張曉莉 鄭松柏 李小雯

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院消化科(200040)

背景：肝臟儲(chǔ)備功能隨增齡而逐漸下降，老年人肝組織形態(tài)學(xué)存在明顯退變，肝損傷發(fā)生率和死亡率明顯高于青年人。目的：探討老年比格犬肝臟分子生物學(xué)變化及其意義。方法：將15只健康比格犬分為中青年組和老年組。采用ELISA法測(cè)定肝組織Bcl-2、Bax、TE、GSK-3、caspase-9、HA、LN、PCⅢ、ColⅣ以及CYP1A2含量，生化法測(cè)定GSH-Px含量；熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)肝組織PDGF-B、TGF-β1、TGF-β3 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)。結(jié)果：與中青年組比較，老年組肝細(xì)胞再生相關(guān)分子Bcl-2、Bax、TE、caspase-9含量均顯著增加(P<0.05)，GSK-3含量顯著降低(P=0.013)；肝氧化應(yīng)激相關(guān)分子GSH-Px活性顯著降低(P=0.012)；肝藥物代謝酶CYP1A2含量顯著降低(P=0.006)；肝纖維化指標(biāo)LN、PCⅢ含量明顯增加(P<0.05)，而兩組HA、ColⅣ含量無(wú)明顯差異。老年組肝纖維化相關(guān)分子PDGF-B、TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于中青年組(P<0.05)；TGF-β3 mRNA表達(dá)亦明顯增加(P=0.035)，而蛋白表達(dá)顯著降低(P=0.004)。結(jié)論：老年肝組織內(nèi)發(fā)生了一系列分子生物學(xué)變化，這些變化是肝組織形態(tài)學(xué)變化的基礎(chǔ)，其潛在的臨床價(jià)值有待進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)。

了解肝臟老化的特點(diǎn)和規(guī)律及其機(jī)制對(duì)深入研究老年人肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制、臨床特點(diǎn)并采取有效防治措施具有重要意義。杜杰[1]通過(guò)L-[1-13C]-苯丙氨酸呼氣試驗(yàn)對(duì)老年人肝臟儲(chǔ)備功能進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，70歲后開(kāi)始出現(xiàn)可觀察到的肝臟儲(chǔ)備功能衰退。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)老年肝臟組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)存在明顯退變[2]。對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物肝臟增齡過(guò)程中某些生物學(xué)變化的分析，可能部分揭示了上述退化的特點(diǎn)，但總體研究仍不多。本研究通過(guò)對(duì)老年比格犬肝臟分子生物學(xué)變化(包括肝細(xì)胞再生相關(guān)分子、氧化應(yīng)激相關(guān)分子、肝藥物代謝酶、肝纖維化指標(biāo)及其相關(guān)因子的變化等)進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究肝臟老化的內(nèi)在機(jī)制提供線索。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

15只國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用健康比格犬，年齡1.5～10.6歲，飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所。依據(jù)http://www.maxiebeagle.com/dogage.htm上對(duì)比格犬年齡的研究，將其分為老年組和中青年組，其中老年組7只，平均年齡(8.26±1.52)歲，中青年組8只，平均年齡(2.21±0.94)歲。

二、 方法

1. 組織收集：實(shí)驗(yàn)犬禁食、禁飲12 h后麻醉，自腹中線逐層解剖，露出肝臟，觀察肝臟外觀正常后在肝右葉、距肝邊緣3～5 cm處取大小約1 cm×1 cm的組織2塊。液氮冰凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. ELISA法：采用ELISA測(cè)定Bcl-2、Bax、端粒酶(TE)、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、caspase-9、透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原蛋白 (PCⅢ)、Ⅳ型膠原蛋白(ColⅣ)、CYP1A2含量，具體步驟參照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)操作。

3. 熒光定量PCR法檢測(cè)血小板衍生生長(zhǎng)因子-B(PDGF-B)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、TGF-β3 mRNA表達(dá)：以Trizol(Invitrogen公司)提取肝臟組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，行熒光定量PCR。擴(kuò)增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成(表1)。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)；結(jié)束后即刻進(jìn)行溶解曲線分析。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因mRNA表達(dá)。

4. 蛋白質(zhì)印跡法：參照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)肝組織內(nèi)PDGF-B(兔多克隆抗體，以1∶200的比例稀釋)、TGF-β1(山羊多克隆抗體，以1∶200的比例稀釋)、TGF-β3(小鼠單克隆抗體，以1∶200的比例稀釋)表達(dá)。以β-actin(兔單克隆抗體，以1∶1 000的比例稀釋)作為內(nèi)參，蛋白表達(dá)量=各處理組蛋白條帶的光密度值/內(nèi)參蛋白條帶光密度值。

5. 其他指標(biāo)：采用生化法測(cè)定谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 PDGF-B、TGF-β1、TGF-β3的PCR引物序列

結(jié) 果

一、肝細(xì)胞再生相關(guān)分子

與中青年組相比，老年組Bcl-2、Bax、TE和caspase-9含量均顯著增加(P<0.05)，GSK-3含量顯著降低(P<0.05)，而兩組Bax/Bcl-2比值無(wú)明顯差異(表2)。

二、肝氧化應(yīng)激相關(guān)分子

老年組GSH-Px活性顯著低于中青年組[(16.92±1.02) U/mg蛋白對(duì)(18.73±1.33) U/mg蛋白；t=2.929，P=0.012]。

三、肝藥物代謝酶

老年組CYP1A2含量顯著低于中青年組[(3.54±0.23) ng/mL對(duì)(3.95±0.25) ng/mL；t=3.239，P=0.006]。

四、肝纖維化指標(biāo)

老年組LN和PCⅢ含量顯著高于中青年組(P<0.05)，而兩組HA、ColⅣ含量無(wú)明顯差異(P>0.05)(表3)。

五、肝纖維化相關(guān)分子

老年組PDGF-B、TGF-β1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于中青年組(P<0.05)；TGF-β3 mRNA表達(dá)亦明顯增加(P<0.05)，而蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)(表4、圖1)。

討 論

肝臟有強(qiáng)大的再生能力[3]，但老年肝細(xì)胞的再生能力下降，肝細(xì)胞數(shù)目減少[4]。Bcl-2和Bax同屬一個(gè)家族，是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)分子，Bcl-2可維持線粒體膜的完整性并阻止細(xì)胞凋亡，為凋亡抑制基因；Bax的功能則相反，可增加線粒體膜通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放至胞質(zhì)，促發(fā)caspase-9等一系列分子的瀑布式激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為凋亡促進(jìn)基因[5]。TE是使端粒延伸的反轉(zhuǎn)錄DNA合成酶，其活性可反映細(xì)胞增殖狀態(tài)，TE缺失致細(xì)胞衰老并驅(qū)動(dòng)肝脂肪變性[6-7]。GSK-3是一種多功能蛋白激酶，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白、Nrf-2核內(nèi)轉(zhuǎn)移等促進(jìn)細(xì)胞增殖分子以及抗氧化酶的表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖并減少細(xì)胞應(yīng)激損傷[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與中青年組相比，老年比格犬肝組織內(nèi)Bax、caspase-9含量顯著增加，GSK-3顯著降低，表明老年肝細(xì)胞凋亡增加，而增殖受到抑制；但肝組織內(nèi)Bcl-2、TE含量增加，表明老年肝細(xì)胞凋亡仍受到一定抑制且有一定的增殖能力。因此，老年肝細(xì)胞的再生能力下降、肝細(xì)胞數(shù)目減少可能是老年肝細(xì)胞凋亡、增殖及其強(qiáng)弱程度等多方面因素共同作用的結(jié)果，有關(guān)機(jī)制需進(jìn)一步研究。

1 Da=0.992 1 u

有實(shí)驗(yàn)表明，同等外來(lái)刺激下，老年大鼠肝細(xì)胞損傷較年輕者明顯加重[11]。GSH-Px是肝臟重要的過(guò)氧化物分解酶，亦是抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)主要成分之一，對(duì)肝臟損傷有重要的保護(hù)作用[12]。本研究結(jié)果顯示老年比格犬肝細(xì)胞GSH-Px活性較中青年組明顯減少, 提示老年肝臟抗氧化應(yīng)激能力下降。

CYP450主要存在于肝臟，主要作用為催化藥物等外源性物質(zhì)的代謝。有研究報(bào)道，諸多CYP亞型含量和活性隨增齡而降低，藥物轉(zhuǎn)出體減少、代謝率降低[13-14]，引起肝損傷[12]。CYP1A2是肝藥物代謝酶的常見(jiàn)亞型，對(duì)多種常用藥物具有代謝轉(zhuǎn)化作用。本研究發(fā)現(xiàn)老年比格犬CYP1A2含量較中青年組明顯下降。肝藥物代謝酶含量和活性降低是老年人藥物性肝損傷高發(fā)的重要原因之一[15]。

形態(tài)學(xué)研究證實(shí)，肝細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)隨著增齡而增加[2]。本研究發(fā)現(xiàn)，老年比格犬肝纖維化指標(biāo)LN、PCⅢ顯著高于中青年組，說(shuō)明老年比格犬ECM沉積增多。ECM主要由活化的肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，其最重要的刺激分子為PDGF-B和TGF-β1，而TGF-β3與TGF-β1相互拮抗，可抑制ECM分泌[16]。本研究熒光定量PCR結(jié)果顯示，老年比格犬肝組織PDGF-B、TGF-β1 mRNA表達(dá)較中青年組增加10余倍，同時(shí)TGF-β3 mRNA表達(dá)亦較中青年組增加10余倍。進(jìn)一步行蛋白質(zhì)印跡法發(fā)現(xiàn)，老年比格犬肝組織PDGF-B、TGF-β1蛋白表達(dá)較中青年組顯著增加，而TGF-β3 蛋白表達(dá)顯著降低，導(dǎo)致老年肝臟ECM增加。TGF-β3 mRNA表達(dá)增加，可能是器官老化過(guò)程常見(jiàn)的一種“退化-代償”(degeneration-compensation)現(xiàn)象[17]。

表2 中青年組與老年組肝細(xì)胞再生相關(guān)分子比較

表4 中青年組與老年組肝纖維化相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)比較

表3 中青年組與老年組肝纖維化指標(biāo)比較

總之，肝臟儲(chǔ)備功能決定了其對(duì)各種藥物代謝、疾病發(fā)生和應(yīng)激反應(yīng)的最終臨床表現(xiàn)。研究指出，老年人肝臟衰老雖較其他器官相對(duì)緩慢，但其儲(chǔ)備功能隨增齡而下降，尤以高齡老人(>80歲)更為明顯[1]。有研究認(rèn)為，高齡是肝臟術(shù)后發(fā)生并發(fā)癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[18]。老年人肝臟對(duì)藥物、應(yīng)激的耐受力較中年人明顯下降，藥物性肝損、應(yīng)激后暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)生率、死亡率明顯升高，對(duì)老年人生活質(zhì)量、醫(yī)療資源均造成了極大負(fù)擔(dān)，故急需尋找老年人肝臟老化的特點(diǎn)以及干預(yù)靶點(diǎn)，以降低各種原因所致肝衰竭的發(fā)生率和死亡率。本研究通過(guò)對(duì)老年比格犬肝組織內(nèi)多種生物活性因子變化的觀察，為肝臟老化的某些形態(tài)學(xué)變化和臨床現(xiàn)象找到了分子生物學(xué)依據(jù)，但本研究還得出了一些看似矛盾的結(jié)果；深入研究這些變化的內(nèi)在機(jī)制，尤其是其上游通路和關(guān)鍵靶點(diǎn)，并進(jìn)行干預(yù)，將對(duì)延緩肝臟衰老、提高老年人肝病防治水平具有重要意義。