尹 航 袁嵐瑛 俞 凱 章 麗 石 慧 王何瑜 龔一富,?

(1寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江寧波 315832;2寧波大學(xué)法學(xué)院,浙江寧波 315211)

生物柴油是從動植物油脂、廢棄油脂等可再生能源中提取的一種環(huán)境友好型燃料,因其具有性能良好、燃燒持續(xù)時間長、顆粒物排放量低等優(yōu)點(diǎn)而引起人們的廣泛關(guān)注[1]。三角褐指藻( Phaeodactylum tricornutum)為硅藻門的單細(xì)胞真核生物[2],因其生長速度快、光合作用強(qiáng)且油脂含量高(約占細(xì)胞干重的20%～30%)可作為一種良好的生物柴油原料[3]。

藻類植物和種子植物中的油脂主要以三脂酰甘油(triacylgilcerol, TAG)的形式存在,因此藻體中TAG 的含量與藻體的含油量密切相關(guān)[4]。甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)是藻類TAG 生物合成過程中的第1 個限速酶[5],主要負(fù)責(zé)將脂肪酰基從?；??；d體蛋白或其輔酶A 上轉(zhuǎn)移至甘油-3-磷酸的sn-1 位點(diǎn)合成1-?；?sn-甘油-3-磷酸(溶血磷脂酸)。因此,GPAT 在藻類的油脂合成過程中具有重要作用[6]。此外,GPAT 與植物的抗逆性也存在相關(guān)性,在植物抵抗高溫[7]、低溫[8-9]等非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。

研究表明,光照強(qiáng)度和溫度可調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)量,并能影響微藻中脂類物質(zhì)的含量[10-11]。因此,光照強(qiáng)度和溫度可作為促進(jìn)藻體內(nèi)脂類物質(zhì)合成的關(guān)鍵非生物因素。近年來對于GPAT 基因的研究主要集中于陸生植物[12-14],而關(guān)于三角褐指藻GPAT 在不同光照強(qiáng)度和溫度下基因表達(dá)量和油脂含量的應(yīng)答研究尚未見報道。本試驗(yàn)在三角褐指藻轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上對三角褐指藻GPAT(PtGPAT)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,利用不同光照強(qiáng)度和溫度處理三角褐指藻,通過實(shí)時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR, RTqPCR)分析該基因表達(dá)量差異并探究藻體內(nèi)脂質(zhì)的相應(yīng)變化情況,以期為新型能源材料的應(yīng)用以及植物抗逆分子機(jī)制方面的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 三角褐指藻培養(yǎng)

本研究所用的三角褐指藻由寧波大學(xué)海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微藻室提供。取過濾且高溫滅菌完畢的海水,以體積比1 ∶1 000 加入滅菌的培養(yǎng)基母液,培養(yǎng)基母液配方參照蔣霞敏等[15]的方法,以體積比1 ∶10接入三角褐指藻。三角褐指藻在光照強(qiáng)度為37.5 μmol·m-2·s-1,溫度為25℃,光照周期為16 h 光照/8 h黑暗的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d 后,分別對三角褐指藻施加光照強(qiáng)度分別為0、12.5、37.5 和62.5 μmol·m-2·s-1的光照處理以及15、20、25 和30℃的溫度處理[16-17],其他條件不變,每處理設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 三角褐指藻總RNA 的提取及轉(zhuǎn)錄組測序

收集處于對數(shù)生長期的藻液80 mL,4℃、5 000 r·min-1離心10 min,按照RNAiso plus [TaKaRa(大連)有限公司] 說明書提取三角褐指藻總RNA,使用PrimeScriptRTReagent Kit [TaKaRa(大連)有限公司]進(jìn)行cDNA 合成。設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù),樣品經(jīng)檢驗(yàn)合格后送至杭州聯(lián)川生物科技有限公司進(jìn)行測序。

由轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果獲得三角褐指藻GPAT 全長序列,其開放閱讀框(open reading frame,ORF)長度為1 305 bp,所使用的上游引物和下游因?yàn)榉謩e為gpat-F(5′-ATGATCGATTTCCGTCGGAACGC-3′)和gpat-R(5′-CTAGGCCTGATCCGTCGTTGTCG-3′),以三角褐指藻cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)體系為25 μL,擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,62℃退火30 s,72℃延伸90 s,循環(huán)30 次;72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,切膠回收目的條帶,將目的片段與MD18-T 載體進(jìn)行連接,再轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,挑取單菌落,進(jìn)行菌液驗(yàn)證陽性克隆,將陽性克隆送至上海生工生物公司進(jìn)行測序。

1.3 三角褐指藻GPAT 生物信息學(xué)分析

在NCBI 網(wǎng)站(http：/ /www.ncbi.nlm.nih.gov)上查找該基因的ORF,并運(yùn)用DNAMAN 軟件對三角褐指藻GPAT 進(jìn)行翻譯。

通過CBS 網(wǎng)站(http：/ /www.cbs.dtu.dl/)分析三角褐指藻GPAT 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。使用ExPASy 在線分析工具(http：/ /cn.expasy.org) 中的Compute Pl/Mw 獲得蛋白質(zhì)理論分子量以及等電點(diǎn)。運(yùn)用SignalP 確定GPAT 中是否存在信號肽。通過SOPMA 構(gòu)建GPAT 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),并使用SWISS Model 網(wǎng)站分析GPAT 蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)。通過Clustal X 和Mega 6.0 軟件析分保守序列并通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 三角褐指藻GPAT 表達(dá)分析

按照RNAiso plus Rit[TaKaRa(大連)有限公司]說明書提取不同溫度和光照強(qiáng)度處理后三角褐指藻總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用于RT-qPCR 分析。RTqPCR 反應(yīng)體系包括2×SYBR? Permix Ex TaqTM10 μL,上下游引物各0.8 μL,cDNA 模板2 μL,ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸20 s,循環(huán)40 次;72℃延伸8 min;16℃保存。以三角褐指藻18S 為內(nèi)參基因,內(nèi)參基因上游引物為18S-F (5′-ACCATTATGAAGTTGCGA T-3′),內(nèi)參基因下游引物為18S-R (5′-ACCCTCCAATT CCAAACAG-3′)。三角褐指藻GPAT 定量引物分別為gpat-dl-F (5′-TGGACCCGTTGGTATTGC-3′)和gpat-dl-R(5′-GTCGTTGTCGGATTGG-3′)。運(yùn)用2-ΔΔCt法[18]計算基因相對表達(dá)量。

1.5 三角褐指藻總脂含量測定

使用改良的Bligh-Dyer 法[19]測定三角褐指藻的總脂含量。分別取不同光照強(qiáng)度和溫度處理后的三角褐指藻藻液于50 mL 離心管中,4℃、4 000 r·min 離心20 min,冷凍干燥2 d。稱取0.25 g 藻粉溶于含有25 mL 甲醇、12.5 mL 氯仿以及10 mL 50 mmol·L-1K2HPO4(pH 值7.4)緩沖液的混合溶液中,震蕩1 h,繼續(xù)加入12.5 mL 氯仿和12.5 mL 50 mmol·L-1K2HPO4(pH 值7.4)緩沖液,混勻,靜置分層。取下層溶液,使用氯仿定容至10 mL。取5 mL 定容液于鋁碟中,60℃烘干至恒重,計算差重。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分析不同溫度和光照強(qiáng)度下三角褐指藻GPAT 表達(dá)量與總脂含量的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 三角褐指藻GPAT cDNA 序列分析

采用高通量轉(zhuǎn)錄組測序分析獲得了三角褐指藻GPAT 基因cDNA 序列。為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組獲得的GPAT 序列的準(zhǔn)確定,本研究采用RT-PCR 技術(shù)擴(kuò)增三角褐指藻GPAT 的ORF 序列并送至測序分析,其測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。三角褐指藻GPAT 基因cDNA 全長1 743 bp,含有一個長度為1 305 bp 的ORF,編碼434 個氨基酸(圖1)。通過Vector 多序列比對獲得3 個保守序列區(qū),分別為NHD(S/T)EADP(Q/A)、PFSMGRNL(Ⅰ/L/F)C 和(L/Ⅰ)W(Ⅴ/Ⅰ)APSGGRDR(圖2)。

圖1 三角褐指藻GPAT 全長序列及編碼氨基酸序列Fig.1 Full-length and encoded amino acid sequence of GPAT in P. tricornutum

圖2 三角褐指藻GPAT 氨基酸多序列比對Fig.2 Multi-sequence comparison of GPAT amino acids in P. tricornutum

2.2 三角褐指藻GPAT 理化性質(zhì)分析

ExPASy 分析結(jié)果顯示,三角褐指藻GPAT 的分子式為C1651H2685N465O512S13,理論等電位點(diǎn)為6.22。該蛋白正電荷殘基為37,負(fù)電荷殘基為41,預(yù)測不穩(wěn)定指數(shù)為41.75,為不穩(wěn)定蛋白。三角褐指藻GPAT 氨基酸組成中主要為Ala 和Leu,其中Ala 所占比例約為9.8%,Leu 所占比例約為9.6%。Signal 4.1 Serve 預(yù)測結(jié)果表明,三角褐指藻GPAT 蛋白不存在信號肽。利用SOPMA 軟件對三角褐指藻GPAT 的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果表明該蛋白主要結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲(random coil),占43.24%,其次為α 螺旋(alpha helix),占28.50%,延伸鏈(extended strand)占20.88%,β 轉(zhuǎn)角(beta turn)占7.37%。

利用SWISS Model 在線預(yù)測分析GPAT 空間結(jié)構(gòu)(圖3),發(fā)現(xiàn)三角褐指藻GPAT 含有的高度保守區(qū)域[(V/I/L)(W/Y)(V/I)APSGGRDR]為LPLATs 基因超級家族酶類的催化活性區(qū)(溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶),其?；Y(jié)合位點(diǎn)(putative acyl-acceptor binding pocket)位于第221～第229、第263 ～第274 和第311 ～第321氨基酸處,其作用為將脂肪酰轉(zhuǎn)移到3-磷酸甘油的C-1 位點(diǎn)上合成溶血磷脂酸(1-酰基-sn-甘油-3-磷酸)。

2.3 三角褐指藻GPAT 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

運(yùn)用NCBI 檢索三角褐指藻GPAT 氨基酸序列相似性,發(fā)現(xiàn)多種植物GPAT 氨基酸序列與三角褐指藻GPAT 氨基酸序列的相似性介于40%～68%之間。其中圓柱擬脆桿藻GPAT 氨基酸序列與三角褐指藻GPAT 氨基酸序列相似度最高,為68%,其次為大洋洲海藻鏈和單胞菌海鏈藻,分別為55%和53%。而三角褐指藻GPAT 與其他類型的植物的相似性較低,表明該基因在進(jìn)化過程中會發(fā)生變化,在不同生物中GPAT 編碼的蛋白可能會存在較大差異。

圖3 三角褐指藻GPAT 空間結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of spatial structure of GPAT in P. tricornutum

利用Clustal X 以及Mega 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,由圖4 可知,進(jìn)化樹主要分為2 支,亞麻芥、白芍、麝香百合、油棕、蘋果、麻風(fēng)樹、樹形棉和黃瓜聚為一支,三角褐指藻、軟克里藻、綠藻、新型微藻、假絲酵母和大洋洲海鏈藻聚為另一支。其中,大洋洲海鏈藻GPAT 與三角褐指藻GPAT 的親緣關(guān)系最近。

2.4 光照強(qiáng)度和溫度對三角褐指藻GPAT 基因表達(dá)水平和總脂含量的影響

由圖5 可知,三角褐指藻GPAT 相對表達(dá)量隨著光照強(qiáng)度和溫度的升高均呈先上升后下降的變化趨勢。20、25、30℃處理的三角褐指藻GPAT 相對表達(dá)量均極顯著高于CK,25℃時,三角褐指藻GPAT 相對表達(dá)量達(dá)到最大值,是CK 的11.46 倍,而隨著溫度進(jìn)一步的升高,三角褐指藻GPAT 表達(dá)量呈下降趨勢(圖5-A)。三角褐指藻GPAT 相對表達(dá)量在光照強(qiáng)度為37. 5μmol·m-2·s-1時達(dá)到最大值,為CK的1. 39倍,而在62.5 μmol·m-2·s-1強(qiáng)光處理下三角褐指藻GPAT表達(dá)受到抑制,表達(dá)量約為CK 的40%(圖5-B)。

圖4 三角褐指藻GPAT 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Evolution tree of GPAT system of P. tricornutum

圖5 不同溫度(A)和光照強(qiáng)度(B)下三角褐指藻GPAT 的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression of GPAT in P. tricornutum under different temperature(A) and illumination intensity(B)

圖6 不同溫度(A)和光照強(qiáng)度(B)下三角褐指藻的總脂含量Fig.6 Total lipid content of P. tricornutum under different temperature(A) and illumination intensity(B)

由圖6 可知,三角褐指藻總脂含量隨著溫度和光照強(qiáng)度的升高也呈先上升后下降的趨勢,總脂含量均極顯著高于CK。其中,在溫度為25℃,光照強(qiáng)度為37.5 μmol·m-2·s-1時,三角褐指藻總脂含量分別達(dá)到最大值,分別為CK 的2.14 倍(圖6-A)和1.58 倍(圖6-B)。

相關(guān)性分析結(jié)果表明,三角褐指藻GPAT 表達(dá)量與總脂含量在不同溫度條件下具有顯著相關(guān)性(r=0.980, P＜0.05),而在不同光照強(qiáng)度下相關(guān)性不顯著(r=0.087, P＞0.05)。雖然三角褐指藻GPAT 的表達(dá)水平隨著光照強(qiáng)度的變化與藻體中總脂含量的變化并不完全一致,但隨著光照強(qiáng)度和溫度的升高,基因表達(dá)量與脂質(zhì)含量呈先上升后下降的趨勢表現(xiàn)出高度的一致性。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)三角褐指藻GPAT 含有1 個高度保守的LPLATs 基因超級家族酶類的催化活性區(qū),陳麗靜等[20]在毛百合GPAT 中也發(fā)現(xiàn)1 個該超家族酶類的保守區(qū)域,該區(qū)域常含有?；Y(jié)合位點(diǎn),可與CoA 或者ACP 上的酰基結(jié)合,在參與1-?；?sn-甘油-3-磷酸的合成中起重要作用,進(jìn)而證實(shí)了本研究經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序獲得的PtGPAT 基因即為三角褐指藻GPAT 基因。

本研究通過比較三角褐指藻與其他植物GPAT 氨基酸序列相似性發(fā)現(xiàn),三角褐指藻GPAT 基因序列與其他物種相似性較低。Misra 等[21]研究表明,藻類和種子植物GPAT 之間的序列相似性較低,但二者間卻存在高度保守的結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果顯示,三角褐指藻與大洋洲海鏈藻的親緣關(guān)系較近,與亞麻芥、白芍等被子植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn),此結(jié)果與傳統(tǒng)進(jìn)化分類結(jié)果一致,表明在進(jìn)化過程中,藻類PtGPAT 逐漸分化,最終形成獨(dú)立的進(jìn)化分支[22]。而藻類GPAT 基因在進(jìn)化水平的關(guān)聯(lián)性可歸因于譜系之間的基因水平轉(zhuǎn)移[21]。劉聰?shù)萚23]研究表明,植物GPAT 基因存在多個基因家族成員,且不同基因家族成員之間的進(jìn)化距離存在較大差異,而關(guān)于三角褐指藻GPAT 基因家族各成員之間親緣關(guān)系的比較還有待進(jìn)一步深入研究。

在真核生物中,TAG 作為中性脂質(zhì)是能量的關(guān)鍵儲存形式和生物柴油生產(chǎn)的主要原料,有研究表明,微藻中的TAG 積累通常與環(huán)境脅迫相關(guān),如光照強(qiáng)度、高溫、氮限制和鹽度[24-25]。石娟等[26]研究表明,等邊金藻(Isochrysis galbana)和小新月菱形藻(Nitzschia closterium f. minutissima)在低光照強(qiáng)度下可積累較多的脂類物質(zhì)。而張澤凌等[27]研究光照強(qiáng)度對大龍骨藻(Tropidoneis maxima)總脂含量的影響發(fā)現(xiàn),強(qiáng)光環(huán)境有利于大龍骨藻總脂含量的積累,且在光照強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1時藻體內(nèi)總脂含量達(dá)到最大值,表明不同光照強(qiáng)度下微藻體內(nèi)總脂含量存在差異。本研究表明,隨著溫度和光照強(qiáng)度的升高,三角褐指藻體內(nèi)總脂含量呈先升高后降低的趨勢,與前人研究一致。Aaronson[28]研究表明,高溫或低溫條件均會導(dǎo)致藻體內(nèi)的酶發(fā)生不可逆損傷,進(jìn)而導(dǎo)致脂類物質(zhì)合成受限,而不同種類的微藻在脂類物質(zhì)積累的最適溫度存在差異。周連寧等[29]研究表明,小球藻(Chlorella vulgaris)的總脂含量隨溫度的升高呈先上升后下降的趨勢,且在25℃時達(dá)到最大積累量,此結(jié)果與張桂艷等[30]的報道類似。而本研究中,當(dāng)溫度達(dá)到30℃時脂類含量仍保持在較高水平,表明30℃時并不能使脂質(zhì)物質(zhì)相關(guān)合成酶完全失活,只能使其活性較25℃時減弱。

Ayawardhane 等[31]認(rèn)為,GPAT 可參與膜脂、包外脂質(zhì)和儲存TAG 等多種脂質(zhì)物質(zhì)的合成。Misra等[32]研究表明,麻瘋樹GPAT 的下調(diào)導(dǎo)致種子油含量相對于野生型減少12%,而擬南芥中麻瘋樹GPAT 的異源表達(dá)使其種子含油量增加了13%～20%。Fukuda等[33]指出,在單細(xì)胞紅藻(Cyanidioschyzon merolae)中過量表達(dá)GPAT 可使藻體內(nèi)TAG 含量增加56.1 倍。GPAT 作為植物甘油脂合成途徑中的第1 個限速酶,因?qū)Σ煌孜锏倪x擇性差異而影響著類囊體甘油脂的含量、飽和程度[9]。本研究對不同光照強(qiáng)度和溫度處理后的三角褐指藻GPAT 進(jìn)行表達(dá)調(diào)控分析,結(jié)果表明,隨著光照強(qiáng)度和溫度的上升,三角褐指藻GPAT 的表達(dá)量均呈先上升后下降的趨勢。推測,在溫度和光照強(qiáng)度升高初期,由于光強(qiáng)和溫度對三角褐指藻內(nèi)關(guān)鍵酶產(chǎn)生影響,適宜的溫度和光強(qiáng)導(dǎo)致酶活性增強(qiáng),從而加快了基因的轉(zhuǎn)錄翻譯與蛋白酶的合成,并加速了藻內(nèi)脂類合成與代謝。而隨著溫度和光照強(qiáng)度的升高,三角褐指藻可能通過調(diào)控GPAT 的過表達(dá)從而提高細(xì)胞膜內(nèi)的總脂含量,最終提高對高溫、強(qiáng)光等逆境脅迫的耐受性[34]。但當(dāng)溫度和光照強(qiáng)度持續(xù)升高時,不僅酶活性受到抑制,藻細(xì)胞的生理活性也會遭到破壞,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[35]。因此,在溫度達(dá)到30℃,光照強(qiáng)度達(dá)到62.5 μmol·m-2·s-1時,三角褐指藻體內(nèi)酶活及代謝活動減弱,導(dǎo)致GPAT 表達(dá)量和總脂含量均下降。

4 結(jié)論

本研究通過克隆獲得三角褐指藻的全長GPAT 序列,完成三角褐指藻GPAT 生物信息學(xué)分析及表達(dá)特征分析。結(jié)果表明,隨著光照強(qiáng)度和溫度的升高,三角褐指藻GPAT 表達(dá)量和總脂含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,且GPAT 表達(dá)量與總脂含量隨溫度變化呈顯著正相關(guān)(r=0.980, P＜0.05),表明三角褐指藻GPAT可能是其脂類代謝途徑的關(guān)鍵基因,光照強(qiáng)度和溫度是影響三角褐指藻GPAT 表達(dá)和脂質(zhì)合成的重要因素。本研究為今后利用基因工程手段提高植物體內(nèi)油脂含量提供了優(yōu)質(zhì)的基因資源,同時為進(jìn)一步揭示三角褐指藻脂類物質(zhì)合成的分子調(diào)控機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。