培養(yǎng)上清中IgG 的分泌情況。具體ELISA 步驟如下：以鼠抗豬IgG (1∶250)包被ELISA 板，以上述不同培養(yǎng)條件下收取的PBMC 上清作為一抗，以HRP-兔抗豬IgG (1∶80 000)為二抗。同時以系列稀釋的純化的豬IgG 作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品濃度對應(yīng)的OD450nm值繪制標(biāo)準(zhǔn)IgG 曲線，將各樣品孔(即PBMC 上清)的OD450nm代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，得到樣品孔IgG 的濃度，再乘以樣品體積即為各96 孔分泌豬IgG 的含量。

2 結(jié) 果

2.1 pcDN A-IL-21-Fc 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定pUC57-IL-21-Fc 質(zhì)粒經(jīng)NheⅠ/XhoⅠ雙酶切切下IL-21-Fc 片段，克隆至pcDNA3.1(-)載體中，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-IL-21-Fc。經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切初步鑒定，結(jié)果顯示，在約1200 bp 處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期符合(圖1)。挑選陽性重組質(zhì)粒測序，經(jīng)與GenBank 中登錄的豬IL-21 基因序列(NM_214415)比對，結(jié)果顯示二者序列完全一致，表明構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA-IL-21-Fc。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1/IL-21-Fc 的雙酶切鑒定Fig.1 Identification of pcDNA3.1/IL-21-Fc by double enzyme digestion

2.2 rpIL-21-Fc 表達(dá)的檢測 重組質(zhì)粒pcDNA-IL-21-Fc 轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞36 h 后，采用IFA 分別通過檢測Fc 標(biāo)簽蛋白和IL-21 的表達(dá)來驗(yàn)證rpIL-21-Fc的表達(dá)。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 空載體的對照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA-IL-21-Fc、以AF488 標(biāo)記的羊抗豬IgG 為抗體(檢測融合蛋白中的Fc 標(biāo)簽蛋白)的細(xì)胞有特異性綠色熒光(圖2A)；以鼠抗豬IL-21 MAb 為一抗、AF 546 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 為二抗(檢測融合蛋白的IL-21)的細(xì)胞有紅色熒光(圖2B)。表明重組質(zhì)粒pcDNA-IL-21-Fc 轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后瞬時表達(dá)了rpIL-21-Fc。

圖2 rpIL-21-Fc 中Fc 標(biāo)簽表達(dá)(A)和豬IL-21 蛋白的表達(dá)(B)的IFA 檢測Fig.2 Detection of the expression of Fc tag protein (A)or pig IL-21 protein (B)in IL-21-Fc fusion protein by IFA

2.3 rpIL-21-Fc 的純化效果檢測 將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-IL-21-Fc 轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后通過親和層析法純化轉(zhuǎn)染上清中的目的蛋白。SDS-PAGE 結(jié)果顯示在分子量44 ku 處有清晰單一的目的條帶，大小與預(yù)期符合；western blot 結(jié)果顯示在分子量44 ku處有特異性條帶(圖3A)。經(jīng)測定純化后的rpIL-21-Fc 終濃度為2 150 μg/mL，總體積0.4 mL，即目的蛋白純化效率為0.86 mg/L 轉(zhuǎn)染上清。

通過ELISA 方法檢測純化的rpIL-21-Fc，結(jié)果顯示，與空白對照孔相比，包被了rpIL-21-Fc 的孔OD450nm值明顯升高，結(jié)果呈陽性(圖3B)。以上結(jié)果表明，獲得了純化的rpIL-21-Fc，且其與鼠抗豬IL-21 MAb 有較好的反應(yīng)性。

2.4 rpIL-21-Fc 的生物學(xué)活性分析 為了驗(yàn)證表達(dá)的豬IL-21 的生物活性，分別采用不同濃度純化的rpIL-21-Fc 與人CD40L 共刺激豬PBMCs，ELISA檢測不同刺激條件下IgG 分泌情況；根據(jù)豬IgG 標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出各刺激孔中PBMC 上清IgG 含量(圖4A)。結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞對照組(圖4B 中標(biāo)注“Unstimulated”)或僅CD40L 刺激的對照組相比，純化的豬IL-21+ 人CD40L 共刺激組中，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IgG 分泌明顯升高，且呈現(xiàn)一定的劑量和時間依賴性(圖4B)，表明該真核表達(dá)純化的rpIL-21-Fc 可以與人CD40L 協(xié)同刺激PBMCs 分泌IgG。

圖3 純化的rpIL-21-Fc 的SDS-PAGE (A)、western blot (A)和ELISA (B)檢測Fig.3 Detection of purified porcine IL-21-Fc fusion protein by SDS-PAGE (A), western blot (A)and ELISA (B)

圖4 rpIL-21-Fc 的活性檢測結(jié)果Fig.4 Porcine IL-21 and CD40L synergistically induce IgG secretion

3 討 論

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)體外重組蛋白表達(dá)的常用手段。與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，利用該系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白具有出色的蛋白質(zhì)折疊，糖基化修飾，二硫鍵形成等多種翻譯后修飾的特點(diǎn)，更接近天然構(gòu)象。pcDNA3.1(-)真核表達(dá)載體中所含的CMV 和SV40 啟動子可以實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高效表達(dá)。IgG Fc 標(biāo)簽的添加便于后續(xù)對豬IL-21 的純化，且其不會影響融合蛋白中目的蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，還可以提高目的蛋白在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)量[12]。

IL-21 作為一種多效性的免疫調(diào)節(jié)因子，對B細(xì)胞、T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、DC 細(xì)胞等免疫細(xì)胞均有不同程度的調(diào)節(jié)作用。B 細(xì)胞的活化需要多種共刺激分子的參與，體外IL-21 單獨(dú)刺激B 細(xì)胞僅能夠微弱促進(jìn)IgM 和IgG 產(chǎn)生，僅用CD40L 刺激B 細(xì)胞也僅能產(chǎn)生低水平的IgM 和IgG，而用IL-21+CD40L 共刺激可以強(qiáng)力促進(jìn)IgM 和IgG 分泌[11]。本研究初步探究了純化的重組豬IL-21 蛋白的生物學(xué)功能，結(jié)果顯示IL-21 與CD40L 共刺激豬PBMCs，可明顯增強(qiáng)豬PBMCs 分泌IgG，該結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致[11]。此外，IL-21 與CD40L 通過STAT3 依賴的信號途徑能夠上調(diào)B 細(xì)胞Blimp-1 的表達(dá)來協(xié)同刺激漿細(xì)胞分化和抗體分泌[11]。

臨床上，IL-21 的異常表達(dá)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病等自身免疫病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)；此外，IL-21 對于控制慢性病毒的感染也很關(guān)鍵[13]，例如IL-21 可以通過下調(diào)T 細(xì)胞表面一些抑制性受體如PD-1 以及上調(diào)某些細(xì)胞因子的表達(dá)來重塑HBV 特異性的CD8+T 細(xì)胞的抗病毒活性[14]，因此其對于慢性乙肝患者體內(nèi)HBV 的清除至關(guān)重要。近年來IL-21 也作為免疫佐劑，廣泛應(yīng)用于疫苗的研發(fā)策略中[15]。

綜上，本研究中豬IL-21 的表達(dá)為進(jìn)一步利用rpIL-21-Fc 建立體外培養(yǎng)豬B 細(xì)胞的方法、以及探究其在T 細(xì)胞免疫應(yīng)答中的作用提供了有力的工具。