李德棟，向文杰，林 俊，朱遠(yuǎn)茂，薛 飛

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/大動(dòng)物傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150069)

牛副流感(Bovine parainfluenza)是由牛副流感病毒3 型(Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)感染引起的牛急性接觸性傳染病，是牛呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)的一種主要病原，該病原于1959 年在美國(guó)首次被分離報(bào)道，也曾被稱為“船運(yùn)熱”(Shipping fever)[1]。該病原可以從表現(xiàn)正常的牛、流產(chǎn)的胎牛和表現(xiàn)有牛呼吸道疾病癥狀的病牛體內(nèi)分離，斷奶初期的小牛最易感[2]。研究表明BPIV3 在我國(guó)已經(jīng)呈廣泛流行趨勢(shì)[3-4]，因此研究開(kāi)發(fā)針對(duì)BPIV3 血清抗體的診斷技術(shù)，對(duì)于該病的預(yù)防和控制以及未來(lái)疫苗的免疫監(jiān)測(cè)均具有重要的意義。

BPIV3 屬副黏病毒科呼吸道病毒屬，有囊膜結(jié)構(gòu)，基因組為單股負(fù)鏈RNA，核酸全長(zhǎng)約15 kb，不同基因型病毒間的核酸大小有差異[5]。病毒基因組編碼6 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，包括核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、聚合酶蛋白(L)、基質(zhì)蛋白(M)、血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)和融合蛋白(F)。其中N 蛋白在病毒粒子結(jié)構(gòu)中是含量最高的，與病毒的RNA 結(jié)合以保護(hù)病毒核酸結(jié)構(gòu)，遵守副黏病毒的“六堿基原則”[6]，N 蛋白在不同基因型間高度保守，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體[7]。因此，N 蛋白是檢測(cè)BPIV3 血清抗體的首選抗原。本研究以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化了BPIV3 重組N 蛋白，以其作為包被抗原，通過(guò)優(yōu)化ELISA 的主要反應(yīng)條件，初步建立了檢測(cè)BPIV3 血清抗體的間接ELISA 方法，并對(duì)采自內(nèi)蒙古兩個(gè)不同地區(qū)的牛血清進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 BPIV3 SD0835 株、MDBK 細(xì)胞、表達(dá)質(zhì)粒pET30a、克隆用菌E.coliDH5α、表達(dá)用菌BL21 (DE3)、BPIV3 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)、陰性血清、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)兔源陽(yáng)性血清與牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)兔源陽(yáng)性血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存。符合率試驗(yàn)用77 份陽(yáng)性血清和17 份陰性血清采自內(nèi)蒙古；394 份接種BPIV3 滅活疫苗的牛血清樣品由本實(shí)驗(yàn)室采自內(nèi)蒙古通遼地區(qū)；95 份未接種BPIV3 滅活疫苗的牛血清采自內(nèi)蒙古海拉爾地區(qū)。

1.2 主要試劑 蛋白純化試劑盒購(gòu)自GE 公司；兔抗牛IgG-HRP 購(gòu)自Sigma 公司；3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購(gòu)自北京泰天河生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒、RNA 反轉(zhuǎn)錄酶、蛋白Marker、限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ、XhoⅠ均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司；T4 DNA 連接酶購(gòu)自NEB 公司；Prime START HS DNA Poymerase 和DNA Marker 購(gòu)自TaKaRa 公司；病毒核酸提取試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank 中BPIV3 SD0835 株的NP 基因序列(HQ530153)設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增NP 基因的引物，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 503 bp。根據(jù)表達(dá)載體pET30a 的特征，在上下游引物中分別引入EcoRⅤ和XhoⅠ(粗體部分)，引物序列分別為：NP-F：5'-CCGATATCCGCAGGCAGGAAAACA TA-3'/NP-R：5'-ACCTCGAGTGCGCTGAACAGGTCATCTA-3'，由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-NP 的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)利用病毒核酸提取試劑盒提取SD0835 株的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，利用引物NP-F/NP-R 擴(kuò)增NP 基因片段。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃3 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃90 s，共32 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并回收純化目的片段。將純化的NP 基因片段和pET30a 質(zhì)粒分別用EcoRⅤ和XhoⅠ雙酶切后過(guò)夜連接，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pET30a-NP。pET30a-NP 轉(zhuǎn)化E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)菌，經(jīng)IPTG (終濃度0.6 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)后，采用SDS-PAGE 電泳分析重組蛋白。

1.5 重組N 蛋白的純化及鑒定 收集200 mL 誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，離心收集菌體超聲裂解后收集上清，采用Ni 柱純化重組蛋白。以本實(shí)驗(yàn)室保存的BPIV3 陽(yáng)性牛血清為一抗(1:50)，37 ℃孵育1 h，兔抗牛IgG-HRP (1:8 000)為二抗，采用western blot 檢測(cè)表達(dá)蛋白。純化后重組蛋白采用BCA 法測(cè)定濃度。同時(shí)設(shè)置BL21 (DE3)菌體超聲處理后的樣品為陰性對(duì)照，經(jīng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白條帶。

1.6 間接ELISA 方法的優(yōu)化及建立 將純化的重組N 蛋白利用BCA 試劑測(cè)定濃度，采用方陣法優(yōu)化重組N 蛋白包被濃度(0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、 0.8 μg/mL、 1.6 μg/mL、 3.2 μg/mL、6.4 μg/mL、12.8 μg/mL)，血清稀釋度(100 倍、200倍、400 倍、800 倍稀釋)，抗原包被條件(4 ℃過(guò)夜、37 ℃1 h、37 ℃2 h)，封閉條件(1 %明膠、2 %明膠、3 %明膠在37 ℃封閉1 h、37 ℃封閉2 h 以及4 ℃包被過(guò)夜；5 %脫脂乳、10 %馬血清、20 %馬血清在4 ℃封閉過(guò)夜、37 ℃封閉1 h、37 ℃封閉2 h)，兔抗牛IgG-HRP 稀釋度(4 000 倍、6 000 倍、8 000倍、10 000 倍、12 000 倍)，二抗孵育時(shí)間(40 min、60 min、80 min)，TMB 顯色時(shí)間(5 min、10 min、15 min、20 min)等以確定最佳反應(yīng)條件。

1.7 臨界值的確立 利用60 份經(jīng)病毒中和試驗(yàn)(VN)確定為BPIV3 陰性的牛血清，以建立的間接ELISA 方法檢測(cè)，計(jì)算OD450nm值的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，以X+3SD 值作為cut-off 值，判定陰陽(yáng)性血清的標(biāo)準(zhǔn)。

1.8 特異性試驗(yàn)

1.8.1 阻斷試驗(yàn)10 份樣品(5 份陽(yáng)性血清、5 份陰性血清)與BPIV3 病毒懸浮液于37 ℃作用2 h，按照建立的ELISA 方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)阻斷前后的OD450nm值變化判定阻斷效果。

1.8.2 交叉阻斷反應(yīng)試驗(yàn)由于國(guó)內(nèi)大多數(shù)牛含有針對(duì)BPIV3 的抗體，因此本研究分別采用IBRV 兔源陽(yáng)性血清與BVDV 兔源陽(yáng)性血清進(jìn)行了阻斷試驗(yàn)，以確定重組N 蛋白與上述兩種牛的主要病原是否存在血清學(xué)交叉反應(yīng)。具體操作過(guò)程為：先用IBRV 或BVDV 的兔源陽(yáng)性血清加入重組N 蛋白包被的ELISA 板孵育1 h，去掉血清洗滌3 次。然后加入BPIV3 的牛陽(yáng)性血清再次孵育1 h，同時(shí)設(shè)牛BPIV3 標(biāo)準(zhǔn)陰性與陽(yáng)性血清分別作為對(duì)照。根據(jù)阻斷前后的OD450nm值變化判定阻斷效果。

1.9 敏感性試驗(yàn) 取1 份BPIV3 陽(yáng)性血清，以PBS作2 倍倍比稀釋(1∶10～1∶1 280)，再以建立的間接ELISA 方法檢測(cè)稀釋后的牛血清，確定其敏感性。

1.10 重復(fù)性試驗(yàn) 選取5 份BPIV3 陽(yáng)性血清，每份血清樣品做8 個(gè)重復(fù)，利用本研究建立的間接ELISA 方法檢測(cè)，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；以5 個(gè)不同批次純化重組蛋白包被后，以本研究建立的方法檢測(cè)上述血清樣品，進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)。最后對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.11 符合率試驗(yàn) 選取94 份牛血清，利用本研究建立的間接ELISA 和VN 試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，判定兩種檢測(cè)方法的符合率。VN 試驗(yàn)的操作程序?yàn)椋捍龣z牛血清以含3 %犢牛血清的MEM 培養(yǎng)液作倍比稀釋(1∶2～1∶16)，與同樣以含3 %犢牛血清的MEM 培養(yǎng)液稀釋至200 個(gè)TCID50的病毒液做等體積混合后于37 ℃孵育1 h，將96 孔板中單層MDBK細(xì)胞的培養(yǎng)液棄去，加入孵育后的混合液，100 μL/孔，每個(gè)血清稀釋度重復(fù)4 個(gè)孔，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)，培養(yǎng)120 h 后判定結(jié)果。以至少50 %細(xì)胞孔沒(méi)有出現(xiàn)CPE 的血清最大稀釋度為中和抗體效價(jià)，BPIV3 的VN 試驗(yàn)的判定標(biāo)準(zhǔn)為牛血清效價(jià)≥1∶2 均判定為陽(yáng)性，其它判定為陰性。

1.12 牛血清樣品的檢測(cè) 以建立的間接ELISA 對(duì)內(nèi)蒙古通遼地區(qū)采集的接種了BPIV3 滅活疫苗的394 份牛血清和從內(nèi)蒙古海拉爾地區(qū)采集的未接種BPIV3 滅活苗的95 份牛血清進(jìn)行檢測(cè)，在檢測(cè)免疫牛血清抗體產(chǎn)生情況的同時(shí)，也了解未免疫牛的BPIV3 的感染情況，以進(jìn)一步判定該方法的適用性。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pET30a-NP 的構(gòu)建 以BPIV3 SD0835 株RNA 為模板，利用RT-PCR 擴(kuò)增NP 基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示得到約1 500 bp 的特異性片段，與預(yù)期大小相符(圖1)。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序分析，結(jié)果顯示目的基因的序列與SD0835 株NP 基因同源性為100 %，表明正確構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30-NP。

圖1 NP 基因的RT-PCR 擴(kuò)增Fig.1 Amplification of the NP gene by RT-PCR

2.2 重組蛋白的表達(dá)及純化 轉(zhuǎn)化pET30-NP 的重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)鎳柱在非變性條件下純化，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)顯示，在70 ku 位置出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)，表明重組蛋白正確表達(dá)。Western blot 鑒定結(jié)果顯示，在約70 ku處出現(xiàn)了特異性目的條帶(圖3)，與預(yù)期相符，表明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

圖2 重組N 蛋白純化效果檢測(cè)Fig.2 Purification of the recombinant nucleocapsid protein

2.3 間接ELISA 方法反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果及臨界值的確定 對(duì)BPIV3 的間接ELISA 主要反應(yīng)條件優(yōu)化的結(jié)果見(jiàn)表1。以建立的間接ELISA 方法測(cè)定60份BPIV3 陰性牛血清，結(jié)果顯示OD450nm值呈正態(tài)分布(圖4)，經(jīng)計(jì)算該方法臨界值為0.223，即OD450nm值大于0.223 時(shí)判定為陽(yáng)性，OD450nm值小于0.223 時(shí)判定為陰性。

圖3 重組N 蛋白的western blot 鑒定Fig.3 Recombinant nucleocapsid protein reacted with the bovine positive serum against BPIV3

表1 間接ELISA 方法反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions of the indirect ELISA

圖4 60 份牛陰性血清間接ELISA 檢測(cè)結(jié)果正態(tài)分布圖Fig.4 Detection of 60 negative serum samples by indirect ELISA

2.4 特異性試驗(yàn)

2.4.1 阻斷試驗(yàn)結(jié)果5 份陽(yáng)性血清經(jīng)ELISA 檢測(cè)，結(jié)果顯示其OD450nm值的下降比較明顯，均在35 %以上，而5 份陰性血清的OD450nm值變化不明顯(表2)，表明BPIV3 能夠有效阻斷包被抗原與陽(yáng)性血清的結(jié)合，重組N 蛋白具有較強(qiáng)的特異性。

2.4.2 交叉阻斷反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果采用其它兩種常見(jiàn)的牛呼吸道病毒IBRV 與BVDV 的兔源陽(yáng)性血清先與重組N 蛋白包被的ELISA 板反應(yīng)，再用BPIV3的牛陽(yáng)性血清與其反應(yīng)，顯示以該ELISA 方法測(cè)定的OD450nm值與對(duì)照牛BPIV3 陽(yáng)性血清的OD450nm值比無(wú)明顯差異(圖5)，表明IBRV 和BVDV 的兔源陽(yáng)性血清不與重組N 蛋白反應(yīng)，未能阻斷牛BPIV3 陽(yáng)性血清與包被的重組N 蛋白反應(yīng)，表明IBRV 與BVDV 的陽(yáng)性血清不與BPIV3 的重組N 蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。

表2 阻斷試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Blocking test with BPIV3

圖5 交叉反應(yīng)阻斷試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 The results of cross-reaction blocking test

2.5 敏感性試驗(yàn) 將BPIV3 陽(yáng)性血清分別做1∶10～1∶1 280 倍倍比稀釋后，按照建立的ELISA 方法檢測(cè)。結(jié)果顯示，BPIV3 陽(yáng)性牛血清1∶640 稀釋后仍可判定為陽(yáng)性，表明該方法敏感性較高。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別選取5 份BPIV3 陽(yáng)性牛血清進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)小于6 %，批間的重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)小于12 % (表3)，表明本研究建立的ELISA 方法具有較好的重復(fù)性。

表3 間接ELISA 重復(fù)性試驗(yàn)(n=5)Table 3 Repeatability assay for indirect ELISA(n=5）

2.7 符合率試驗(yàn)結(jié)果 利用本研究建立的方法和VN 試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了94 份牛血清，結(jié)果顯示77 份VN 試驗(yàn)為陽(yáng)性的牛血清中的76 份經(jīng)間接ELISA 檢測(cè)為陽(yáng)性，而17 份VN 試驗(yàn)為陰性的牛血清中有16 份經(jīng)間接ELISA 檢測(cè)為陰性，二者總符合率為98 %，表明本研究建立的間接ELISA 方法與VN 試驗(yàn)具有較高的符合率。

2.8 牛血清樣品檢測(cè)結(jié)果 利用本研究建立的間接ELISA 方法對(duì)接種過(guò)BPIV3 滅活苗的394 份牛血清和未接種BPIV3 滅活苗的95 份牛血清進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示接種疫苗的394 份牛血清OD450nm值較高，均呈強(qiáng)陽(yáng)性，表明免疫牛均產(chǎn)生了BPIV3 的抗體；未接種疫苗的95 份牛血清中有76 份檢測(cè)為陽(yáng)性，19 份為陰性，BPIV3 的血清陽(yáng)性率為80 %。表明該地區(qū)的BPIV3 的血清陽(yáng)性率較高。

3 討 論

目前BPIV3 感染已經(jīng)在全球范圍內(nèi)流行，部分未免疫國(guó)家的牛群中成年牛的BPIV3 血清陽(yáng)性率可高達(dá)73 %[8]。BPIV3 感染牛易引發(fā)肺部病變和免疫抑制從而繼發(fā)細(xì)菌感染，乃至于引發(fā)嚴(yán)重的支氣管炎，這是地方性犢牛肺炎的主要病因[9]。針對(duì)該病的血清學(xué)診斷方法主要是病毒中和試驗(yàn)，而病原的實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)方法依然是普通PCR 與熒光定量PCR[10]等分子診斷方法。OIE 在2015 年召開(kāi)的第21屆獸藥注冊(cè)會(huì)議中提出牛副流感的血清學(xué)檢測(cè)推薦使用ELISA 和VN 試驗(yàn)。目前國(guó)內(nèi)絕大部分實(shí)驗(yàn)室對(duì)于牛副流感的血清學(xué)診斷主要依賴于VN 試驗(yàn)。VN 的結(jié)果雖然準(zhǔn)確度高，可信度強(qiáng)，但其試驗(yàn)周期長(zhǎng)，不利于大規(guī)模牛血清樣品的檢測(cè)。而ELISA方法具有敏感性高和特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、快速和高通量檢測(cè)等特點(diǎn)，在病毒學(xué)、免疫學(xué)和血清學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，是當(dāng)前動(dòng)物傳染病檢疫、流行病學(xué)調(diào)查和免疫監(jiān)測(cè)廣泛采用的血清學(xué)診斷技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有檢測(cè)BPIV3 血清抗體的成熟ELISA 方法，為此本研究選擇間接ELISA 方法作為檢測(cè)BPIV3 抗體的診斷方法是確實(shí)可行的，也是迫切需要的。

N 蛋白在不同基因型的BPIV3 間高度保守，并能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體[7]，因此本研究將N 蛋白作為檢測(cè)BPIV3 抗體的包被抗原。同時(shí)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是一種比較高效的制備重組抗原的方法，而B(niǎo)PIV3 的N 蛋白沒(méi)有糖基化位點(diǎn)，適合用原核表達(dá)系統(tǒng)。為此，本研究利用大腸桿菌表達(dá)了重組N 蛋白，利用純化的N 蛋白包被ELISA 板，初步建立了檢測(cè)BPIV3 抗體的間接ELISA 方法。通過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，進(jìn)一步完善了該間接ELISA 方法。在優(yōu)化反應(yīng)條件的過(guò)程中，主要以P/N 值作為優(yōu)化的重要依據(jù)，同時(shí)兼顧操作的便捷性。在封閉液選擇過(guò)程當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)使用1 %明膠作為封閉液效果較佳，ELISA 反應(yīng)中的背景值明顯降低，提高了檢測(cè)的可靠性。已有報(bào)道用病毒與陽(yáng)性血清共孵育后通過(guò)阻斷試驗(yàn)可以評(píng)價(jià)間接ELISA 的特異性[11]，為此本研究參照阻斷ELISA 方法原理[12]，利用培養(yǎng)的BPIV3與陽(yáng)性牛血清進(jìn)行了阻斷試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)了BPIV3可以阻斷陽(yáng)性牛血清與重組抗原N 蛋白的反應(yīng)，表明該方法的特異性較強(qiáng)。同時(shí)國(guó)內(nèi)絕大部分牛血清均含有BPIV3 的抗體，本研究則利用兔源的IBRV和BVDV 的陽(yáng)性血清與重組N 蛋白進(jìn)行了交叉阻斷反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果重組N 蛋白不與上述兩種牛的常見(jiàn)病原發(fā)生血清學(xué)交叉反應(yīng)，顯示該方法具有較強(qiáng)的特異性。此外本研究將建立的間接ELISA 與VN 試驗(yàn)對(duì)94 份牛血清進(jìn)行了比較試驗(yàn)，結(jié)果總體符合率為98 %。

BPIV3 目前尚未列入我國(guó)動(dòng)物疫病目錄，為國(guó)內(nèi)新發(fā)病原。國(guó)內(nèi)在對(duì)BPIV3 進(jìn)行了病原學(xué)研究的同時(shí)，也對(duì)其進(jìn)行了一些血清流行病學(xué)調(diào)查。2012年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)所的研究人員采用VN 試驗(yàn)檢測(cè)了采自內(nèi)蒙古、吉林和山西的482 份牛血清，結(jié)果439 份牛血清呈BPIV3 血清中和抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性率為91.1 %[3]。隨后從黑龍江、遼寧、新疆、云南、貴州、廣西、河北、山東、河南、江西、湖南和福建等12 個(gè)省區(qū)采集了牛血清樣品2 489 份，用VN 試驗(yàn)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果1 932 份樣品呈陽(yáng)性，BPIV3 血清抗體陽(yáng)性率為77.6 %[4]。本研究利用建立的間接ELISA 方法對(duì)采自內(nèi)蒙古海拉爾地區(qū)的未免疫牛副流感疫苗的95 份牛血清進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果檢出陽(yáng)性樣品76 份，陽(yáng)性率為80 %，接近國(guó)內(nèi)12個(gè)省區(qū)檢測(cè)的平均血清陽(yáng)性率[4]。同時(shí)，利用該方法檢測(cè)了采自內(nèi)蒙古通遼地區(qū)的394 份免疫牛副流感疫苗的牛血清，結(jié)果所有血清均為陽(yáng)性。利用本研究建立的間接ELISA 對(duì)采自內(nèi)蒙古兩個(gè)不同地區(qū)的牛血清樣品的初步檢測(cè)結(jié)果表明，該方法可以試用于國(guó)內(nèi)BPIV3 的血清流行病學(xué)調(diào)查及疫苗免疫后的抗體監(jiān)測(cè)，對(duì)我國(guó)BPIV3 的防控具有重要的意義。