王 瑩 張 婷 黃璐璐

(1北京市東城區(qū)疾病預(yù)防控制中心,北京 100050;2北京市衛(wèi)生健康委員會,北京 100053;3 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

葡萄籽原花青素(grape seed procyanidins,GSP)是從葡萄籽中提取的生物類黃酮物質(zhì),具有抗氧化等生物活性,且GSP 作為一種純天然的提取物[1],具有防治心血管等疾病的功效[2-3]。研究表明,GSP 還具有減輕水腫、降低毛細血管通透性、保護肝臟、加強放射防護的功效[4]。原花青素可以用于治療外周靜脈功能不全和眼科疾病,并可與其他藥物協(xié)同治療淋巴水腫等疾病,是具有廣闊發(fā)展前景的新藥[5]。正是由于原花青素具有以上諸多確切的藥理學(xué)活性,且GSP 提取簡單、原料豐富、毒副作用低,因此, GSP 的減肥降脂研究對葡萄籽保健食品的開發(fā)具有重要意義。

肥胖除了表現(xiàn)在機體體重、脂肪含量等升高外,其還伴隨腸粘膜屏障的紊亂,導(dǎo)致細菌和毒素移位,誘發(fā)產(chǎn)生炎癥因子[6-8]。流行病學(xué)研究又發(fā)現(xiàn),黃酮類物質(zhì)對肥胖有一定的預(yù)防作用[9],具有一定的減肥降脂作用[10],故它與肥胖和腸粘膜屏障之間存在關(guān)聯(lián)性,推測其是以腸粘膜屏障為作用靶點發(fā)揮減肥降脂的生理活性功能物質(zhì)。其中,黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性和代謝產(chǎn)物的多樣性決定了其對腸粘膜屏障影響的多樣性和復(fù)雜性,所以截至目前黃酮類物質(zhì)對腸粘膜屏障的作用機理尚不十分清楚。基于此,本研究以GSP 為原料,高脂膳食誘導(dǎo)大鼠模型為試驗對象,通過給藥不同劑量的GSP,研究大鼠Lee’s 指數(shù)、腸道壁通透性、緊密連接蛋白Occludin 和ZO-1 表達量,考察其對肥胖大鼠腸粘膜屏障的影響,以期為開發(fā)安全有效的保健食品或新藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平均始重100 g 左右的斷乳SPF 級Wistar 雄性大鼠90 只,購自北京華阜康生物科技股份有限公司;SPF 級大鼠高脂飼料和普通飼料,購自北京華阜康生物科技股份有限公司;動物飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院第一附屬304 醫(yī)院動物實驗中心,動物房溫度25℃左右,濕度約30%,光照10 ～12 h·d-1,5 只1 籠。所有大鼠造模期間每日換水1 次,自由采食,造模時間56 d。

葡萄籽原花青素(≥95%),購自天津尖峰天然產(chǎn)物公司;乳果糖(色譜純)、甘露糖(色譜純),購自美國Sigma 公司; 一抗Occludin 山羊多克隆抗體、一抗ZO-1 山羊多克隆抗體、二抗驢抗山羊抗體、牛血清蛋白,購自美國Santa Cryz 公司;D-乳酸試劑盒,購自美國RB 公司;硫柳汞(分析純),購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

W2695 高效液相色譜儀、W2414 示差檢測器,美國Waters 公司;TB-214 分析天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;MULTISKAN MK3 全自動多功能酶標儀,Thermo(USA)公司;DH4000A 電熱恒溫培養(yǎng)箱,天津泰斯特公司;UV-2000 型紫外可見分光光度計,日本島津公司;MH-1 漩渦振蕩器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;CR22G Ⅱ高速冷凍離心機,日本Hitachi 公司;ALC-1100.2 電子天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;Ti 倒置顯微鏡,尼康映像儀器銷售(中國)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物模型的建造 將90 只SPF 級Wistar 雄性大鼠隨機分成2 個組,組一為模型組(80 只),組二為正常組(10 只),分別給予高脂飼料和基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。造模期間大鼠自由采食、飲水。以超過正常大鼠體重20%認為造模成功[11],第8 周造模成功39 只,成功率為48.75%,達到灌胃組別要求。

1.3.2 灌胃試驗 取造模成功的大鼠隨機分成模型組和低、中、高劑量組,正常組為健康的未經(jīng)造模處理的Wistar 雄性大鼠,每組8 只。每天上午9 點,低、中、高劑量組按75、162.5、250 mg·kg-1·BW·d-1的GSP 劑量(蒸餾水為溶劑)給大鼠灌胃,模型組和正常組灌胃等體積的蒸餾水,灌胃共計6 周。試驗期間大鼠單獨喂養(yǎng),每周固定時間測定大鼠體重、體長,根據(jù)大鼠體重調(diào)整GSP 灌胃劑量,并計算Lee’s 指數(shù)[10]。在灌胃期間的第3 和第6 周固定時間,同時灌胃乳果糖和甘露醇混合液(大鼠每千克體重灌胃劑量為乳果糖100 mg/甘露醇50 mg),禁食8 h 后取尿液,加入2%的硫柳汞防腐,-80℃保存?zhèn)錅y。

1.3.3 大鼠生理生化指標的測定

1.3.3.1 D-乳酸含量的測定 灌胃結(jié)束后,大鼠禁食12 h 處死,立即于大鼠股動脈取血并分離出血清,采用ELISA 試劑盒檢測大鼠的D-乳酸含量。

1.3.3.2 乳果糖/甘露醇排出率的測定 取大鼠尿液0.4 mL,4℃條件下12 000 r·min-1離心30 min 后進行高效液相色譜檢測。色譜條件：柱型為氨基色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);流動相：乙腈∶水為72 ∶28(v/v);流速1 mL·min-1;柱溫30℃;檢測器為示差折光檢測器;內(nèi)加熱溫度37℃、靈敏度32、時間常數(shù)1.0、尺度因子20;進樣量10 μL。根據(jù)標準曲線計算樣品中甘露醇和乳果糖的濃度,再根據(jù)兩者的灌胃劑量計算出大鼠體內(nèi)乳果糖(lactulose,L)和甘露醇(mannitol,M)的排出率比值。

1.3.3.3 大鼠腸道壁形態(tài)學(xué)觀察 處死后立即解剖取10 cm 左右大鼠回腸制作石蠟切片,然后將石蠟切片進行HE 染色。采用ToupView 顯微鏡圖像采集處理系統(tǒng)采取圖像后,每張切片在40 倍光鏡下選取5 個全視野,記錄每個視野下的杯狀細胞數(shù),并于10 倍光鏡下測量5 根最長絨毛及相應(yīng)的隱窩深度、絨毛寬度。

1.3.3.4 緊密連接蛋白Occludin 和ZO-1 測定 將大鼠回腸石蠟切片進行常規(guī)脫蠟水化,再用蛋白酶K于37℃條件下消化10 min,經(jīng)磷酸緩沖液(phosphate buffersolution,PBS) 沖洗后用1%牛血清蛋白封閉20 min,一抗4℃孵育過夜,再次用PBS 沖洗,然后用二抗37℃孵育30 min,經(jīng)PBS 沖洗后置于熒光顯微鏡40 倍目鏡下觀察。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用DPS v7.05 進行Duncan 氏多重比較,以P＜0.05 為差異顯著性標準,P＜0.01 為差異極顯著性標準,結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSP 對大鼠Lee’s 指數(shù)的影響

由表1 可知,灌胃階段,各劑量組大鼠體重和Lee’s 指數(shù)的增長均低于模型組,表明GSP 具有明顯的降脂減肥的功效。灌胃結(jié)束后,高劑量組大鼠體重極顯著低于模型組,中、低劑量組大鼠體重與模型組相比差異不顯著,說明高劑量GSP 具有更好的減重效果。

2.2 GSP 對大鼠血清中D-乳酸含量的影響

D-乳酸是細菌的代謝產(chǎn)物,腸道多種細菌均可產(chǎn)生[12]。血清D-乳酸水平可反映腸道通透性變化[13]。各劑量組大鼠血清中D-乳酸含量均極顯著低于模型組(P＜0.01),且與正常組無顯著差異,低、中、高劑量組間無顯著性差異,說明GSP 具有降低大鼠腸道壁通透性的功能但并未確定最佳劑量(圖1)。

2.3 GSP 對大鼠尿液中乳果糖/甘露醇排出率的影響

由圖2 可知,乳果糖標準品、甘露醇標準品保留時間分別為22.617、19.058 min,且檢測大鼠尿液中含有乳果糖和甘露醇,其線性回歸方程分別為： Y乳=917 317.7+1.338 9×106X,R2=0.992;Y甘=172 690.7+1.134 19×106X,R2=0.991 8。

表1 GSP 對大鼠體重和Lee’s 指數(shù)的影響Table 1 Effects of GSP on body weight and Lee’s index of rats

圖1 GSP 對大鼠血清D-乳酸含量的影響Fig.1 Effect of GSP on serum D-lactic acid content of rats

利用不被代謝的大分子糖類測定腸粘膜通透性是評估腸粘膜屏障功能的有效方法之一,常用的兩種不同分子質(zhì)量的非代謝性糖為乳果糖(L)和甘露醇(M)[14]。當(dāng)腸粘膜屏障受損通透性增高后,L/M 排出率比值增大[15]。由表2 可知,在灌胃第3 和第6 周,與正常組和各劑量組相比,模型組大鼠尿液中L/M 值極顯著性升高(P＜0.01),表明灌胃GSP 可降低大鼠尿液中的L/M 值,即修復(fù)了大鼠的腸粘膜。

圖2 乳果糖、甘露醇的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of lactulose standard,mannitol standard and sample

表2 GSP 對大鼠L/M 排出率的影響Table 2 Effect of GSP on L/M ratio of rats

2.4 大鼠腸粘膜形態(tài)學(xué)分析

腸粘膜絨毛是吸收營養(yǎng)的主要部位,隱窩增生表明細胞增值率增加,細胞成熟度下降,絨毛高度/隱窩深度比值反映了腸粘膜的屏障功能[16-18]。由表3、圖3 可知,與正常組相比,模型組大鼠的腸粘膜絨毛受損較為嚴重,其杯狀細胞數(shù)極顯著降低,且絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度也顯著降低;與模型組相比,各劑量組中大鼠的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度得到顯著提高,表明GSP 可以改善因肥胖造成的絨毛高度降低,隱窩深度增加,杯狀細胞數(shù)減少等癥狀,起到修復(fù)腸粘膜屏障的作用。其中,高劑量GSP 對大鼠杯狀細胞修復(fù)效果最佳,低、中劑量GSP 更適用于大鼠絨毛高度的修復(fù)。

表3 GSP 對大鼠腸粘膜的影響Table 3 Effect of GSP on intestinal mucosa of rats

圖3 GSP 對大鼠回腸粘膜形態(tài)的影響(×40)Fig.3 Effects of GSP on ileum mucosal morphology of rats (×40)

2.5 GSP 對大鼠緊密連接蛋白Occludin 和ZO-1 表達量的影響

緊密連接是決定腸道壁通透性高低的主要因素之一[19]。大鼠緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)見圖4。每張免疫熒光染色后的切片選取5 個全視野,記錄并用Image-Pro Plus 分析平均光密度[20]。比較不同組別的蛋白表達量(圖5)發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組大鼠的緊密連接蛋白Occludin 和ZO-1 的表達量顯著下降,而與模型組相比,各劑量組則顯著提高,表明GSP 可以提高肥胖大鼠的緊密蛋白表達量,且改善效果與蛋白種類和GSP 給藥劑量具有相關(guān)性。其中,高劑量組改善效果最佳。

圖4 大鼠回腸粘膜中的緊密連接蛋白的熒光影像(×40)Fig.4 Fluorescence image of tight junction protein of ileum mucosal (×40)

3 討論

隨著生活水平的不斷提高,肥胖已逐漸成為影響身體健康的重要因素[21]。腸道除了具有消化吸收功能外,還可以將毒素和細菌等有害物質(zhì)封閉在腸腔內(nèi),以保持機體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定[22-23]。如肥胖易誘發(fā)腸粘膜屏障的紊亂[24],最終導(dǎo)致毒素進入血液激發(fā)全身的炎癥反應(yīng)[25-26]。本研究通過高脂飲食誘導(dǎo)建立大鼠肥胖模型并采用GSP 干預(yù),發(fā)現(xiàn)GSP 能減緩大鼠肥胖增長速度,緩解肥胖Lee’s 指數(shù)水平。高脂飲食可引起大鼠腸粘膜損傷,增加其腸道壁通透性。本試驗結(jié)果表明,GSP 可以顯著降低血清中D-乳酸含量和L/M 排出率(P＜0.01),對腸粘膜具有修復(fù)和保護作用,但作用效果與給藥劑量關(guān)系有待進一步探究;在L/M 排出率的測定中,各劑量組與模型組在第3 和第6 周的試驗結(jié)果均有顯著性差異,但未探究出GSP 對腸粘膜修復(fù)的功能性與給藥劑量、給藥時間的關(guān)系,仍有待進一步研究。

圖5 GSP 對大鼠緊密連接蛋白Occludin和ZO-1 表達量的影響Fig.5 Effect of GSP on the expression of tight junction protein Occludin and ZO-1 in rats

腸粘膜形態(tài)結(jié)構(gòu)可以直觀體現(xiàn)腸粘膜的完整性,其中隱窩深度可以反映腸粘膜細胞的成熟率,絨毛高度與隱窩深度的比值可以反映出腸粘膜的屏障功能[27-28]。杯狀細胞分泌的黏液層對腸粘膜具有重要的保護作用,緊密連接蛋白對選擇透過性有著決定性作用[29-30]。本研究中,肥胖可造成腸道絨毛形態(tài)受損,且可引發(fā)杯狀細胞和緊密連接蛋白被破壞。與模型組比較,GSP 劑量組干預(yù)顯著改善了絨毛高度、Occludin 及ZO-1 的表達量(P＜0.05),且GSP 高劑量組的杯狀細胞數(shù)顯著提高(P＜0.05),隱窩深度和絨毛寬度變化不顯著,說明GSP 對腸道粘膜損傷的修復(fù)主要對粘膜絨毛高度、杯狀細胞、以及緊密連接蛋白的表達進行干預(yù),且修復(fù)效果與給藥劑量和靶點有關(guān)。

健康情況下,腸粘膜可以阻止腸腔內(nèi)細菌和內(nèi)毒素等致病性抗原的入侵,以維持機體的生命活動。本研究結(jié)果表明,GSP 能緩解肥胖應(yīng)激對大鼠腸道黏膜形態(tài)上的損傷,具有促進腸上皮細胞的增殖、分化和遷移作用,且對腸道炎性損傷可能具有一定的拮抗作用,此外,GSP 具有減肥降脂的生理功效。故本研究證實GSP 是以保護腸粘膜屏障為靶點,減少炎癥因子的移位,從而達到抑脂減肥的效果,但由于動物樣本數(shù)量偏少,GSP 給藥劑量范圍設(shè)計過窄,本探究尚未建立腸粘膜屏障修復(fù)水平與GSP 給藥劑量之間的線性關(guān)系。建議在今后的研究中適當(dāng)增加試驗樣本數(shù)或進行體外試驗研究,并擴大給藥劑量范圍。

4 結(jié)論

高脂飼料誘導(dǎo)的大鼠肥胖應(yīng)激,使大鼠腸道壁通透性增加,腸上皮細胞緊密連接蛋白表達量下降,造成腸粘膜屏障功能受損。灌胃GSP 可以抑制大鼠腸道壁通透性的增加,提高緊密連接蛋白的表達水平,以緩解肥胖引發(fā)的腸粘膜損傷。本研究初步建立了大鼠腸粘膜結(jié)構(gòu)和GSP 之間的相關(guān)性,為進一步確定GSP 的最佳灌胃劑量奠定了基礎(chǔ)。