孟純陽(yáng) 魏小春 趙艷艷 原玉香 王志勇楊雙娟 姜 俊 張曉偉,?

(1河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,河南鄭州 450002;2鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州 450001;3駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 河南駐馬店 463000)

油菜素內(nèi)酯(brassinosteroids,BRs)又稱蕓薹素內(nèi)酯,是一種天然植物激素,主要存在于植物的花粉、種子、莖、葉等器官中,廣泛參與植物各種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)過(guò)程,如莖伸長(zhǎng)、葉發(fā)育、花粉管生長(zhǎng)、木質(zhì)部分化、衰老、光形態(tài)發(fā)生、脅迫響應(yīng)等[1-2]。Li 等[3]對(duì)擬南芥油菜素內(nèi)酯生物合成突變體進(jìn)行分子鑒定,發(fā)現(xiàn)這些有缺陷的突變體表現(xiàn)出下胚軸和葉柄變短、頂端顯性和雄性不育減弱、衰老和開(kāi)花延緩以及在黑暗中去黃化等表型,進(jìn)一步證明油菜素內(nèi)酯對(duì)正常植物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。

BES1 是一種植物特異性轉(zhuǎn)錄因子,可以與BR響應(yīng)基因結(jié)合并進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究表明,BZR1 和BES1 是2 種密切相關(guān)的核蛋白,且二者氨基酸序列具有較高的同源性,通過(guò)保守N 末端DNA 結(jié)合域與DNA 結(jié)合[4],并與油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因結(jié)合,調(diào)控該類基因的表達(dá)[5-7]。在BR 信號(hào)通路中BZR1 和BES1 均發(fā)揮正調(diào)控作用[8-9]。BRI1 是一種跨膜富亮氨酸重復(fù)受體激酶,可以與另一種富亮氨酸受體激酶BAK1 相互作用,它們的共受體可以在細(xì)胞表面感受BR 信號(hào)。此外,BIN2 被證實(shí)是BR 信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子,當(dāng)缺乏BR 信號(hào)時(shí),BZR1 和BES1 在BIN2激酶作用下主要以磷酸化形式存在, 磷酸化的BZR1可以被26S 酶體降解, 同時(shí)BES1 的磷酸化作用也受BSU1 蛋白調(diào)節(jié)[10]。上述研究表明,BR 信號(hào)通過(guò)BRI1-BAK1 受體激酶抑制BIN2 或活化BSU1,使非磷酸化的BZR1 和BES1 在細(xì)胞核中積累,從而反向調(diào)節(jié)BR 靶基因。

辣椒(Capsicum annuum L.)是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的重要蔬菜作物兼經(jīng)濟(jì)作物。辣椒果實(shí)以其高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特風(fēng)味而聞名于世。2014年辣椒基因組序列已經(jīng)完成測(cè)序并公布[11-12],但關(guān)于辣椒基因的生物信息學(xué)特征和潛在作用的研究并不常見(jiàn),且辣椒BES1 家族對(duì)不同脅迫的響應(yīng)研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以已測(cè)序辣椒CM334 為試驗(yàn)材料,進(jìn)行全基因組BES1 家族鑒定,鑒定出9 個(gè)候選BES1 基因,并對(duì)候選基因的性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、時(shí)空表達(dá)特征進(jìn)行分析,以期為進(jìn)一步研究BES1 基因?qū)ι锘蚍巧锩{迫的表達(dá)模式奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用辣椒材料為CM334,由韓國(guó)首爾國(guó)立大學(xué)提供。辣椒培養(yǎng)條件參照魏小春等[13]的方法。當(dāng)辣椒幼苗生長(zhǎng)至6～8 片真葉展開(kāi)時(shí)分別進(jìn)行相關(guān)脅迫處理。

1.1.1 不同脅迫處理 采用100 μmol·L-1脫落酸(abscisic acid,ABA)和200 μmol·L-1茉莉酸甲酯(methyl jasmona,MeJA)分別噴灑辣椒葉片的正反面,以噴灑無(wú)菌水為對(duì)照;對(duì)辣椒葉片進(jìn)行高溫(heat)處理,白天溫度設(shè)置為42±2℃,夜晚設(shè)置為35±2℃;對(duì)辣椒葉片進(jìn)行低溫(cold)處理,光照培養(yǎng)箱的溫度降至為5℃(晝)/0℃(夜);以300 mmol·L-1NaCl 對(duì)辣椒葉片進(jìn)行鹽(Nacl)處理,并以加入無(wú)菌水處理為對(duì)照。

1.1.2 疫病處理(YB) 將辣椒幼苗的根置于用Hoagland’s 培養(yǎng)液配置好的孢子懸浮液中(病原菌來(lái)自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)毛莊實(shí)驗(yàn)基地),以無(wú)菌水作對(duì)照。28℃保濕24 h 后在溫度28℃、相對(duì)濕度70%～90%條件下培養(yǎng),期間每日搖晃水培盆,以補(bǔ)充培養(yǎng)液中的溶氧含量。以上所有處理的辣椒植株在培養(yǎng)箱中的光照強(qiáng)度均為160 μmol·m-2·s-1,光周期均為12 h 光照/12 h 黑暗。

1.2 方法

1.2.1 辣椒BES1 基因的鑒定 將BES1(Pfam：PF05687)保守結(jié)構(gòu)域與辣椒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http：/ /peppergenome.snu.ac.kr/)[14]進(jìn)行BLAST 比對(duì),獲得的所有候選序列在NCBI 進(jìn)行Blastp 比對(duì)。利用在線分析工具ProtParam (http：/ /web.sxpasy.org/protparam/)分析候選氨基酸序列的等電點(diǎn)及分子量[15]。

1.2.2 基因結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域分析 以候選BES1 家族成員的CDS 序列和基因序列為參照,通過(guò)在線GSDS2.0(Gene Structure Display Server,http：/ /gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析[16]。在此網(wǎng)站進(jìn)行分析時(shí)將CDS 序列和基因序列都轉(zhuǎn)換成FASTA 格式,采用Tbtools (Toolbox for Biologists)對(duì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析 采用CLUSTALW 對(duì)BES1家族蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì),比對(duì)后BES1 蛋白序列用MEGA7.0 軟件中的鄰近法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),校驗(yàn)參數(shù)bootstrap 值設(shè)置為1 000 次重復(fù)。

1.2.4 辣椒BES1 基因家族表達(dá)模式分析 在(https：/ /www. nature. com/articles/ng. 2877) 中獲取CM334 RNA-seq 數(shù)據(jù),利用HemI 繪制表達(dá)熱圖并進(jìn)行分析。

1.2.5 辣椒總RNA 的提取及cDNA 第一鏈的合成 總RNA 提取按照MiniBeST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa,大連)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。cDNA 第一鏈的合成參照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa,大連)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.6 辣椒BES1 基因家族脅迫應(yīng)答分析 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)(引物信息詳見(jiàn)表1),反應(yīng)體系為20.0 μL,包括cDNA 2.0 μL、上下游引物各1 μL、10.0 μL 2×SYBR? Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus) 以及6 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸60 s,循環(huán)40 次[13]。采用2-△△CT法[17]計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒BES1 基因家族成員的鑒定

利用BES1_N 結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型在辣椒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)PGP(http：/ /peppergenome.snu.ac.kr/)進(jìn)行BLAST 比對(duì),從CM334 基因組中鑒定出9 個(gè)BES1轉(zhuǎn)錄因子候選成員(表2)。9 個(gè)候選基因與遵辣一號(hào)基因組進(jìn)行比對(duì),用遵辣一號(hào)基因?qū)蜻x基因序列中有空位的進(jìn)行修正。BES1 基因家族開(kāi)放閱讀框大小介于546(CA10g04670) ～2 142 bp(CA08g07160)之間,編碼蛋白序列長(zhǎng)度范圍介于181(CA10g04670)～713 個(gè)氨基酸(CA08g07160)之間,分子量介于20.22(CA10g04670)～78.23 kDa(CA08g07160)之間,等電點(diǎn)介于5.48(CA02g13270) ～9.23(CA04g20150)之間。

2.2 辣椒BES1 基因進(jìn)化及結(jié)構(gòu)分析

由圖1 可知,9 個(gè)辣椒BES1 基因可分為ClassⅠ和ClassⅡ2 類,分別含有7 個(gè)和2 個(gè)BES1 基因。ClassⅠ中的基因均只含有1 個(gè)內(nèi)含子,ClassⅡ中的基因含有多個(gè)內(nèi)含子(8 ～10 個(gè))。ClassⅠ和ClassⅡ組內(nèi)的結(jié)構(gòu)均高度相似。Class Ⅰ與Class Ⅱ序列差異較大,Class Ⅰ序列較短。

2.3 辣椒BES1 基因結(jié)構(gòu)域分析

由圖 2 可知, 大部分基因( CA12g12430、CA04g20150、Capana02g000043、CA07g16850、CA04g01080 和CA10g04670)都含有BES1_N 結(jié)構(gòu)域。僅CA02g13270 含有 BES1 _ N 超家族結(jié)構(gòu)域。Capana01g004209 和CA08g07160 含有PLN02905 超家族結(jié)構(gòu)域。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了研究辣椒BES1 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,用鄰近法分析了辣椒、擬南芥、甘藍(lán)、黃瓜、大豆、谷子、番茄和葡萄BES1 家族的進(jìn)化關(guān)系。由圖3 可知,與辣椒BES1 基因家族關(guān)系最近的是同屬于茄科的番茄,表明在進(jìn)化過(guò)程中辣椒和番茄BES1 具有較高的保守性,即可以通過(guò)已研究物種BES1 基因家族功能來(lái)推測(cè)辣椒BES1 的功能。同時(shí)發(fā)現(xiàn),單子葉植物谷子的部分BES1 基因單獨(dú)一個(gè)支,但某些BES1 基因與雙子葉植物進(jìn)化關(guān)系較近,表明單子葉植物與雙子葉植物BES1基因家族在進(jìn)化上既有相同之處,也存在差異。

2.5 辣椒BES1 基因時(shí)空表達(dá)分析

由圖4 可知,BES1 基因在不同組織的表達(dá)模式差異明顯,BES1 基因在葉中表達(dá)量明顯低于根和莖中的表達(dá)量。CA04g01080 在果皮發(fā)育和葉中表達(dá)量相對(duì)較低,但在根和莖中表達(dá)量高。CA07g16850 在果皮和胎座發(fā)育中表達(dá)量較低,但在莖中表達(dá)量較高。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)CA10g04670 在各組織中不表達(dá),整體上ClassⅠ其他成員在果皮中具有相似的表達(dá)模式。綜上,辣椒BES1 基因在不同組織中的功能可能存在差異。

2.6 辣椒BES1 基因家族脅迫應(yīng)答分析

由圖5 可知,在ABA、低溫、高溫、MeJA、YB 脅迫下,CA04g20150 和CA12g17430 的表達(dá)量均在2 h 時(shí)迅速升高, 應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈。在高溫脅迫下,CA04g20150 和CA12g17430 在12 h 時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值。在鹽脅迫下,CA04g20150 和CA12g17430 基因量在不同的時(shí)間差異不大,表明BES1 基因?qū)}脅迫不敏感。

圖1 辣椒BES1 基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)Fig.1 The gene structure of BES1 gene family members in pepper

圖2 辣椒BES1 基因家族成員保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Conserved domain of BES1 gene family members in pepper

圖3 單子葉和雙子葉BES1 基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree analysis of monocotyledon and dicotyledonous BES1 gene family

圖4 BES1 基因在CM334 不同組織中表達(dá)模式Fig.4 Expression profile of BES1 gene for different tissues in CM334

圖5 脅迫條件下辣椒BES1 基因家族2 個(gè)代表基因的表達(dá)量Fig.5 Expression of 2 representative genes of BES1 gene family in pepper under stress

3 討論

辣椒中BES1 基因在擬南芥中均能找到同源基因,而擬南芥中部分BES1 基因已經(jīng)研究得較為清楚[7],因此可以根據(jù)擬南芥BES1 基因功能推測(cè)辣椒中同源基因功能。研究表明,低等植物的BES1 轉(zhuǎn)錄因子一般較高等植物少,BES1 轉(zhuǎn)錄因子在植物進(jìn)化過(guò)程中可能起到重要作用[18]。胡靜靜等[19]對(duì)甘藍(lán)型油菜BES1 基因家族進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)BES1 基因主要在根和葉中高表達(dá),在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。本研究利用已公布的CM334 基因組測(cè)序數(shù)據(jù)共鑒定出9 個(gè)BES1 基因,根據(jù)基因結(jié)構(gòu)將BES1 基因家族分為2 類,其中,大部分BES1 基因在結(jié)構(gòu)上相似,都只含有一個(gè)內(nèi)含子,并且都含有BES1_N 結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明,辣椒BES1 基因在進(jìn)化上與番茄親緣關(guān)系最近。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也發(fā)現(xiàn),辣椒BES1基因家族在根和葉中表達(dá)量較高,在辣椒果實(shí)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。

油菜素內(nèi)酯作為一種脅迫緩和劑,廣泛分布于植物中,以抵御高溫[20]、低溫[21]、干旱[22]、鹽[23]、除草劑[24]、昆蟲[25]、病原體[26]等脅迫。此外,BES1 能抑制BR 合成途徑中一些酶(CPD、DWF4 等)和BR 信號(hào)組分BRI1、BES1 同源基因(BEH1 和BEH2)的表達(dá),從而反饋抑制BR 響應(yīng)[27]。研究表明,BZR 或BES1 功能缺失植株均未出現(xiàn)明顯的BR 不敏感性。通過(guò)RNA干擾技術(shù)對(duì)BES1 和BZR 轉(zhuǎn)錄水平同時(shí)抑制,導(dǎo)致BR不敏感的表型,表明BZR1、BES1 及其他家族成員之間存在局部基因冗余現(xiàn)象[4,23]。Saito 等[28]發(fā)現(xiàn)BZR1和BES1 在維管組織發(fā)育上的功能存在冗余現(xiàn)象,因此BES1 可能通過(guò)影響B(tài)R 信號(hào)通路和BR 合成,增強(qiáng)其對(duì)脅迫的抵抗力。本研究結(jié)果表明,BES1 基因家族在辣椒中表達(dá)具有差異性, CA04g20150 和CA12g17430 在ABA、低溫、高溫、MeJA 和YB 脅迫下明顯上調(diào)表達(dá),表明這2 個(gè)基因在應(yīng)對(duì)脅迫時(shí)發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié)論

本研究以辣椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),利用生物信息學(xué)方法在轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)BES1 基因家族進(jìn)行了鑒定和分析。結(jié)果表明,在辣椒中共鑒定得到9 個(gè)BES1基因,根據(jù)基因結(jié)構(gòu)將BES1 基因家族劃分為2 組。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明,BES1 基因在辣椒不同組織中差異性表達(dá)。同時(shí),RT-qPCR 分析發(fā)現(xiàn)BES1 基因能增強(qiáng)植物抵御逆境脅迫的能力。本研究為辣椒中BES1基因抵御逆境脅迫的分子機(jī)制研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。