賀宇佳 胡睿智 李柏珍 劉磊 伍小松*

（1，湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 4101281；2，湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 410128）

支鏈脂肪酸（Branch-chain fatty acids，BCFA）是在直鏈碳鏈上具有一個或多個支鏈甲基分支的飽和脂肪酸[1]。支鏈甲基處于倒數(shù)第二碳原子的稱為異構(gòu)脂肪酸（iso），處于倒數(shù)第三碳原子的稱為反異構(gòu)脂肪酸（anteiso）；根據(jù)支鏈的數(shù)量分為單支鏈脂肪酸和多支鏈脂肪酸；根據(jù)脂肪酸的直鏈碳原子數(shù)量可分為奇數(shù)支鏈脂肪酸和偶數(shù)支鏈脂肪酸[2]。BCFA 在植物中含量很少，主要存在于反芻動物乳脂和人類初乳中；BCFA 也存在于人類皮膚中，在胎兒發(fā)育晚期BCFA 能占到胎兒皮脂的30%，并能為晚期胎兒發(fā)育提供營養(yǎng)[3]。人體中的BCFA 由支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸）分解合成，反芻動物乳脂中的BCFA 主要由瘤胃細菌利用異丁酸、異戊酸和2-甲基丁酸合成[4]。16-甲基十七烷酸（iso-18:0）是偶數(shù)支鏈脂肪酸常見于人初乳和一些植物，如金魚草和煙草植物的花瓣，是一種常見的支鏈脂肪酸[5]。

BCFA 在胎兒發(fā)育晚期能占胎兒皮脂的30%，分娩后在母乳中含量最高可達到1.5%，且主要存在于新生兒的腸道中，在新生嬰兒的胎糞中也能檢測到BCFA 的存在[3]。這意味著BCFA 在腸道的早期發(fā)育中有重要作用。將仔鼠暴露于缺氧缺血條件下構(gòu)建壞死性小腸結(jié)腸炎，試驗組飼喂含20%的配方奶粉，對照組飼喂不含BCFA 的配方奶粉，相比于對照組BCFA能顯著降低壞死性結(jié)腸炎的發(fā)病率50%以上[6]。BCFA 還能提高初生胎兒腸道中白介素-10（interleukin-10）含量，降低早產(chǎn)嬰兒死亡率[7]。此外，BCFA 還具有抗癌功能。BCFA 在體外試驗中能誘導多種人類癌細胞系（慢性髓原白血病細胞，人乳腺癌細胞，人前列腺癌細胞，人胃癌細胞，人肝癌細胞，人典型小細胞肺癌細胞，人胰腺腺癌細胞，人結(jié)腸癌細胞）的凋亡[8]。

脂肪沉積造成的脂肪變性是引起肝臟病變的重要原因之一，非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）就是典型的由肝細胞脂肪堆積誘導形成的病理癥狀，在我國成年人中的發(fā)病率約為 10%～24%[9]。隨著經(jīng)濟水平提高，NAFLD 的發(fā)病率逐漸提高且呈低齡化趨勢，我國青少年NAFLD 的發(fā)病率顯著高于國外[10]。2 型糖尿病、肥胖、高血脂癥均會引發(fā)NAFLD，主要原因是代謝紊亂造成脂肪在肝臟的過度沉積，引起肝臟損傷，導致肝臟炎癥和氧化應激的產(chǎn)生，肝臟中甘油三脂的升高和總脂肪含量的提高是NAFLD 的直接表現(xiàn)[11]。在之前研究中BCFA 具有降低脂肪沉積的作用，本試驗選取iso-18:0 探究其對正常肝細胞（L02）中脂肪沉積的影響，為iso-18:0 的降脂作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMEMF12 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自 Gibco 公司；棕櫚酸、油酸、甲醛、異丙醇、0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化液、青霉素-鏈霉素溶液、二甲基亞砜（DMSO）、磷酸鹽緩沖液（PBS），油紅O 染色試劑盒購自索萊寶公司；胎牛血清白蛋白（BSA）、iso-18:0 購自 Sigma 公司。

游離脂肪酸（FFA）：取油酸 630μL、軟脂酸 256mg，溶于10ml DMSO 中，漩渦混勻，待完全溶解后為300mM，-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

肝細胞系L02 細胞（購自中南大學湘雅醫(yī)學院）培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM F12 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱環(huán)境為37℃、5%CO2。根據(jù)細胞的生長情況，當細胞密度長至80%左右（7d左右），用1ml 含0.25%胰蛋白酶的EDTA 消化液消化2min，待細胞圓縮后加入0.5mlFBS 終止消化，1000rpm 離心3min。去掉上清液并加入完全培養(yǎng)基吹打混勻，倒置顯微鏡下降計數(shù)，取 1×106個進行傳代培養(yǎng)，每 48h 換一次培養(yǎng)基，取第 4～7 代的L02 細胞用于試驗。

1.2.2 脂肪沉積模型構(gòu)建

取第 4～7 代的 L02 細胞，以 1×106個/孔的密度接種于 6 孔板，每孔加 2ml 完全培養(yǎng)基；每組設(shè) 3 個重復孔，于 37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng) 24h 后，用 PBS 洗滌 2 次，正常組更換新鮮完全培養(yǎng)基，試驗組更換含不同濃度游離脂肪酸的完全培養(yǎng)基，作用24h 后吸走上清液，每孔加入2ml PBS 潤洗。

細胞固定：每孔加入2ml10%中性甲醛于37℃烘箱中孵育10min，之后棄掉上清液，每孔加入2ml 新鮮10%中性甲醛，并于37℃孵育90min，吸走中性甲醛，用2ml 雙蒸水清洗2 次，加入1ml60%的異丙醇于37℃烘箱中孵育5min 后，棄掉上清液，讓細胞在室溫下自然干燥。

油紅O 染色：在固定6 孔板中每孔加入1ml 配好的油紅O染液并于37℃孵育30min，然后吸掉染液，立即用2ml 雙蒸水洗2 次，加入60%異丙醇浸洗5min，棄去60%異丙醇后加入Mayer 蘇木素染色液復染1min，然后吸掉染液，立即用2ml 雙蒸水洗3 次后于電子顯微鏡下觀察細胞內(nèi)脂滴的大小及分布，并進行拍照。

1.2.3 支鏈脂肪酸iso-18：0 降脂作用試驗設(shè)計

根據(jù)1.2.2 試驗結(jié)果，將試驗分為6 組，包括正常組、模型組和不同濃度iso-18:0 試驗組。試驗組中iso-18:0 的濃度設(shè)兩個濃度梯度，分別為0.1mM 和0.25mM。取第4～7 代的 L02細胞，以 1×106 個/孔的密度接種于 6 孔板，每孔加 2ml 完全培養(yǎng)基；每組設(shè)3 個重復孔，于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)24h 后，用 PBS 洗滌 2 次，正常組更換新鮮完全培養(yǎng)基，模型組和試驗組更換含1.2mM FFA 和10%FBS 的完全培養(yǎng)基，作用24h 后吸走上清液，用PBS 洗滌2 次后，正常組和模型組更換含1%BSA 的完全培養(yǎng)基，試驗組更換含不同濃度iso-18:0 和1%BSA 的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24h 后吸取上清，每孔加入2mlPBS 潤洗，然后按照1.2.2 中油紅O 染色方法進行染色。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度FFA對L02細胞脂肪沉積的影響

由圖1可知，隨著游離脂肪酸濃度的增加，L02 細胞內(nèi)的脂滴逐漸增多。與對照組相比，0.6mM FFA 濃度組開始出現(xiàn)明顯脂滴但整體分布較少，0.9mM FFA 濃度組的脂滴數(shù)量明顯增加，1.2mM FFA 濃度組的脂滴最多，視野內(nèi)每個細胞都有明顯脂滴。

2.2 支鏈脂肪酸iso-18：0的降脂作用

圖2為不同處理組肝細胞中脂肪滴的油紅O 染色結(jié)果，對照組中L02 細胞會有少量的脂滴，而用1.2mM FFA 處理過的模型組中的脂滴數(shù)量和顏色明顯多于對照組，說明使用能成功1.2mM FFA 誘導的高脂L02 細胞模型。在使用0.1mM iso-18:0處理L02 細胞后脂滴的分布及數(shù)量與模型組相比并無明顯變化，說明0.1mM iso-18:0 的降脂作用不明顯，而使用0.25mM iso-18:0 處理的L02 細胞的脂滴數(shù)量和顏色深度明顯少于模型組和0.1mM iso-18:0 組，說明0.25mM iso-18:0 的降脂效果強于0.1mM iso-18:0 濃度組。

圖1 不同濃度FFA 對L02 細胞內(nèi)脂滴的影響

圖2 不同濃度iso-18:0 對L02 細胞內(nèi)脂滴的影響

3 討論

隨著肥胖及其相關(guān)代謝綜合征全球化的流行趨勢，NAFLD的發(fā)病率越來越高[11]。試驗模型是用于篩選藥物和研究病理機制的主要方法。NAFLD 的試驗模型主要是動物模型，通常選用小鼠作為試驗動物，使用高脂日糧或CCl4 誘導脂肪肝模型[12]。CCl4進入體內(nèi)后會引起肝臟損傷，引起肝細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化，引起肝細胞脂肪變性[13]。采用CCl4誘導的脂肪肝模型速度快但機制和肝臟病變過程與實際人類脂肪肝的形成差異過大。而采用高脂日糧構(gòu)建小鼠脂肪肝模型雖然其致病機制與實際顯示但需要8～12 周時間，成本過高[12]。且動物模型對于早期藥物篩選成本過高，本試驗選擇構(gòu)建高脂L02 細胞模型。L02 細胞是人正常肝細胞系，相對于其他細胞系如肝癌細胞系HepG2，本試驗選取的L02 細胞更符合實際。有研究使用DL-乙硫氨酸誘導非酒精性脂肪肝細胞模型。DL-乙硫氨酸會引起肝細胞的甘油三脂蓄積，但同時還會導致肝細胞損傷[14]。本試驗選取油酸和棕櫚酸按2：1 比例混合模擬人體發(fā)生代謝紊亂后血液中游離脂肪酸增多，通過不同濃度篩選發(fā)現(xiàn)，1.2mM FFA 濃度能使L02 細胞中脂滴含量及數(shù)量明顯多于對照組。使用2:1 的油酸和棕櫚酸混合物誘導，培養(yǎng)24h，也建立L02 肝脂肪變性細胞模型[15]。

肝臟是脂質(zhì)代謝的主要場所，當脂質(zhì)攝入超過肝臟的運轉(zhuǎn)速度，或發(fā)生代謝會導致甘油三酯累積[11]。油紅O 是很強的脂溶劑和染脂劑，較易與甘油三脂結(jié)合呈小脂滴狀，通過溶劑與脂滴結(jié)合染色，因此，油紅O 染色技術(shù)通常評估肝臟脂肪沉積[16]。本試驗通過構(gòu)建高脂L02 模型使用油紅O 染色判定脂滴數(shù)量及分布，操作簡單，結(jié)果明顯。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，支鏈脂肪酸能提高腸道抑炎因子含量，降低新生兒的死亡率，且還具有誘導癌細胞凋亡作用[6-8]。BCFA 對PPAR-α 具有調(diào)控作用[17]。PPAR-α 是脂肪酸代謝的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，所以本試驗推測BCFA 具有降脂作用。iso-18:0 作為一種常見的支鏈脂肪酸，主要存在于母乳和一些植物如金魚草和煙草植物的花瓣中[5]。本文選取iso-18:0，探究其對游離脂肪酸誘導的高脂L02 肝細胞模型的降脂作用。通過油紅O 染色發(fā)現(xiàn)，0.1mM 組和0.25mM 組均能減輕L02 細胞中脂滴含量及數(shù)量，且0.25mM組效果更佳明顯，說明iso-18 具有體外降脂作用。

4 結(jié)論

綜上所述，1.2mM FFA 成功建立了肝細胞脂肪沉積模型，而支鏈脂肪酸iso-18:0 具有明顯的抑制肝細胞脂肪沉積的作用，且這種抑制作用呈劑量依賴性，由此可見，支鏈脂肪酸iso-18:0可潛在改善脂肪代謝，并減少肝細胞脂肪積累，因而在改善肝功能和預防肝臟疾病等方面具有很好的應用前景。