呂 強 李 靖 鐘 鳴 駱 洋 蔡曉燕&

上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院普外科1(200135) 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院胃腸外科2

背景：可誘導T細胞共刺激分子(ICOS)屬于B7-CD28免疫球蛋白家族，參與細胞增殖、分化以及免疫應答等多種生物學過程，其表達異常與腫瘤免疫逃逸密切相關。目的：探討ICOS在結直腸癌中的表達及其臨床意義。方法：收集32對新鮮結直腸癌組織和相應癌旁非癌組織，以及211例石蠟包埋結直腸癌組織，分別采用real-time PCR和免疫組化法檢測ICOS mRNA和蛋白表達，分析其表達與患者臨床病理特征和預后的相關性。結果：與非癌組織相比，ICOS在結直腸癌組織中呈低表達(P<0.05)，其表達與腫瘤大小、血清CEA水平、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期呈顯著負相關(P均<0.05)，與腫瘤發(fā)生部位無明顯相關性(P>0.05)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，結直腸癌患者ICOS表達水平越低，預后越差(P<0.05)。多因素Cox回歸分析顯示，ICOS表達水平是結直腸癌患者的臨床預后指標之一(HR=0.821, 95% CI: 0.588～0.912, P=0.034)。結論：ICOS低表達可能在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并與預后不良相關。ICOS有望成為結直腸癌預后的分子標志物。

結直腸癌(colorectal cancer)是我國最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，均位居所有惡性腫瘤的第五位[1]。近年來，盡管手術聯(lián)合放化療等綜合治療手段的廣泛應用提高了結直腸癌患者的生存率，但目前其總體生存率仍較低，多數患者確診時已是中晚期。因此，尋找結直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的關鍵分子靶點并對之進行有效調控以改善患者預后成為當前研究熱點。

B7-CD28免疫球蛋白家族是最廣泛的T細胞共刺激分子，其中的抑制性分子程序性死亡分子-1(PD-1)和細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(CTLA-4)是目前腫瘤研究中的亮點，針對這兩個靶分子的單克隆抗體藥物nivolumab和ipilimumab已在多種惡性腫瘤中顯示出良好的療效[2-3]。與此同時，B7-CD28家族中的激活性分子也日益受到重視?？烧T導T細胞共刺激分子(inducible T-cell co-stimulator, ICOS)是B7-CD28家族成員之一，與經典分子CD28同屬于激活性分子，可刺激抗原特異性T細胞反應，參與細胞增殖、分化以及免疫應答等多種生物學過程，其表達異常與腫瘤免疫逃逸密切相關[4-5]。本研究旨在探討ICOS在結直腸癌中的表達及其與腫瘤臨床病理特征和患者預后的相關性。

材料與方法

一、標本來源

用于real-time PCR的32對新鮮結直腸癌組織和相應癌旁非癌組織(距腫瘤邊緣>5 cm)來源于2018年1月—2018年12月浦東新區(qū)公利醫(yī)院普外科手術標本；用于免疫組化檢測的211例石蠟包埋結直腸癌組織來源于2005年1月—2015年12月浦東新區(qū)公利醫(yī)院普外科和上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院胃腸外科手術標本。上述患者術前均未接受新輔助化療或其他針對腫瘤的治療，所有標本均經組織病理學檢查確診。通過門診或電話隨訪獲取患者預后信息。

二、主要試劑

TRIzolTM試劑(InvitrogenTM, Thermo Fisher Sci-entific)；反轉錄試劑盒、real-time PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]；PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；ICOS兔單克隆抗體(Abcam plc.)；GAPDH抗體、HRP標記山羊抗兔IgG(Pro-teintech Group)。

三、方法

1. Real-time PCR：使用TRIzol試劑抽提組織總RNA，反轉錄合成cDNA，反轉錄條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。ICOS引物：F 5’-TGT CAG GGC ACA ATT CCC TC-3’, R 5’-ACC CCA CAC ACA GAA ACC TG-3’；內參GAPDH引物：F 5’-ACT CGT CAT ACT CCT GCT-3’, R 5’-GAA ACT ACC TTC AAC TCC-3’。PCR條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。2-ΔΔCT法計算mRNA相對表達量。實驗重復3次。

2. 免疫組化染色：組織石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，0.3% H2O2孵育15 min，微波修復15 min，自然冷卻后10%牛血清白蛋白封閉30 min，滴加經PBS稀釋的ICOS抗體(1∶300)，4 ℃過夜，HRP標記二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

ICOS陽性染色主要定位于腫瘤細胞和腫瘤間質細胞。光學顯微鏡下隨機觀察10個高倍視野，記錄1 000個腫瘤細胞的ICOS陽性細胞百分比，結合染色強度進行半定量評分[6]。陽性細胞百分比評分：1%～25%，1分；25%～50%，2分；>50%，3分。染色強度評分：弱(淡黃色)，1分；中(棕黃色)，2分；強(棕褐色)，3分?？偡譃閮身椩u分之積：1～3分為低表達，≥4分為高表達。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、ICOS mRNA表達

以real-time PCR檢測32對結直腸癌組織和相應癌旁組織中的ICOS mRNA表達，結果顯示癌組織ICOS mRNA表達水平明顯低于相應癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1A)。按腫瘤大小以及有無淋巴結轉移和遠處轉移進行分層分析，腫瘤>5 cm(圖1B)、有淋巴結轉移(圖1C)和有遠處轉移(圖1D)的結直腸癌患者癌組織中ICOS mRNA表達水平相對較低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上述結果表明，ICOS mRNA在結直腸癌組織中呈低表達，并可能影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展。

二、ICOS蛋白表達

為明確ICOS在結直腸癌組織中的表達和定位，進一步對211例結直腸癌組織進行ICOS免疫組化染色，結果顯示癌組織ICOS蛋白高表達率為52.1%(110/211)，光學顯微鏡下可見腫瘤細胞、腫瘤間質細胞的細胞膜和(或)細胞質出現淡黃色至棕褐色顆粒；值得注意的是，TNM Ⅳ期結直腸癌患者癌組織中ICOS蛋白幾乎不表達或為低表達(圖2)。上述結果表明，ICOS蛋白在結直腸癌組織中呈低表達，TNM分期越晚，其表達越低。

三、ICOS表達與結直腸癌臨床病理特征的相關性

根據免疫組化評分結果將211例結直腸癌組織分為ICOS 低表達組(n=101)和ICOS高表達組(n=110)，χ2檢驗顯示ICOS蛋白表達與腫瘤大小、血清CEA水平和TNM分期顯著相關(P<0.05)，與患者性別、年齡和腫瘤部位無明顯相關性(P>0.05)(表1)。

四、ICOS表達與結直腸癌預后的關系

為驗證ICOS表達對結直腸癌預后的影響，采用Kaplan-Meier生存曲線和log-rank檢驗對ICOS低表達與高表達結直腸癌患者進行生存分析，結果表明ICOS表達水平與患者預后呈顯著正相關，表達水平越低，預后越差(P<0.05)(圖3)。

單因素Cox比例風險模型分析顯示，腫瘤組織ICOS表達水平、腫瘤大小、TNM分期為結直腸癌預后的預測指標(P<0.05)；將單因素分析中有統(tǒng)計學意義的變量進一步納入多因素分析，結果顯示腫瘤組織ICOS表達水平是影響結直腸癌患者臨床預后的指標之一(HR=0.821, 95% CI: 0.588～0.912,P=0.034)(表2)。

討 論

盡管ICOS與經典分子CD28同屬于激活性T細胞共刺激分子，但兩者存在很大差異。CD28常規(guī)表達于T細胞表面，主要為T細胞激活提供必需的共刺激活化信號；而ICOS則只表達于活化T細胞或腫瘤細胞表面，其信號通路可促進不同類型的T細胞分泌白細胞介素-10(IL-10)、IL-4、IL-5、干擾素-γ(IFN-γ)、IL-17等細胞因子[4，6-7]。研究顯示ICOS在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有雙重作用，其既可參與抗腫瘤T細胞免疫應答，又可通過調節(jié)性T細胞的免疫抑制活性發(fā)揮促腫瘤效應[8]。因此，ICOS被視為抗腫瘤治療的潛在靶點。既往研究發(fā)現ICOS在胃癌、乳腺癌、腎細胞癌、肝細胞癌等多種惡性腫瘤組織中表達異常，且其表達水平與患者預后有關[9-13]。

A：結直腸癌組織與相應癌旁組織ICOS mRNA表達比較；B、C、D、腫瘤>5 cm、有淋巴結轉移和遠處轉移結直腸癌患者癌組織中ICOS mRNA表達水平相對較低

圖1ICOS mRNA在32對結直腸癌組織和相應癌旁組織中的表達情況

圖2 結直腸癌組織ICOS蛋白表達情況(免疫組化染色，×20)

表1 ICOS表達與結直腸癌臨床病理特征的相關性n(%)

圖3 ICOS低表達與高表達結直腸癌患者生存分析

本研究采用real-time PCR和免疫組化染色檢測ICOS在結直腸癌組織及其相應癌旁組織中的表達，以探討ICOS在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其與患者預后的關系。結果顯示ICOS mRNA和蛋白在結直腸癌組織中均呈低表達，其表達水平與腫瘤大小、血清CEA水平、淋巴結轉移和遠處轉移以及TNM分期呈顯著負相關，與患者預后呈顯著正相關。Cox比例風險模型分析證實ICOS表達水平是影響結直腸癌患者臨床預后的因素之一。推測在結直腸癌中，ICOS低表達可能參與了腫瘤細胞的免疫逃逸，從而促進腫瘤細胞遷移和侵襲。腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力與腫瘤復發(fā)和轉移密切相關，進而影響患者預后。

近年來越來越多的研究表明左半結腸癌與右半結腸癌在分子特征、癌變途徑等方面存在明顯差異，如正常右半結腸上皮細胞的人類錯配修復基因(hMLH1)啟動子甲基化水平和O-6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(MGMT)表達明顯高于左半結腸；右半結腸癌與BRAF基因突變顯著相關，其發(fā)生更多經由鋸齒狀腺瘤-癌途徑，而左半結腸癌的發(fā)生常為傳統(tǒng)腺瘤-癌途徑[14-17]。本研究中ICOS在左半結腸癌與右半結腸癌組織中的表達并無明顯差異，表明其低表達在結直腸癌中的作用無位置特異性。原發(fā)部位不同的結直腸癌，預后也有較大差異。對于中晚期患者，左半結腸癌的復發(fā)后存活率明顯優(yōu)于右半結腸癌[15]，但本研究預后因素分析顯示腫瘤部位并非結直腸癌的預后影響因素，可能與本研究入組患者例數較少有關，有待后續(xù)收集更多結直腸癌組織樣本做進一步分析。

表2 結直腸癌預后相關因素分析(Cox比例風險模型)

綜上所述，ICOS低表達可能在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其表達水平與結直腸癌臨床分期和患者預后密切相關，但與腫瘤原發(fā)部位無關。ICOS有望成為結直腸癌預后的分子標志物，相關信號通路在結直腸癌中的確切作用有待進一步研究。

(2018-09-29收稿；2019-01-01修回)