呂 強 李 靖 鐘 鳴 駱 洋 蔡曉燕&

上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院普外科1(200135) 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院胃腸外科2

背景：可誘導(dǎo)T細(xì)胞共刺激分子(ICOS)屬于B7-CD28免疫球蛋白家族，參與細(xì)胞增殖、分化以及免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)過程，其表達異常與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)。目的：探討ICOS在結(jié)直腸癌中的表達及其臨床意義。方法：收集32對新鮮結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)癌旁非癌組織，以及211例石蠟包埋結(jié)直腸癌組織，分別采用real-time PCR和免疫組化法檢測ICOS mRNA和蛋白表達，分析其表達與患者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果：與非癌組織相比，ICOS在結(jié)直腸癌組織中呈低表達(P<0.05)，其表達與腫瘤大小、血清CEA水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期呈顯著負(fù)相關(guān)(P均<0.05)，與腫瘤發(fā)生部位無明顯相關(guān)性(P>0.05)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，結(jié)直腸癌患者ICOS表達水平越低，預(yù)后越差(P<0.05)。多因素Cox回歸分析顯示，ICOS表達水平是結(jié)直腸癌患者的臨床預(yù)后指標(biāo)之一(HR=0.821, 95% CI: 0.588～0.912, P=0.034)。結(jié)論：ICOS低表達可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并與預(yù)后不良相關(guān)。ICOS有望成為結(jié)直腸癌預(yù)后的分子標(biāo)志物。

結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是我國最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，均位居所有惡性腫瘤的第五位[1]。近年來，盡管手術(shù)聯(lián)合放化療等綜合治療手段的廣泛應(yīng)用提高了結(jié)直腸癌患者的生存率，但目前其總體生存率仍較低，多數(shù)患者確診時已是中晚期。因此，尋找結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵分子靶點并對之進行有效調(diào)控以改善患者預(yù)后成為當(dāng)前研究熱點。

B7-CD28免疫球蛋白家族是最廣泛的T細(xì)胞共刺激分子，其中的抑制性分子程序性死亡分子-1(PD-1)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)是目前腫瘤研究中的亮點，針對這兩個靶分子的單克隆抗體藥物nivolumab和ipilimumab已在多種惡性腫瘤中顯示出良好的療效[2-3]。與此同時，B7-CD28家族中的激活性分子也日益受到重視?？烧T導(dǎo)T細(xì)胞共刺激分子(inducible T-cell co-stimulator, ICOS)是B7-CD28家族成員之一，與經(jīng)典分子CD28同屬于激活性分子，可刺激抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，參與細(xì)胞增殖、分化以及免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)過程，其表達異常與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)[4-5]。本研究旨在探討ICOS在結(jié)直腸癌中的表達及其與腫瘤臨床病理特征和患者預(yù)后的相關(guān)性。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

用于real-time PCR的32對新鮮結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)癌旁非癌組織(距腫瘤邊緣>5 cm)來源于2018年1月—2018年12月浦東新區(qū)公利醫(yī)院普外科手術(shù)標(biāo)本；用于免疫組化檢測的211例石蠟包埋結(jié)直腸癌組織來源于2005年1月—2015年12月浦東新區(qū)公利醫(yī)院普外科和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院胃腸外科手術(shù)標(biāo)本。上述患者術(shù)前均未接受新輔助化療或其他針對腫瘤的治療，所有標(biāo)本均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。通過門診或電話隨訪獲取患者預(yù)后信息。

二、主要試劑

TRIzolTM試劑(InvitrogenTM, Thermo Fisher Sci-entific)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、real-time PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]；PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；ICOS兔單克隆抗體(Abcam plc.)；GAPDH抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(Pro-teintech Group)。

三、方法

1. Real-time PCR：使用TRIzol試劑抽提組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。ICOS引物：F 5’-TGT CAG GGC ACA ATT CCC TC-3’, R 5’-ACC CCA CAC ACA GAA ACC TG-3’；內(nèi)參GAPDH引物：F 5’-ACT CGT CAT ACT CCT GCT-3’, R 5’-GAA ACT ACC TTC AAC TCC-3’。PCR條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。2-ΔΔCT法計算mRNA相對表達量。實驗重復(fù)3次。

2. 免疫組化染色：組織石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，0.3% H2O2孵育15 min，微波修復(fù)15 min，自然冷卻后10%牛血清白蛋白封閉30 min，滴加經(jīng)PBS稀釋的ICOS抗體(1∶300)，4 ℃過夜，HRP標(biāo)記二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

ICOS陽性染色主要定位于腫瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)細(xì)胞。光學(xué)顯微鏡下隨機觀察10個高倍視野，記錄1 000個腫瘤細(xì)胞的ICOS陽性細(xì)胞百分比，結(jié)合染色強度進行半定量評分[6]。陽性細(xì)胞百分比評分：1%～25%，1分；25%～50%，2分；>50%，3分。染色強度評分：弱(淡黃色)，1分；中(棕黃色)，2分；強(棕褐色)，3分?？偡譃閮身椩u分之積：1～3分為低表達，≥4分為高表達。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、ICOS mRNA表達

以real-time PCR檢測32對結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的ICOS mRNA表達，結(jié)果顯示癌組織ICOS mRNA表達水平明顯低于相應(yīng)癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1A)。按腫瘤大小以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進行分層分析，腫瘤>5 cm(圖1B)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(圖1C)和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(圖1D)的結(jié)直腸癌患者癌組織中ICOS mRNA表達水平相對較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果表明，ICOS mRNA在結(jié)直腸癌組織中呈低表達，并可能影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展。

二、ICOS蛋白表達

為明確ICOS在結(jié)直腸癌組織中的表達和定位，進一步對211例結(jié)直腸癌組織進行ICOS免疫組化染色，結(jié)果顯示癌組織ICOS蛋白高表達率為52.1%(110/211)，光學(xué)顯微鏡下可見腫瘤細(xì)胞、腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒；值得注意的是，TNM Ⅳ期結(jié)直腸癌患者癌組織中ICOS蛋白幾乎不表達或為低表達(圖2)。上述結(jié)果表明，ICOS蛋白在結(jié)直腸癌組織中呈低表達，TNM分期越晚，其表達越低。

三、ICOS表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性

根據(jù)免疫組化評分結(jié)果將211例結(jié)直腸癌組織分為ICOS 低表達組(n=101)和ICOS高表達組(n=110)，χ2檢驗顯示ICOS蛋白表達與腫瘤大小、血清CEA水平和TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡和腫瘤部位無明顯相關(guān)性(P>0.05)(表1)。

四、ICOS表達與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系

為驗證ICOS表達對結(jié)直腸癌預(yù)后的影響，采用Kaplan-Meier生存曲線和log-rank檢驗對ICOS低表達與高表達結(jié)直腸癌患者進行生存分析，結(jié)果表明ICOS表達水平與患者預(yù)后呈顯著正相關(guān)，表達水平越低，預(yù)后越差(P<0.05)(圖3)。

單因素Cox比例風(fēng)險模型分析顯示，腫瘤組織ICOS表達水平、腫瘤大小、TNM分期為結(jié)直腸癌預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)(P<0.05)；將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的變量進一步納入多因素分析，結(jié)果顯示腫瘤組織ICOS表達水平是影響結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后的指標(biāo)之一(HR=0.821, 95% CI: 0.588～0.912,P=0.034)(表2)。

討 論

盡管ICOS與經(jīng)典分子CD28同屬于激活性T細(xì)胞共刺激分子，但兩者存在很大差異。CD28常規(guī)表達于T細(xì)胞表面，主要為T細(xì)胞激活提供必需的共刺激活化信號；而ICOS則只表達于活化T細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面，其信號通路可促進不同類型的T細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-10(IL-10)、IL-4、IL-5、干擾素-γ(IFN-γ)、IL-17等細(xì)胞因子[4，6-7]。研究顯示ICOS在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有雙重作用，其既可參與抗腫瘤T細(xì)胞免疫應(yīng)答，又可通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制活性發(fā)揮促腫瘤效應(yīng)[8]。因此，ICOS被視為抗腫瘤治療的潛在靶點。既往研究發(fā)現(xiàn)ICOS在胃癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤組織中表達異常，且其表達水平與患者預(yù)后有關(guān)[9-13]。

A：結(jié)直腸癌組織與相應(yīng)癌旁組織ICOS mRNA表達比較；B、C、D、腫瘤>5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者癌組織中ICOS mRNA表達水平相對較低

圖1ICOS mRNA在32對結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的表達情況

圖2 結(jié)直腸癌組織ICOS蛋白表達情況(免疫組化染色，×20)

表1 ICOS表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性n(%)

圖3 ICOS低表達與高表達結(jié)直腸癌患者生存分析

本研究采用real-time PCR和免疫組化染色檢測ICOS在結(jié)直腸癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中的表達，以探討ICOS在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示ICOS mRNA和蛋白在結(jié)直腸癌組織中均呈低表達，其表達水平與腫瘤大小、血清CEA水平、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及TNM分期呈顯著負(fù)相關(guān)，與患者預(yù)后呈顯著正相關(guān)。Cox比例風(fēng)險模型分析證實ICOS表達水平是影響結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后的因素之一。推測在結(jié)直腸癌中，ICOS低表達可能參與了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，從而促進腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲。腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力與腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，進而影響患者預(yù)后。

近年來越來越多的研究表明左半結(jié)腸癌與右半結(jié)腸癌在分子特征、癌變途徑等方面存在明顯差異，如正常右半結(jié)腸上皮細(xì)胞的人類錯配修復(fù)基因(hMLH1)啟動子甲基化水平和O-6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)表達明顯高于左半結(jié)腸；右半結(jié)腸癌與BRAF基因突變顯著相關(guān)，其發(fā)生更多經(jīng)由鋸齒狀腺瘤-癌途徑，而左半結(jié)腸癌的發(fā)生常為傳統(tǒng)腺瘤-癌途徑[14-17]。本研究中ICOS在左半結(jié)腸癌與右半結(jié)腸癌組織中的表達并無明顯差異，表明其低表達在結(jié)直腸癌中的作用無位置特異性。原發(fā)部位不同的結(jié)直腸癌，預(yù)后也有較大差異。對于中晚期患者，左半結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)后存活率明顯優(yōu)于右半結(jié)腸癌[15]，但本研究預(yù)后因素分析顯示腫瘤部位并非結(jié)直腸癌的預(yù)后影響因素，可能與本研究入組患者例數(shù)較少有關(guān)，有待后續(xù)收集更多結(jié)直腸癌組織樣本做進一步分析。

表2 結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)因素分析(Cox比例風(fēng)險模型)

綜上所述，ICOS低表達可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其表達水平與結(jié)直腸癌臨床分期和患者預(yù)后密切相關(guān)，但與腫瘤原發(fā)部位無關(guān)。ICOS有望成為結(jié)直腸癌預(yù)后的分子標(biāo)志物，相關(guān)信號通路在結(jié)直腸癌中的確切作用有待進一步研究。

(2018-09-29收稿；2019-01-01修回)