曹英杰 楊劍飛 王 宇

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

作物的馴化及育種過程對作物的遺傳多樣性具有重要的影響,了解作物表型變異的遺傳基礎(chǔ)能夠幫助人們有效地利用現(xiàn)有的遺傳多樣性資源提高育種效率以及促進(jìn)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的改良[1]。但重要的農(nóng)藝性狀如作物產(chǎn)量、作物品質(zhì)以及植物抗病性、抗逆性是由多個基因共同控制決定的連續(xù)性狀,其表型變異受多種環(huán)境條件和內(nèi)源遺傳物質(zhì)的影響,與單基因控制的性狀相比,其遺傳基礎(chǔ)更復(fù)雜。

大量研究表明,分子標(biāo)記是研究作物重要農(nóng)藝性狀,挖掘相關(guān)基因的重要手段之一,如Michelmore等[2]基于孟德爾遺傳定律提出了群體分離分析法(bulked segregant analysis,BSA),并表明此方法可明顯提高性狀關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的開發(fā)效率,加快作物基因組學(xué)的研究進(jìn)程;Zheng 等[3]提出了一整套應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇育種(maker-assisted selection,MAS)的程序,主要通過限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat,SSR)、序列特異性擴(kuò)增區(qū)(sequence characterized amplified region,SCAR)、序列標(biāo)志位點(sequence tagged sites,STS)等分子標(biāo)記,進(jìn)行作物的遺傳輔助育種。此外,隨著第二代測序技術(shù)(next general sequencing,NGS)的迅猛發(fā)展,進(jìn)一步為數(shù)量性狀研究以及基因功能挖掘提供了更有利的技術(shù)支撐,其中以序列為基礎(chǔ)的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(single nucleotide polymorphism,SNP)直接用于分子育種的遺傳連鎖圖構(gòu)建,極大地提高了遺傳圖譜的分辨率及精確度[4-5]。有研究者利用高密度的遺傳圖譜和適用于特定性狀的分離群體在多個作物中定位出控制作物產(chǎn)量、品質(zhì)、生物和非生物抗性等重要農(nóng)藝性狀的基因和主效數(shù)量性狀位點(quantitative. trait loci,QIL)[5-8]。但由于進(jìn)行QTL 研究的分離群體涉及的材料種類有限,導(dǎo)致針對某性狀的研究主要集中在親本間存在多樣性等位基因的位點,且構(gòu)建群體時親本間有限的雜交和自交次數(shù),導(dǎo)致遺傳圖譜的分辨率較低,僅利用親本配子的重組信息定位的QTL 區(qū)間較大[9-10]。全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)是應(yīng)用基因組中數(shù)以百萬計的SNP 為分子遺傳標(biāo)記,進(jìn)行全基因組水平上的對照分析或相關(guān)性分析,并通過比較發(fā)現(xiàn)影響復(fù)雜性狀的基因變異的新技術(shù)。其可作為研究目的性狀的基礎(chǔ)試驗,為性狀分析提供遺傳結(jié)構(gòu),篩選出用于QTL 分析的最佳親本組合,找到候選的目的位點,因此,GWAS 通常與QTL 相互作補(bǔ)充,以降低分析誤差。目前利用GWAS已經(jīng)鑒定出大量與疾病性狀相關(guān)的遺傳位點[11-12];與人基因組的GWAS 研究不同,作物的許多性狀能夠通過控制雜交個體進(jìn)行可重復(fù)的定向變異,并利用產(chǎn)生的特異作圖群體對特異性狀或QTL 進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。本文綜述了目前GWAS 在糧食作物研究中取得的最新進(jìn)展,以期為利用GWAS 發(fā)掘作物復(fù)雜數(shù)量性狀基因,揭示重要農(nóng)藝性狀形成的分子基礎(chǔ),為糧食作物的品種改良提供依據(jù)。

1 GWAS 的研究策略及影響因素

目前GWAS 設(shè)計類型主要采用兩階段或多階段方法,其操作過程為首先選擇高通量的SNP 芯片或利用高通量測序手段獲得待測樣品的SNPs、SSRs 等分子標(biāo)記信息,在群體結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,篩選出顯著的SNP 位點;然后利用特定作圖群體進(jìn)行大樣本的基因分型,最后結(jié)合多組學(xué)分析確定候選基因[13-14](圖1)。

圖1 定位不同品種水稻籽粒大小候選基因典型的GWAS 研究流程示意圖Fig.1 Schematic of an exemplary GWAS workflow to map causal genes for natural variation of rice grain size

1.1 群體結(jié)構(gòu)劃分對GWAS 的影響

前人用于GWAS 研究的植株材料來自世界各地,包括栽培和野生在內(nèi)的多個品種。這些品種經(jīng)過長時間的環(huán)境選擇效應(yīng)、遺傳漂變、遷移及人工馴化效應(yīng),基因組中可能會產(chǎn)生不同的遺傳模式,形成多個具有遺傳差異的亞群。這些亞群間的基因交流頻率較低,導(dǎo)致群體間等位基因頻率不同,混合分析時會增加染色體間的連鎖不平衡性,導(dǎo)致關(guān)聯(lián)分析產(chǎn)生大量的假陽性[15]。若不考慮群體結(jié)構(gòu)對特征性狀的影響,由GWAS 分析獲得的多態(tài)性可能是由群體結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的無功能多態(tài)性位點或僅在亞群內(nèi)有功能的位點[16]。因此,關(guān)聯(lián)分析時必須對群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和校正,如有研究者提出利用貝葉斯聚類分析方法,對獲得各個體中的基因型信息進(jìn)行聚類,根據(jù)聚類結(jié)果劃分群體結(jié)構(gòu),在亞群內(nèi)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析[16]。目前,控制群體結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計學(xué)方法主要有基因組對照法(genomic control)、結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)法(structured association,SA)、主成分分析法(principal components analysis,PCA)、非計量多維標(biāo)度法(non-metric multidimensional scaling,NMDS)、基于群體結(jié)構(gòu)(Q)+親緣關(guān)系(K)的混合模型法(unified mixed-model approach,Q+K model)等[16-19],且通常采用STRUCTURE、INSTRUCTURE 等軟件進(jìn)行分析。如為了校正群體間親緣關(guān)系的影響,Yu 等[19]將混合線性模型引入GWAS 研究,有效地控制了群體結(jié)構(gòu)的影響,提高了分析效率和準(zhǔn)確性。

1.2 連鎖不平衡對GWAS 的影響

連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)是指群體內(nèi)不同位點上等位基因間的非隨機(jī)關(guān)聯(lián)。在隨機(jī)交配的群體中,連鎖不平衡性參數(shù)會隨著傳代次數(shù)升高而顯著降低,直到最終變成平衡狀態(tài);其中,LD 值較低的染色體區(qū)段,可以獲得更多與靶基因(QTL 位點)有效關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記,提高關(guān)聯(lián)分析的精確性[15]。受遺傳背景、雜交類型、群體融合等因素的影響,不同物種間的基因組中LD 具有顯著差異,如擬南芥、水稻、高粱、大豆等自交品種,其基因組純合度高,產(chǎn)生有效重組的頻率較低,導(dǎo)致LD 值偏高;而甘藍(lán)、油菜、玉米等雜交品種,染色體內(nèi)有效變異較多,其LD 值隨著重組事件增加迅速降低[20]。LD 值具有群體依賴性,即同一物種不同群體間的LD 值也可能具有差異性。馴化品種在形成過程中經(jīng)過人工選擇,導(dǎo)致特定性狀被保留,與野生品種相比遺傳多樣性較低,LD 值較高,如玉米骨干自交系的LD 值為100 kb,地方品種間的LD 值為1～5 kb,而野生型玉米小于1 kb[21-23]。因此,構(gòu)建關(guān)聯(lián)群體時,選擇地理差異大的品種作為關(guān)聯(lián)分析材料,能夠有效降低基因組上的連鎖不平衡性,獲得較多的表型變異和遺傳變異,但也可能會增加群體結(jié)構(gòu)分析的難度[24]。

1.3 群體大小對GWAS 的影響

足夠的群體數(shù)量能夠提高關(guān)聯(lián)分析的效力進(jìn)而檢測到低頻度的遺傳變異,這種關(guān)聯(lián)分析受到樣品量、遺傳效應(yīng)量和等位基因頻率的影響,其中樣品量是決定統(tǒng)計分析效力的主要控制因子。大部分農(nóng)藝性狀是由大量的微效位點調(diào)控的,因此增加群體數(shù)量能夠提高關(guān)聯(lián)分析的效率,有利于鑒定出微效的基因位點,如Long 等[25]研究表明,與增加檢測的SNP 數(shù)量相比,增加群體數(shù)量更能提高關(guān)聯(lián)分析的作圖能力;Seng 等[26]研究認(rèn)為樣本量較大時,應(yīng)當(dāng)考慮SNP 在兩階段設(shè)計中的重復(fù)性以控制假陽性率;美國康奈爾大學(xué)的Buckler 實驗室利用25 份具有廣泛遺傳變異的自交系分別雜交、自交,獲得了5 000 個重組自交系材料,該群體集合了連鎖和關(guān)聯(lián)群體的優(yōu)勢,在解析開花期、抗病性、植物形態(tài)等復(fù)雜的數(shù)量性狀中具有重要作用[4,27-28]。在構(gòu)建RIL 群體時,多親本的種間雜交能顯著提高遺傳圖譜的分辨率,同時多個親本會引入更多的遺傳多樣性,有利于同時對多個相關(guān)性狀進(jìn)行研究。目前,已在多種作物中成功構(gòu)建出優(yōu)良種質(zhì)的作圖大群體,這些群體由多種表型變異的親本通過人工雜交育種的方式構(gòu)建,如水稻的RIL 群體、玉米的巢式關(guān)聯(lián)群體(nested association mapping,NAM)、小麥的多親本高級世代互交系(multi-parent advanced generation inter-cross,MAGIC)、大麥HEB-25 巢式關(guān)聯(lián)群體等,促進(jìn)了多種重要農(nóng)藝性狀基因的挖掘[29-31]。

2 GWAS 在糧食作物育種中的應(yīng)用

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,一些主要作物如水稻[32]、大麥[33]、谷子[34]、玉米、高粱[35]、土豆[36]、西紅柿[37]、白菜[38]等參考基因組均已公布。這些物種中基因組范圍的變異數(shù)據(jù)被用于遺傳作圖和作物演化的研究,為作物品種改良和培育奠定了重要的理論基礎(chǔ)(表1)。

2.1 水稻

水稻(Oryza sativa L.)分布范圍廣,是目前自然群體數(shù)量最多的糧食作物,各栽培地區(qū)生長的優(yōu)良水稻品種包含了豐富的遺傳變異信息,是研究重要農(nóng)藝性狀基因的首選材料。通過對水稻代謝組的GWAS 研究,能夠從代謝水平上找到影響表型變異的特征代謝物。結(jié)合基因組水平上與表型變異連鎖的SNP 位點,能為復(fù)雜農(nóng)藝性狀中微效QTL 的定位和基因的挖掘提供一定的理論依據(jù)[39]。如Huang 等[40-41]首次將大樣本、低豐度的基因組測序數(shù)據(jù)利用缺失數(shù)據(jù)修復(fù)算法與基因分型手段相結(jié)合,構(gòu)建了水稻高密度基因組單體型圖譜,且進(jìn)一步對包括谷粒寬度、千粒重、分蘗數(shù)目、淀粉含量及抽穗期等14 個農(nóng)藝性狀進(jìn)行GWAS分析,鑒定出多個控制花期和糧食產(chǎn)量性狀相關(guān)的新位點。Yonemaru 等[42]在14 個高產(chǎn)水稻品種的GWAS分析中篩選到1 152 個與高產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)的SNP,并發(fā)現(xiàn)8 個與產(chǎn)量性狀相關(guān)的基因滲入?yún)^(qū)域,證明控制產(chǎn)量性狀基因的遺傳結(jié)構(gòu)在人工馴化過程中發(fā)生了變化。Duan 等[43]利用102 份種子大小具有顯著差異的秈稻品種進(jìn)行GWAS 分析,發(fā)現(xiàn)LOC_Os05g09520(GSE5)的表達(dá)水平與種子大小顯著相關(guān),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)GSE5 的啟動子區(qū)950 bp 的刪除會顯著降低GSE5 的表達(dá)從而導(dǎo)致種子變寬。趙宏亮等[44]利用6 704 個SNP 標(biāo)記對261 份秈稻核心種質(zhì)資源的千粒重、單株產(chǎn)量等9 個源庫相關(guān)性狀進(jìn)行GWAS 分析,共檢測到68 個與產(chǎn)量性狀關(guān)聯(lián)的QTL,其中以QTgw5b 的貢獻(xiàn)率最大,為6.91%。Volante 等[45]對缺水和多水條件下的粳稻品種進(jìn)行GWAS 分析鑒定,得到3 個與產(chǎn)量相關(guān)的位點,其中,Os05g0187500 和Os04g0615000 分別編碼與谷粒重量相關(guān)的GW5 和Nal1 基因,Os04g0663600 編碼與腋芽形成相關(guān)的WOX1 基因,通過調(diào)控水稻的分蘗數(shù)進(jìn)而影響水稻產(chǎn)量。表明在缺水條件下,水稻會產(chǎn)生更多的分支和更小的谷粒以抵御干旱。在作物研究過程中,某些性狀(如干旱抗性)受多個微效基因調(diào)控,利用GWAS 進(jìn)行候選基因的定位非常困難,研究者往往利用與抗性相關(guān)的衍生表型或特征代謝產(chǎn)物相結(jié)合的手段進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析并成功定位到多個參與調(diào)控脅迫響應(yīng)的目的基因[46-48]。在水稻中,利用代謝組GWAS 與基因組GWAS 結(jié)合分析的方法,有助于推動復(fù)雜性狀的研究,如Matsuda 等[49]利用代謝組數(shù)據(jù)對175 份水稻品種進(jìn)行GWAS 分析,從143 個SNP 和89 個代謝物中成功鑒定出323 個關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)。Chen 等[50]利用529 份水稻對84 個代謝物進(jìn)行綜合分析,鑒定出上百個能夠影響次級代謝產(chǎn)物含量的變異位點,發(fā)掘出36 個調(diào)控代謝物水平的候選基因,注釋了5 個與代謝性狀相關(guān)的候選基因。Chen 等[51]利用基因組、代謝組和表型組關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合的方法,鑒定出多個在水稻籽粒中顯著關(guān)聯(lián)的特征代謝物和SNP 位點,包括調(diào)控水稻籽粒顏色、大小相關(guān)性狀的特征代謝物,獲得17 個候選基因。

2.2 玉米

作為短日照開花作物,玉米(Zea mays L.)的種植范圍已經(jīng)擴(kuò)散到溫帶的長日照地區(qū)。玉米的早花性狀是其馴化過程中產(chǎn)生的主要適應(yīng)性性狀。近年來,隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和玉米參考基因組信息的完善,GWAS 極大地推進(jìn)了玉米功能基因組學(xué)的遺傳研究,獲得了一系列與產(chǎn)量、發(fā)育、抗性相關(guān)的候選基因或候選位點。如Li 等[52]運(yùn)用玉米巢式關(guān)聯(lián)群體同時對玉米的早花性狀進(jìn)行GWAS 分析,在距離關(guān)聯(lián)SNPs 1 Mb 范圍內(nèi)獲得220 個候選基因,其中66%與擬南芥中的開花基因同源,這些SNPs 位點集中分布在候選基因內(nèi)部和距離候選基因5 kb 附近的區(qū)域,能夠顯著影響玉米的早花性狀。Yang 等[53]研究表明,ZmCCT基因是感知光周期的重要因子,其表達(dá)水平能夠顯著影響玉米的開花時間;在早花品種中,其5′UTR 區(qū)域的CACTA 型轉(zhuǎn)座元件插入導(dǎo)致啟動子區(qū)甲基化水平升高;ZmCCT 基因的表達(dá)水平降低能抑制玉米對光周期的敏感性,促進(jìn)早花表型的發(fā)生,使早花品種能適應(yīng)高緯度地區(qū)的長日照環(huán)境。復(fù)雜的數(shù)量性狀通常受多個基因或QTL 位點控制,獲得的QTLs 數(shù)目越多說明大部分位點對表型變異的貢獻(xiàn)率越低,如Buckler等[54]和Tian 等[55]利用GWAS 獲得超過40 個與開花時間和葉子形態(tài)相關(guān)的QTL 位點,但90%的位點僅能夠解釋低于2.5%的表型變異;此外,單個QTL 位點也可能參與影響多個數(shù)量性狀的形成。如Li 等[52]以US-NAM 群體對玉米的開花期、抽絲期、雌雄穗間隔期等相關(guān)性狀進(jìn)行GWAS 分析,對獲得的71 個QTLs 進(jìn)行分類發(fā)現(xiàn),其中57.7%的QTLs 位點與2 種以上性狀顯著相關(guān),能夠同時影響3 種性狀的QTLs 位點占總QTLs 數(shù)目的28.2%;Thomsberry 等[56]通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)Dwarf8 基因在不同品種中存在多態(tài)性,這些多態(tài)性不僅影響玉米株高,還與玉米開花期變異顯著相關(guān),其中Dwarf8 基因中702 位點的缺失與1 664 位點的T基因型緊密連鎖,是顯著影響玉米早花性狀的功能性位點。Yang 等[57]利用513 個近交系材料,鑒定出678個與株高、籽粒形態(tài)、開花時間等17 種農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的SNP 位點,其中54.3%(368 個)的SNPs 至少與2種以上性狀關(guān)聯(lián)。用于GWAS 研究的大群體由于存在復(fù)雜的群體結(jié)構(gòu),導(dǎo)致關(guān)聯(lián)分析得到的QTLs 位點范圍區(qū)間較大,不利于候選基因的鑒定和挖掘。研究者通常還會構(gòu)建雙親本群體共同進(jìn)行QTLs 定位,縮短候選基因范圍,以對GWAS 獲得的QTLs 進(jìn)行精細(xì)定位。如Zhao 等[58]首先利用43 437 個SNP 對269份玉米的葉片中鎘(Cd)含量進(jìn)行GWAS 分析,鑒定出SNP(SYN25051)解釋了27.1%的表型變異,進(jìn)一步通過對雙親本群體的QTL 定位,驗證了由GWAS 鑒定的主效QTL 基因座qLCd2,可解釋39.8%的鎘在葉片中積累的表型。Ju 等[59]通過GWAS 和RIL 群體中的QTL 作圖相結(jié)合的方法研究玉米對鐮刀菌(Fusarium verticillioides)孢子的抵抗力,鑒定出與FSR 抗性相關(guān)的8 個數(shù)量性狀基因座(QTLs),其中3 個候選基因GRMZM2G0081223、AC213 654.3 _ FG004 和GRMZM2G099255,在連鎖作圖和GWAS 中均能被檢測到。然 而 進(jìn) 一 步 研 究 發(fā) 現(xiàn), 僅 含 有GRMZM2G0081223 的近等基因系(near-isogeniclines,NILs)具有顯著的FSR 抗性。在玉米功能基因組學(xué)的研究中,多親本重組自交系是研究微效QTLs 或低頻QTLs 的優(yōu)質(zhì)群體材料,然而其GWAS 作圖的分辨率受到親本數(shù)量的影響,其中增加重組自交系的親本數(shù)量能夠提高作圖分辨率,但會消耗大量人力和物力;而傳統(tǒng)自然群體雖然重組頻率和等位基因多樣性高,但群體結(jié)構(gòu)更復(fù)雜,需要有效的統(tǒng)計手段或算法對其進(jìn)行校正。

2.3 谷子

谷子(Setaria italic L.)具有較強(qiáng)的抗旱性和耐貧瘠性,在旱作農(nóng)業(yè)中起著重要作用,是中國北方的主要糧食作物之一[60]。高質(zhì)量谷子基因組測序的完成使得研究者們能夠在大規(guī)模的谷子種質(zhì)中快速檢測基因組范圍內(nèi)的變異,促進(jìn)了谷子種質(zhì)中等位基因多樣性的研究[34,61]。Jia 等[62]對916 份谷子材料進(jìn)行全基因組低倍重測序及序列分析,并運(yùn)用其中845 787 個高質(zhì)量SNPs 構(gòu)建出一張精細(xì)的谷子單倍型圖譜;針對谷子的株型、產(chǎn)量、花期、抗病性、顏色等47 種農(nóng)藝性狀,采用GWAS 分析篩選出512 個相關(guān)的遺傳位點,其中,59 個位點至少控制2 種性狀,而一些前期被證明在抽穗期對環(huán)境溫度和光周期高度敏感的位點僅在部分地區(qū)有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性,其他環(huán)境中關(guān)聯(lián)性較低,表明很多數(shù)量性狀與所處的環(huán)境密切相關(guān)[27,41,62]。大量研究表明谷子的地方品種與現(xiàn)代育種品種中的產(chǎn)量相關(guān)性狀表型差異明顯,表現(xiàn)為現(xiàn)代育種品種中的圓錐花序重量顯著高于地方品種。如Jia 等[62]通過全基因組篩選,鑒定出36個可能在現(xiàn)代遺傳改良育種過程中受到選擇的基因組位點,其中16 個被定位在關(guān)聯(lián)位點周圍,包括與分蘗數(shù)、單株總圓錐花序數(shù)和外殼顏色相關(guān)聯(lián)的位點;而在谷子第5 號染色體上的qSH1 位點周圍顯示出很強(qiáng)的選擇痕跡[63],這些位點為研究相關(guān)基因是否在馴化過程中被人為選擇提供了線索。

2.4 高粱

高粱(Sorghum bicolor L.)作為研究圓錐花序類基因組的模式谷物,具有高水分利用效率、高生物量等特點,促進(jìn)高粱的遺傳分析與分子育種對保證糧食安全具有重要作用。如Bouchet 等[64]運(yùn)用DarT 標(biāo)記通過MLST(maximum length subtree)算法對高粱的群體結(jié)構(gòu)和連鎖不平衡程度進(jìn)行遺傳研究,定位了一系列與植物抗病性、DNA 損傷、光周期調(diào)控相關(guān)的位點。Morris 等[65]對生長在不同環(huán)境下的971 份高粱品種的農(nóng)藝性狀如植株高度、成熟時間及花序特性進(jìn)行GWAS 研究,篩選到已知的與植株成熟和淀粉代謝相關(guān)的位點Shattering1、brittle endosperm 2 和opaque2,這些位點在不同的地方品種中存在選擇性特性,進(jìn)一步對攜帶矮小和長分支花序等位基因的多個單倍型高粱的GWAS 圖譜進(jìn)行分析,找到部分控制植株高度和花序特性的位點及基因。籽粒大小是影響作物產(chǎn)量的重要性狀,也是作物馴化過程中的重要指標(biāo)。研究表明不同高粱品種的籽粒大小存在明顯差異,已有研究者利用傳統(tǒng)的QTL 定位手段成功將控制谷粒大小的13個QTL 位點定位在基因組上11 個非重疊區(qū)域內(nèi),但這些區(qū)域往往區(qū)間較大、分辨率低,很難獲得真正的候選基因[66]。Zhang 等[66]利用GWAS 針對谷粒數(shù)、谷粒長度、寬度等性狀進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)4 個與谷粒大小關(guān)聯(lián)性強(qiáng)的熱點區(qū)域,顯著縮短了QTLs 定位的候選區(qū)域并找到4 個候選基因(Sb04g015420、Sb06g033060、Sb07g023950、Sb10g018720),其中在基因Sb10g018720和Sb06g033060 上存在非同義突變的SNPs 位點,顯著影響谷粒大小和重量。Zhao 等[67]利用GWAS 對49個與谷粒和生物量相關(guān)的農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析,獲得101 個SNPs 至少與1 種性狀顯著相關(guān),并發(fā)現(xiàn)參與赤霉素(gibberellim,GA)途徑的候選基因GA2ox5 和KS3影響種子數(shù)量和植株高度,證明GA 參與植物形態(tài)建成,影響與產(chǎn)量相關(guān)的農(nóng)藝性狀。Zhang 等[66]對不同谷粒作物類群的比較研究表明,在高粱、水稻和玉米的基因組中,含有大規(guī)模的同源且功能保守的片段調(diào)控谷粒的大小,這種跨類群的同源片段大多功能相近,且能促進(jìn)產(chǎn)生相似的表型變異。Kong 等[68]運(yùn)用QTL 定位將9 種分蘗相關(guān)性狀的QTLs 位點定位在10 條染色體上,進(jìn)一步運(yùn)用GWAS 與共線性比較分析結(jié)合的方法,發(fā)現(xiàn)8 個與水稻分蘗相關(guān)的同源基因分布在鑒定出的QTLs 區(qū)域內(nèi),有效地縮短了QTLs 的區(qū)間范圍。GWAS 結(jié)合QTL 與共線性分析的研究策略,提高了遺傳圖譜的分辨率,加快了高粱農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的鑒定和遺傳育種進(jìn)程。

2.5 大麥

大麥(Hordeum vulgare L.)常通過近親交配產(chǎn)生后代,受到非隨機(jī)交配及選擇過程的影響,導(dǎo)致其群體結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜。如Wang 等[69]利用主成分分析法對615 個大麥品系進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明在PC2中大麥含有3 個亞群,其中大部分春麥和冬麥品種被聚類到2 個亞群,而未知生長習(xí)性的亞群內(nèi)也包含超過30 種大麥品種,此外在PC3 中發(fā)現(xiàn)春麥和冬麥品種間也存在不同的亞群,證明大麥中群體結(jié)構(gòu)K 值介于2～6 之間。Pasam 等[70]利用1 536 個SNP 對224個春麥品種進(jìn)行GWAS 研究,定位到了與穗型、株高、抽穗期等性狀緊密關(guān)聯(lián)的標(biāo)記及QTL;這些標(biāo)記的位置和之前定位到與開花時間連鎖的QTL 基因組區(qū)域基本一致,其中包含如HvFT3、PpdH1、HvFT4、eps2、HvGI、HvCO3、HvFT1、HvCO1 等開花途徑中的基因;而千粒重、淀粉含量和蛋白質(zhì)含量相關(guān)的標(biāo)記的分布與Vrs3、Vrs1、Vrs4、waxy 和Int-c 的基因組區(qū)域一致。Maurer 等[71-72]模擬玉米巢式關(guān)聯(lián)群體法,以春麥Barke 品系與25 個野生麥品種構(gòu)建了大麥HEB-25 的巢式關(guān)聯(lián)群體,并用于大麥發(fā)育過程(發(fā)芽、開花、成熟等)中的相關(guān)性狀、株高和千粒重的GWAS 分析中,共找到89 個關(guān)聯(lián)的QTL 位點,其中QTL-1H-10 附近的HvEFL3 位點的變化能夠加速植株的發(fā)育,使每個發(fā)育時期與春麥Barke 品種相比縮短2 ～3 d;Denso/sdw1 位點控制植株的半矮化性狀,同時該位點變異也表現(xiàn)出延長大麥發(fā)育時期的性狀,HvGA20ox2 基因可能是其中關(guān)鍵的候選基因。Saade 等[73]對大麥巢式群體HEB-25 在鹽脅迫下產(chǎn)量性狀進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),在鹽脅迫下大麥表現(xiàn)出開花時間提前、植株矮化和產(chǎn)量下降的性狀。通過GWAS 鑒定到2 個與開花相關(guān)的基因,即HvELF3 和HvCEN,其中在鹽脅迫下HvELF3 的表達(dá)量與植株高度和千粒重顯著相關(guān);而HvCEN 除控制植株矮化,還能顯著增加產(chǎn)量;此外,還發(fā)現(xiàn)位于α-葡糖苷酶基因(AK375658)上的SNP 標(biāo)記BOPA2_12_30822 在HEB1 群體中能夠解釋19.8%的產(chǎn)量變異性狀,能顯著提高鹽脅迫下的大麥產(chǎn)量。NAM 群體的構(gòu)建極大地豐富了大麥群體的種質(zhì)資源,為大麥的GWAS 研究提供了材料基礎(chǔ),有利于大麥重要農(nóng)藝性狀改良和候選基因的挖掘。

表1 全基因組關(guān)聯(lián)分析在作物育種研究中的應(yīng)用Table 1 The application of GWAS in crop breeding

2.6 小麥

普通小麥(Triticum aestivum L.)是多倍體作物,基因組復(fù)雜且尚未完全解析。目前小麥的GWAS 研究主要集中在利用高通量測序技術(shù)獲得的大量SNP 標(biāo)記進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析及相關(guān)性狀的基因定位。如Turuspekov 等[74]利用3 245 個SNP 標(biāo)記將194 個春麥品種分為3 個亞群,其中這些SNP 在小麥A 基因組(41.3%)和B 基因組(44.6%)中的分布顯著高于D基因組(14.1%),導(dǎo)致D 基因組的LD 值(26.8 cM)最高。Qaseem 等[75]同樣發(fā)現(xiàn)小麥D 基因組上的SNP 位點低于A 基因組和B 基因組,其中4D 染色體上的連鎖不平衡值最大(r2=0.64)。這可能是由于D 基因組的進(jìn)化時間較A 基因組和B 基因組晚,導(dǎo)致D 基因組更加保守;進(jìn)一步對12 種與產(chǎn)量相關(guān)的農(nóng)藝性狀進(jìn)行GWAS 分析發(fā)現(xiàn),共獲得114 個關(guān)聯(lián)的SNP 位點,其中21 個位點與單株穗數(shù)相關(guān),4 個位點與單穗粒數(shù)相關(guān),7 個位點與千粒重相關(guān),2 個位點(AX-94532960和AX-94539237)與花序長度相關(guān)。Wang 等[76]對105 個小麥品種進(jìn)行產(chǎn)量及相關(guān)性狀的GWAS 分析,共找到24 個與9 種產(chǎn)量相關(guān)性狀連鎖的標(biāo)記,其中與千粒重、籽粒形態(tài)和植株高度相關(guān)的4 個位點在不同環(huán)境中均能被檢測到,說明這些位點或性狀在進(jìn)化過程中較保守,受環(huán)境影響較小;而有效穗數(shù)、籽?？偖a(chǎn)量、葉面積等性狀受環(huán)境影響較大。此外,控制不同性狀的部分標(biāo)記會定位在染色體上的同一區(qū)域或鄰近區(qū)域,如位于7B 上控制株高的Wsnp_Ex_c11003_17857272 (77.13 cM)與千粒重相關(guān)標(biāo)記Ex_c12057_797 (77.13 cM)位置相同;位于4B 染色體上的Rht-D1 基因(31.5 cM)與AX-94592612 (39.0 cM)緊密連鎖,控制株高和單株穗數(shù);定位在2D 染色體上控制柄長和穗長/株高的SNP 標(biāo)記(20.6 cM 和28.1 cM)與Rht8(23.0 cM)基因位置相近。由此,不同的產(chǎn)量相關(guān)性狀之間存在復(fù)雜的聯(lián)系,可能是基于基因或位點的多效性,共同構(gòu)成調(diào)控小麥總產(chǎn)量的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。

3 展望

近年來,應(yīng)用QTL 和關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘糧食作物數(shù)量性狀基因已成為作物基因組學(xué)研究的熱點之一。隨著測序技術(shù)和統(tǒng)計算法的迅猛發(fā)展,GWAS 現(xiàn)已成為檢測作物復(fù)雜性狀自然變異的重要工具,其不僅能夠提高傳統(tǒng)的雙親分離群體作圖的分辨率,同時還能對多個農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)作圖,極大地提高了育種的效率[82]。但是基因之間、基因與環(huán)境間互作的統(tǒng)計算法有限,導(dǎo)致GWAS 結(jié)果較難解釋大部分復(fù)雜性狀的遺傳學(xué)特征;此外,群體結(jié)構(gòu)的劃分和海量的數(shù)據(jù)處理,也是關(guān)聯(lián)分析亟待解決的難題。

目前,RNA 測序和甲基化測序技術(shù)的迅猛發(fā)展使需要大量SNP 數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄組QTL 和甲基化QTL 作圖成為可能,而代謝組的發(fā)展有利于解決復(fù)雜性狀表型的鑒定,能進(jìn)一步促進(jìn)GWAS 研究[83]。在今后的研究中,研究者不僅可以利用GWAS 對糧食作物基因組的序列進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,還能鑒定作物的代謝組、轉(zhuǎn)錄組及全基因組甲基化的QTLs,從代謝和表達(dá)水平上對作物的分子遺傳機(jī)制進(jìn)行深入研究,加速糧食作物的品種改良。