孫王楊吉，劉 源，劉子拓，范佳文，石火英

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009)

豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)屬于正黏病毒科，A 型流感病毒屬，能夠引起豬的呼吸道疾病。其在感染宿主時需要先結(jié)合宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體，不同的流感病毒具有不同的受體結(jié)合傾向。人流感病毒傾向于與宿主細(xì)胞表面的α-2,6-唾液酸結(jié)合，而禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)優(yōu)先與α-2,3-唾液酸結(jié)合[1]。豬呼吸道細(xì)胞表面同時具有α-2,6-唾液酸和α-2,3-唾液酸[2]，所以AIV 或人流感病毒均可以直接感染豬[3]。若AIV 和人類流感病毒同時感染豬，則可能在豬體內(nèi)發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新型的流感病毒。因此豬成為禽源、豬源、人源等不同流感病毒基因重組或重配的“混合器”和流感病毒新流行株產(chǎn)生的“孵育器”[4]。有研究表明H9N2 亞型流感病毒可以為其它型流感病毒提供部分或整個內(nèi)部基因，產(chǎn)生新的感染人類的重配體，如H5N1、H7N9、H10N8 和H5N6 病毒等[5]。因此，有必要對SIV 的流行實(shí)時監(jiān)測，分析其遺傳進(jìn)化規(guī)律，監(jiān)測并評估SIV 對人類公共衛(wèi)生安全的潛在威脅。

本研究從有流感病毒癥狀的病豬鼻拭子中分離出一株H9N2 亞型SIV，對分離病毒進(jìn)行了全基因組測序和分析；同時探究其對SPF 雞和豚鼠的致病性，為H9N2 亞型SIV 的遺傳進(jìn)化趨勢和流行病學(xué)特性研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑 SPF 雞胚購自北京梅里埃公司；SPF 雞由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物比較醫(yī)學(xué)中心提供；Hartley 品系，體質(zhì)量約300 g 的雌性健康豚鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。TRI-zol 試劑購自Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑(Prime-Script Reverse Transcriptase)、RNA 酶抑制劑(Rnase Inhibitor)和高保真酶(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)購自寶生物工程(大連)有限公司；H9 亞型、H5 亞型流感病毒陽性血清和新城疫陽性血清為本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 病料樣品的采集及病毒分離 于2015 年在江蘇省某動物醫(yī)院就醫(yī)的疑似流感癥狀的病豬中采集鼻拭子，樣品經(jīng)雙抗處理后用于病毒分離；將處理的拭子樣品上清液取0.2 mL 經(jīng)尿囊腔接種SPF 雞胚， 收取24 h 后死亡的雞胚尿囊液，120 h 未死亡的雞胚，4 ℃過夜，收集其尿囊液并參照OIE 標(biāo)準(zhǔn)方法檢測其HA 效價，同時使用H9 亞型、H5 亞型流感病毒陽性血清和新城疫陽性血清進(jìn)行HI 試驗(yàn)[6]。

1.3 分離病毒的RT-PCR 擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[7]，根據(jù)GenBank 中的相關(guān)基因序列，采用Prime Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)針對H9N2 亞型AIV 8 個基因節(jié)段的特異性通用引物，共12 對，其中PB2、PB1 基因分段擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

采用TRIzol 法提取1.2 分離病毒的總RNA，以其為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，利用特異性通用引物與高保真酶(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)擴(kuò)增目的片段。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃5 min；94 ℃10 s、54 ℃15 s、72 ℃20 s，35 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.4 分離病毒的遺傳進(jìn)化與分子特征分析 將擴(kuò)增得到的8 個基因節(jié)段(MH885509-MH885516)采用Lasergene 7.1 軟件中的Editseq、MegAlign 模塊進(jìn)行序列拼接成全基因組序列。利用Clustal 1.83 軟件，將分離病毒各基因節(jié)段序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中2015年之前的部分禽源、人源、豬源的H9N2 亞型流感病毒相應(yīng)基因序列進(jìn)行同源性比對，同時通過MEGA6 軟件對分離病毒全基因進(jìn)行同源性比對分析、構(gòu)建基因的進(jìn)化樹(文中僅保留HA 基因進(jìn)化樹)，并對病毒基因推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行流感病毒分子特征分析。

1.5 分離病毒雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測定 將1.2 得到的雞胚尿囊液10 倍倍比稀釋(10-4～10-11)，按每個稀釋度經(jīng)尿囊腔途徑接種5 枚10 日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，37 ℃孵育120 h 后檢測各稀釋度血凝效價呈陽性的雞胚數(shù)目，按Reed-Muench 公式計(jì)算出病毒的EID50。

1.6 分離病毒對雞的致病性試驗(yàn) 將8 只3 周齡SPF 雞分為感染組和對照組，每組4 只。將分離的病毒分別經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼、氣管接種途徑進(jìn)行感染，感染劑量分別為50 μL、50 μL、100 μL，病毒量為106EID50/0.2 mL，每只雞的感染劑量為2×106EID50。對照組SPF 雞接種等量的PBS。接種后每天觀察雞的臨床癥狀；感染后第3 d 和第5 d 每組各取3 只雞，分別無菌采集其氣管和肺臟，進(jìn)行病毒滴度測定。以上試驗(yàn)重復(fù)2 次，將3 次的試驗(yàn)結(jié)果合并分析。

1.7 分離病毒對豚鼠的致病性試驗(yàn) 將18 只雌性健康豚鼠分為感染組、直接接觸組和對照組，每組6 只。將豚鼠經(jīng)0.1 mL/只速眠新麻醉，將分離病毒經(jīng)滴鼻途徑感染，每個鼻孔感染劑量為100 μL，病毒量為106EID50/0.2 mL，對照組豚鼠接種等量的PBS。直接接觸組6 只豚鼠與感染組同籠飼養(yǎng)。接種后每天觀察豚鼠的臨床癥狀、采食和飲水情況，定期稱重并記錄采食量；感染后第3 d 和第5 d 每組各取3 只豚鼠，分別無菌采集其鼻甲骨、氣管、肺、脾臟、肝臟和腎臟進(jìn)行病毒滴度測定。以上試驗(yàn)重復(fù)1 次，將2 次的試驗(yàn)結(jié)果合并分析。

2 結(jié) 果

2.1 病毒的分離鑒定結(jié)果 根據(jù)接種病料樣品的雞胚尿囊液HA 和HI 試驗(yàn)結(jié)果，初步表明從病豬鼻拭子中分離得到一株H9 亞型SIV。提取分離病毒的RNA，反轉(zhuǎn)錄后以其為模板對其8 個基因節(jié)段進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增的各基因節(jié)段大小均與預(yù)期目的片段相符。經(jīng)對分離病毒的HA 和NA基因序列比對，表明分離病毒為H9N2 亞型SIV，命名為A/swine/Jiangsu/1/2015 (H9N2)，以下稱為SW/JS/1/15，病毒滴度為109.25EID50/0.2 mL。

2.2 分離病毒的核苷酸同源性和遺傳進(jìn)化分析 通過NCBI 中的BLAST 程序?qū)W/JS/1/15 的全基因序列進(jìn)行比較，得到與分離病毒各基因節(jié)段核苷酸同源性最高的病毒株。下載各參考株序列，使用Megalign 軟件分別與分離病毒各基因節(jié)段進(jìn)行核苷酸同源性比對，結(jié)果顯示分離病毒的各基因節(jié)段序列與各參考株的同源性均在98.5 %以上(表1)。結(jié)果表明分離病毒可能具有為H7N9 等流感病毒提供內(nèi)部基因的潛力。

表1 與分離病毒SW/JS/1/15 (H9N2)的各基因節(jié)段最高同源性的病毒株Table 1 Pertentage homolegy of influenza virus closely related to SW/JS/1/15 (H9N2)swine influenza virus

利用MEGA6 軟件對分離病毒及參考株的各基因節(jié)段進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，分離病毒SW/JS/1/15 的HA 基因與A/chicken/Shandong/JN/1999屬于同一分支，屬于BJ/94 系(圖1)；NA 基因與A/Chicken/Shandong/sd01/2010 屬于同一分支，屬于BJ/94 系；PB2 基因與A/duck/Shantou/7488/2004 屬于同一分支，而DK1 系以A/duck/Shantou/7488/2004 為代表株，所以分離病毒屬于DK1 系；PB1、PA 和NP 基因?qū)儆贔/98 系；M 基因與A/Quail/Hong Kong/G1/97 屬于同一分支，屬于G1/97 系；NS 基因與A/Chicken/Shanghai/F/98 屬于同一分支，屬于BJ/94 系。而目前廣泛流行的G57 基因型H9N2 流感病毒正是由BJ/94 系的HA、NA 和NS 基因，DK1系的PB2 基因，F(xiàn)/98 系的PB1、PA 和NP 基因以及G1/97 系的M 基因組成的。分離病毒8 個基因節(jié)段組成與G57 基因型均相同(圖2)，因此分離病毒屬于G57 基因型。

圖1 分離病毒SW/JS/1/15 (H9N2)HA 基因進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree based on the HA gene of SW/JS/1/15(H9N2)

圖2 分離病毒SW/JS/1/15 (H9N2)8 基因重配示意圖Fig.2 Genome reassortment of SW/JS/1/15(H9N2)

2.3 分離病毒HA、NA 關(guān)鍵位點(diǎn)分析 將分離病毒 HA 關(guān)鍵位點(diǎn)與疫苗株 SH/F/98、 SD/6/96、GD/SS/94 相關(guān)關(guān)鍵位點(diǎn)比較結(jié)果顯示，分離病毒HA 的裂解位點(diǎn)為PSRSSR↓GLF，符合低致病性流感病毒的特征。HA 右側(cè)臂(aa232 ～aa237)出現(xiàn)變化，由3 株疫苗株的QQG 突變?yōu)長MG；在受體結(jié)合位點(diǎn)中，僅198 位點(diǎn)發(fā)生了A198T 突變，其余受體結(jié)合位點(diǎn)保守性較強(qiáng)(表2)。表明198 位點(diǎn)可能在H9N2 流感病毒進(jìn)化過程中起到重要作用。本研究以已公開報道的H9N2 流感病毒的部分抗原位點(diǎn)為范圍，分析分離病毒HA 抗原位點(diǎn)的特點(diǎn)，結(jié)果顯示，相對于疫苗株SH/F/98、SD/6/96、GD/SS/94，分離病毒共有10 個抗原位點(diǎn)發(fā)生了突變，分別是G90E、 S127R、 S145N、 D153G、 N167S、 A168N、 A198T、T200R、N201D、Q235M (H9 numbering)。上述結(jié)果表明分離病毒的HA 抗原表位可能發(fā)生了變異。

以疫苗株SH/F/98、SD/6/96、GD/SS/94 為參照，對NA 關(guān)鍵位點(diǎn)的分析結(jié)果顯示，分離病毒共有6個關(guān)鍵位點(diǎn)發(fā)生變化。其中有4 個突變發(fā)生在紅細(xì)胞吸附位點(diǎn)，分別是K367R、K/E368N、D369N、D401E。其余兩個突變K143N 和T434P 分別發(fā)生在活性中心和抗原決定簇中。同時分離病毒NA 蛋白頸部桿狀結(jié)構(gòu)在aa63～aa65 位置缺失，該部位的3 個氨基酸的缺失被認(rèn)為是中國大陸H9N2 流感病毒分離株的一個標(biāo)記[8]。上述結(jié)果表明，相比最初的疫苗株，分離病毒的NA 蛋白已經(jīng)發(fā)生了演化，具有了新的分子特征，NA 抗原表位和功能活性可能發(fā)生了改變。

表2 分離病毒及疫苗株中HA 受體結(jié)合部位和裂解位點(diǎn)處的氨基酸序列Table 2 Amino acid sequences at the receptor binding site and cleavage site of the isolates and vaccine strains

2.4 分離病毒潛在糖基化位點(diǎn)分析 分離病毒與人源H9N2 參考株一樣，均有9 個潛在糖基化位點(diǎn)，其中因發(fā)生S145N 突變而在HA 的145 位新增1 個潛在糖基化位點(diǎn)NGT，因發(fā)生T220V 突變導(dǎo)致218 位潛在糖基化位點(diǎn)缺失，因發(fā)生P315S 突變而在313 位新增1 個潛在糖基化位點(diǎn)NCS。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)反向遺傳突變研究發(fā)現(xiàn)，缺失218 位糖基化位點(diǎn)，同時增加313 位糖基化位點(diǎn)的病毒的抗原性未發(fā)生變化，但毒力呈微弱的增加[9]。

2.5 分離病毒對雞的致病性試驗(yàn)結(jié)果 分離病毒分別經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼、氣管途徑人工感染SPF 雞2 d 后出現(xiàn)精神不振，食欲減退等臨床癥狀；對照組SPF雞未出現(xiàn)明顯癥狀。感染組在感染后第3 d 檢測結(jié)果顯示氣管和肺組織分離病毒的EID50分別為104.5EID50/0.2 mL 與102.88EID50/0.2 mL；感染后第5 d 采集的氣管和肺組織分離病毒的EID50分別為102.75EID50/0.2 mL 與101.75EID500/0.2 mL。對照組雞氣管和肺組織中未分離到病毒(圖3)。結(jié)果表明，分離病毒SW/JS/1/15 能夠直接感染雞并引起明顯的臨床癥狀。

圖3 分離病毒感染3 d 和5 d 后SPF 雞臟器病毒的滴定結(jié)果Fig.3 Virus titers in organs of SPF chicken at 3 days and 5 days post infection

2.6 分離病毒對豚鼠的致病性試驗(yàn)結(jié)果 分離病毒經(jīng)滴鼻人工感染豚鼠后2 d 后出現(xiàn)聚堆，精神不振等臨床癥狀。感染后第5 d 在豚鼠鼻甲骨組織中分離出病毒，肺、氣管等其余組織中未分離到病毒。測得其EID50為101.25EID50/0.2 mL；而在感染后第3 d的豚鼠所有組織中均未分離出病毒。直接接觸組與對照組豚鼠并未出現(xiàn)異常表現(xiàn)，其組織中也未分離出病毒。結(jié)果表明分離病毒SW/JS/1/15 能夠感染豚鼠，但不能在豚鼠中水平傳播。

3 討 論

H9N2 亞型SIV 屬于低致病性流感病毒，主要表現(xiàn)為高致病率與低死亡率，對畜牧業(yè)影響較大。本研究分離的SIV 核苷酸同源性分析結(jié)果顯示，分離病毒的8 個基因節(jié)段與兩株禽源H9N2 亞型流感病毒A/chicken/Huzhou/3801/2013 (H9N2)和A/Chicken/Zhejiang/W41/2013 (H9N2)的8 個基因節(jié)段均高度同源，推測該分離病毒是一株AIV 直接感染豬的病例；分離病毒PB1、PB2、PA、M、NP 與NS 等6個內(nèi)部基因節(jié)段與兩株人源H7N9 亞型流感病毒A/Anhui/1-BALF_RG8/2013 (H7N9)和 A/Anhui/1-DEWH730/2013(H7N9)的6 個內(nèi)部基因高度同源。本研究分離到的SIV 可能是上述禽源H9N2 亞型AIV 和人源H7N9 亞型流感病毒的紐帶，也表明豬不僅是流感病毒基因重組的天然混合器，還在AIV 從禽類宿主到哺乳動物宿主的跨種傳播中發(fā)揮重要作用。遺傳進(jìn)化分析表明，本研究分離病毒8 個基因節(jié)段均屬于G57 基因型。自2007 年以來，G57 病毒已經(jīng)傳播到家養(yǎng)水禽、野生鳥類和豬中。2013 年出現(xiàn)的H7N9 病毒內(nèi)部基因與H9N2 亞型G57 基因型病毒的主要內(nèi)部基因最為相似[10]。在2010 年后，在禽、豬或人中分離的H7N9 以外亞型的新型重配體(例如H5N2、H7N7 和H10N8 病毒)也同樣具有G57 基因型內(nèi)部基因[11]。因此，推測分離病毒具有為多種流感病毒提供內(nèi)部基因的潛力。

分離病毒HA 基因的裂解位點(diǎn)為PSRSSR*GL，符合低致病性流感的特征。有研究表明H9N2 病毒已經(jīng)獲得了感染人類的受體結(jié)合特征，能夠增加病毒在人類和豬呼吸道中重配的可能性[12]。Q234L 突變發(fā)生在分離病毒HA 受體結(jié)合位點(diǎn)的右側(cè)，該突變能夠?qū)⑹荏w改變?yōu)榻Y(jié)合哺乳動物細(xì)胞的特性[13]。而分離病毒HA 234 位點(diǎn)的L 以及236 位點(diǎn)的G 表明其能夠結(jié)合哺乳動物α-2,6-唾液酸受體[14]。同時，有研究表明HA 198 位點(diǎn)不同的氨基酸殘基會影響病毒與唾液酸受體結(jié)合的親和力，以198V 對人類的親和力最高，198T 次之，198A 最低[15]。因此，該分離病毒對人類受體可能親和力更強(qiáng)。參照Okamatsu 等對HA 抗原位點(diǎn)的研究，分離病毒HA 的抗原位點(diǎn)發(fā)生了共計(jì)10 個突變，可見分離病毒在進(jìn)化過程中發(fā)生了抗原特性的改變[15-18]。糖基化位點(diǎn)分析顯示，分離病毒在218 位缺失糖基化位點(diǎn)，又在145、313 位新增糖基化位點(diǎn)，其特點(diǎn)與人源H9N2參考株A/Environment/Hunan/18355/2014(H9N2)相同。而本研究室前期研究表明HA 蛋白中313/218 位糖基化位點(diǎn)的變化影響了病毒對雞胚和雞的感染力和病毒在組織中的復(fù)制能力，但該糖基化位點(diǎn)的變化對病毒的氣溶膠傳播特性和抗原性沒有影響[19]。而HA 的S145N 突變使得病毒自145 位新增一個糖基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)的變化使得病毒毒力增強(qiáng)，免疫原性發(fā)生改變[19]。分離病毒NA 基因頸部桿狀結(jié)構(gòu)在aa63～aa65 位置缺失，它們在宿主范圍變化中可能存在的作用尚未完全闡明，但這些缺失能夠作為中國流感病毒分支的標(biāo)志[8]。

分離病毒內(nèi)部基因分析結(jié)果顯示，其內(nèi)部基因一些關(guān)鍵位點(diǎn)較2013 年～2015 年的禽源分離病毒并未發(fā)生明顯變化。且分離病毒的8 個基因片段與2 株禽源H9N2 病毒的8 個基因高度同源。推測該分離病毒可能是由禽源H9N2 亞型流感病毒感染豬所致。并且禽源病毒未發(fā)生適應(yīng)性變異就能夠感染豬，更加突出了豬作為不同亞型流感病毒的“混合器”和“孵育器”的潛在威脅，需要加以嚴(yán)密的監(jiān)控。

致病性試驗(yàn)中，分離病毒對雞的致病作用最嚴(yán)重，在豚鼠模型中也能夠感染，但并未在直接接觸組的豚鼠組織中分離到病毒，表明分離病毒尚未獲得在豚鼠間水平傳播的能力，但未來是否會通過在豬宿主中的適應(yīng)性進(jìn)化而獲得在豚鼠中水平傳播的能力仍值得關(guān)注。

綜上所述，本研究于2015 年分離到了一株豬源H9N2 流感病毒，該分離病毒能夠無障礙地感染宿主豬，表明豬是禽、豬流感病毒共同感染的宿主。因此，豬可能在流感病毒基因重組、變異、產(chǎn)生新流行株的過程中起重要作用。因此，需要進(jìn)一步監(jiān)測H9N2 流感病毒，以了解其在不同宿主中的毒力變化和抗原性變化，為H9N2 流感病毒的防控奠定基礎(chǔ)。