劉旻翾，丁光明，付鈺廣，劉愛紅，陳佳寧，李寶玉，曾巧英，劉光亮

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州730046)

偽狂犬病(Pseudorabies，PR)，是由皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科、皰疹病毒屬的PR 病毒(PRV)引起，該病原對豬、牛、羊、犬、貓等多種家畜及野生動物均易感[1]。豬是PRV 的天然宿主，各年齡段的豬均易感，不同年齡段的豬表現(xiàn)的癥狀不盡相同[2-3]。豬群一旦發(fā)生PRV 感染，病毒很難被清除，被定義為極難防疫的自然疫源性疾病，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報告動物疫病。目前，一些歐洲和北美國家已將PRV 徹底凈化，但該病依然是我國養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。

目前PRV 的檢測方法主要有PCR、病毒中和試驗(VNT)、血清抗體檢測等[4-8]。PCR 和VNT 因不適宜于大面積的臨床診斷與篩查而難以在實際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用[9-10]。相比上述兩種檢測方法，血清抗體檢測具有操作簡單、敏感性好、能大批量檢測樣品等優(yōu)點，易用于大規(guī)模篩查；另外，ELISA 可以使用純化的合成肽段作為抗原底物，具有批量生產(chǎn)、無需處理活病毒、假陽性率低等優(yōu)點[11]，因而備受臨床從業(yè)人員的青睞。

現(xiàn)階段，國內(nèi)用于PRV 檢測的市售ELISA 試劑盒主要包括OIE 推薦的進口試劑盒及一些國產(chǎn)試劑盒，這些產(chǎn)品大多基于經(jīng)典型PRV 開發(fā)，而2011年以來PRV 在我國發(fā)生了變異[12-14]，因此，基于傳統(tǒng)病毒株開發(fā)的檢測試劑盒嚴(yán)重影響了對該病的檢測與凈化。鑒于此，本實驗室前期分析NCBI 基因庫50 株不同國家、地區(qū)、不同年份的PRV 經(jīng)典株、流行株及變異株，采用DNAStar 軟件對其基因同源性、氨基酸保守性、蛋白結(jié)構(gòu)域及抗原性等進行分析，篩選出涵蓋PRV 經(jīng)典株、流行株及變異株的gB 蛋白高度保守的優(yōu)勢抗原表位區(qū)域，合成該肽段，并命名為gB872(氨基酸序列為： LEQQEHKA RKKNSGPALLASRVGAMATRRRHYQRLESEDPDA)。本研究以該肽段作為包被抗原，建立檢測PRV 抗體的間接ELISA 方法，為PRV 的防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 PRV 標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清為本實驗室制備保存?zhèn)溆茫?6 份疫苗免疫抗體陽性血清采自四川祁陽某豬場；1 份PRV 野毒感染豬陽性血清和50 份陰性血清由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所畜禽重要人獸共患病團隊惠贈；50 份PRV 抗體陽性血清，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所宿主抗病毒感染然與免疫生物學(xué)團隊惠贈。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、O 型口蹄疫病毒(serotype O FMDV)等陽性血清由蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫防控技術(shù)團隊惠贈；90 份臨床血清樣品采自青海某仔豬繁育基地。

肽段PRV gB872由上海吉爾生物技術(shù)有限公司合成；羊抗豬IgG-HRP 購自美國SouthernBiotech 公司；TMB 底物顯色液購自BioFX 公司；96 孔可拆式酶標(biāo)板購自Corning 公司；BSA 購自BioFROXX公司；PRV gB 蛋白抗體ELISA 檢測試劑盒購自荷蘭BioCheck 公司；IDEXX PRV/ADV gI (gE)抗體檢測盒、IDEXX PRV/ADV gB 抗體檢測試劑盒均購自美國IDEXX 公司。

1.2 PRV-gB 間接ELISA 的優(yōu)化結(jié)果 使用棋盤法對gB872抗原包被濃度(50 ng/100 μL～400 ng/100 μL)，PRV 陽性血清稀釋度(1∶25～1∶400)進行優(yōu)化；在確定抗原包被濃度及一抗稀釋比后，進一步對羊抗豬HRP-IgG (1∶1 000～1∶10 000)、底物顯色時間(3 min～11 min)進行優(yōu)化，根據(jù)P/N 值的高低確定最佳反應(yīng)條件。在確立該抗原最優(yōu)條件后，根據(jù)P/N 值選擇綜合評價最高的實驗結(jié)果為該方法最佳反應(yīng)條件。

1.3 PRV-gB 間接ELISA 陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的建立利用已優(yōu)化的PRV 間接ELISA 方法，對PRV 陽性、陰性血清樣品各50 份檢測OD450nm值，并計算標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清OD450nm的差值，分別計算出標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清的平均OD450nm值，以S/P 值作為判定陰陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 特異性試驗 按已建立的PRV 間接ELISA 方法檢測PRRSV、PCV2、CSFV、FMDV(O)陽性豬血清，各設(shè)置3 個重復(fù)，同時設(shè)立PRV 陽性血清及陰性血清為對照，評價該方法的特異性。另采用荷蘭BioCheck 公司試劑盒檢測各血清，比較二者結(jié)果。

1.5 敏感性試驗 取PRV 陽性血清按1∶2～1∶2 048進行2 倍倍比稀釋，分別利用建立的ELISA 方法和PRV/ADV gB 抗體檢測試劑盒進行檢測，評估本研究建立的ELISA 方法的敏感性。

1.6 重復(fù)性試驗 選取5 份血清樣品，用同一批次包被的3 個不同ELISA 板進行批內(nèi)重復(fù)性檢測；另采用3 個不同批次包被的ELISA 板對上述5 份血清樣品，利用建立的ELISA 方法進行批間重復(fù)性檢測，計算批內(nèi)或批間變異系數(shù)(CV=SD/X×100 %)，評估該ELISA 檢測方法的重復(fù)性。

1.7 臨床樣品的檢測 利用已建立的PRV 間接ELISA 方法對90 份臨床血清樣品分別進行檢測，每份血清設(shè)置2 個重復(fù)。同時利用OIE 推薦的荷蘭BioChek PRV-gB 檢測試劑盒對以上臨床樣品進行檢測，比較二者檢測結(jié)果，并計算兩種ELISA 方法的符合率。

1.8 PRV 野毒感染及疫苗免疫血清的檢測 利用IDEXX PRV/ADV gI (gE)抗體檢測試劑盒及IDEXX PRV/ADV gB 抗體檢測試劑盒分別對1 份野毒感染豬陽性血清及16 份免疫豬血清同時檢測，然后根據(jù)以上試劑盒檢測結(jié)果相互交叉驗證，進一步確定并區(qū)分所獲陽性血清中的PRV 野毒感染血清和疫苗免疫血清(因荷蘭BioChek 公司PRV 抗體檢測試劑盒無法區(qū)分野毒感染與疫苗免疫產(chǎn)生的抗體，所以利用美國IDEXX 公司的2 個檢測試劑盒進行交叉驗證，以區(qū)分野毒感染血清及疫苗免疫血清)；最后使用本研究建立的方法再次檢測上述樣品，并與上述結(jié)果比較，驗證本研究建立的方法對野毒感染及疫苗免疫血清的檢測結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 PRV-gB 間接ELISA 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果 使用棋盤法優(yōu)化的各反應(yīng)條件如下：最佳抗原包被濃度為：200 ng/100 μL；包被時間為37 ℃、2 h；最佳封閉物為2.5 % BSA；待檢樣品最佳稀釋比為1∶100，最佳孵育時間為37 ℃、0.5 h；羊抗豬HRPIgG 最佳稀釋度為1∶5 000，最佳孵育時間為37 ℃，2 h；底物最佳顯色條件為37 ℃、5 min。

2.2 PRV-gB 肽段間接ELISA 試劑盒臨界值的確定 利用建立的PRV gB 間接ELISA 方法檢測PRV陽、陰性血清樣品，計算陰性血清與陽性血清OD450nm差值，根據(jù)公式S/P=(樣本OD450nm值-OD450nm陰性對照平均值)/(陽性對照平均OD450nm值-OD450nm陰性對照平均值)以及陰陽性血清的檢測結(jié)果，計算確定S/P≥0.56 為陽性， S/P<0.56 為陰性(圖略)。

2.3 特異性試驗 應(yīng)用本實驗建立的ELISA 方法與荷蘭BioCheck 公司的同類產(chǎn)品對PRRSV、PPV、PCV 2、CSFV、FMDV(O)，PRV 陽性血清樣品進行平行檢測，結(jié)果顯示除PRV 陽性血清結(jié)果為陽性外，其它結(jié)果均為陰性(圖1)，BioCheck 試劑盒的檢測結(jié)果與本實驗室建立的ELISA 方法結(jié)果一致。表明本研究建立的ELISA 方法特異性較強。

圖1 本實驗建立的ELISA 與國外商品化試劑盒特異性比對分析Fig.1 Comparative analysis between commercialized ELISA kits and the kit developed in this study

2.4 敏感性試驗 利用本實驗建立的間接ELISA方法對不同稀釋度的PRV 陽性血清檢測，結(jié)果顯示該ELISA 方法對PRV 陽性血清的最低檢測稀釋度為1∶128；而相同條件下IDEXX PRV/ADV gB 抗體檢測試劑盒檢測下限為1∶4 (圖2)。表明本實驗建立的間接ELISA 方法的敏感性較高。

圖2 ELISA 敏感性試驗結(jié)果Fig.2 The sensitivity test of the indirect ELISA

2.5 重復(fù)性試驗 利用本實驗的間接ELISA 方法進行重復(fù)試驗，結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為7.57%～9.81%，批間變異系數(shù)為2.82%～8.71% (表1)， 均小于10 %。表明建立的間接ELISA 具有良好的重復(fù)性。

表1 間接ELISA 重復(fù)性試驗(n=5)Table 1 Reproducibility assay for indirect ELISA (n=5)

2.6 臨床樣品的檢測結(jié)果 將采集的90 份臨床樣本利用本實驗建立的間接ELISA 方法與荷蘭BioChek 公司產(chǎn)品進行同時檢測，結(jié)果顯示本實驗建立的間接ELISA 方法與BioChek PRV-gB 檢測試劑盒的陽性符合率為100%，陰性符合率為97.67%，總體符合率為97.78 % (表2)。表明本研究建立的方法可以用于臨床樣品的檢測。

表2 兩種ELISA 方法對臨床樣品的檢測結(jié)果Table 2 Calculation of coincidence rate

2.7 PRV 野毒感染與疫苗免疫陽性血清樣品的檢測結(jié)果 利用本實驗建立的間接ELISA 方法與IDEX 試劑盒對1 份野毒感染陽性血清樣品及16 份疫苗免疫陽性血清樣品檢測結(jié)果顯示：a.針對野毒感染血清樣品，IDEXX-gI(gE)試劑盒及IDEXX-gB試劑盒檢測結(jié)果均呈陽性，本實驗室建立的間接ELISA 方法檢測該樣品也呈陽性；b.針對疫苗免疫血清樣品，IDEXX-gI(gE)試劑盒檢測結(jié)果呈陰性，IDEXX-gB 試劑盒及本實驗室建立的間接ELISA 方法檢測該樣品均呈陽性。本方法對野毒感染陽性血清和疫苗免疫陽性血清均可以檢測出，與IDEXX 兩種試劑盒的結(jié)果一致(表3)，但無法區(qū)分野毒感染血清和疫苗免疫血清。

表3 本方法與商品化試劑盒檢測PRV 野毒感染血清與疫苗免疫血清比對分析結(jié)果Table 3 Comparative analysis of antibody detection from PRV vaccinated or infected serum

3 討 論

PR 廣泛分布于世界各國，是對全世界養(yǎng)豬業(yè)危害最嚴(yán)重的疾病之一。目前PR 的防控主要靠gE/gI基因缺失疫苗免疫，采用gB-ELISA 對豬群進行血清抗體檢測[15]。然而，這些ELISA 檢測方法大多基于經(jīng)典型PRV 設(shè)計，而2011 年以來PRV 在我國發(fā)生了大量變異[12-14]，因此，基于經(jīng)典株開發(fā)的檢測試劑盒嚴(yán)重影響了對該病的檢測及疫苗免疫效果的有效評價。目前市售gB-ELISA 檢測試劑盒多數(shù)是基于5 個抗原表位中的1 個或者2 個建立的阻斷ELISA，但近年來PRV 變異株的出現(xiàn)并流行使得gB具有一定的抗原漂移性，并且豬個體間對gB 不同表位的抗體應(yīng)答也顯示出多樣性，因此阻斷ELISA方法可能會出現(xiàn)一定比例的誤判[16-17]。本實驗從gB高度保守的抗原表位區(qū)篩選出優(yōu)勢表位區(qū)段，合成高純度多肽gB872(氨基酸序列為：LEQQEHKAR KKNSGPALLASRVGAMATRRRHYQRLESEDPDA)，以此為包被抗原建立了ELISA 檢測方法，旨在提高ELISA 檢測方法的廣譜性、特異性及敏感性，避免市售試劑盒無法準(zhǔn)確識別目前流行的國內(nèi)變異毒株的缺陷，有效地解決了誤判問題的產(chǎn)生。

本實驗采用間接ELISA 技術(shù)建立PRV 的檢測方法與市售的檢測試劑盒進行比較，顯示二者陽性符合率為100 %，陰性符合率為97.67 %，表明建立的間接ELISA 方法敏感性較高；且采用該方法對PRSV、PPV、PCV2、CSFV、FMDV(O)陽性、PRV陰性血清進行特異性試驗時發(fā)現(xiàn)，本實驗建立的ELISA 方法與BioCheck 公司產(chǎn)品檢測結(jié)果完全一致，無假陽性或交叉反應(yīng)發(fā)生。

經(jīng)對臨床樣品檢測結(jié)果統(tǒng)計分析顯示，本研究建立的ELISA 方法與OIE 推薦的BioCheck PRV-gB間接ELISA 試劑盒比較，不存在顯著性差異，完全可以替代進口試劑盒。同時，該檢測方法可同時檢測由經(jīng)典株、流行株感染及疫苗免疫產(chǎn)生的抗體，有利于在我國動物疫病防控一線推廣應(yīng)用。本研究以PRV gB 蛋白設(shè)計的肽段為包被抗原，建立的間接ELISA 方法具有更好的應(yīng)用價值及市場開發(fā)前景。