余怡，王家雄，馬勇，許偉偉，王瑋，李紅，楊慎敏

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心，蘇州 215002)

嚴(yán)重弱精子癥除環(huán)境、生活方式等特異性因素外[1]，與精子尾部超微結(jié)構(gòu)異常有關(guān)，而這些超微結(jié)構(gòu)的異常往往提示患者自身存在著遺傳缺陷，如原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙(primary ciliary dyskinesia，PCD)、精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常(multiple morphological abnormalities of the sperm flagella，MMAF)、成人型多囊腎(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)等。其中PCD與ADPKD患者的遺傳缺陷不僅影響了精子質(zhì)量與男性生育力，更關(guān)鍵的是這些缺陷對(duì)其他臟器的嚴(yán)重不良影響。PCD患者常伴有慢性呼吸道癥狀，而ADPKD患者雙側(cè)腎臟出現(xiàn)廣泛的囊性改變。MMAF患者表型與PCD類似，其精子在光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)尾部短而粗、僵直等特征，早年間學(xué)者將其稱為“短尾”(short tail)、“殘段尾”(stump tail)或纖維鞘發(fā)育不良(dysplasia of the fibrous sheath，DFS)[2-3]，MMAF患者遺傳缺陷的研究較PCD與ADPKD少。本課題組曾報(bào)道Cfap43基因缺陷的MMAF[4]，而近來(lái)也有MMAF新致病突變基因的報(bào)道[5]。本研究通過(guò)構(gòu)建Cfap43缺陷的小鼠，對(duì)其精子表型以及生殖系統(tǒng)及非生殖系統(tǒng)的臟器進(jìn)行了組織病理檢查，旨在探討Cfap43在弱精子癥發(fā)生發(fā)展中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與儀器試劑

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8周齡C57BL/6品系雄性小鼠(野生型)3只(購(gòu)自蘇州昭衍新藥研究中心有限公司，SPF級(jí))。

2.主要試劑儀器：引物(南京金思瑞)；核酸提取試劑盒(BIMAKER，美國(guó))；胚胎緩沖液(GMOPS，Vitrolife，瑞典)；2.5%戊二醛電鏡固定液(Life Science，美國(guó))；Boin固定液(Life Science，美國(guó))；環(huán)氧樹脂Epon 812(SPI，美國(guó))；PCR儀(Biometra Tadvanced 96，德國(guó))；Sanger測(cè)序儀(ABI 3500，美國(guó))；光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E100，日本)；透射電鏡(TECNAI 10，Philips，荷蘭)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.基因敲除小鼠構(gòu)建：參照本課題組之前的方法[4]，使用CRISPR/Cas9技術(shù)生成了Cfap43敲除小鼠。

2.基因型鑒定：8周齡小鼠剪尾，使用核酸提取試劑盒提取鼠尾DNA，參照試劑盒說(shuō)明書，配置20 μl體系后行PCR。引物序列：F：5’-TCCTTTCTTTTTTGATGGCTCTAGC-3’；R：5’-TTCTATCTTCATGGGCTTCTTTGCT-3’。反應(yīng)產(chǎn)物行Sanger測(cè)序后，使用FINCHTV軟件與NCBI網(wǎng)站分析測(cè)序結(jié)果。

3.精子形態(tài)檢測(cè)：胚胎緩沖液37℃預(yù)熱，將Cfap43(-/-)小鼠與WT小鼠解剖取出附睪剪碎置入EP管，加1 ml預(yù)熱的緩沖液，37℃水浴10 min，使精子游離，鑷子夾去附睪組織，400g離心15 min，棄上清，加入PBS洗滌，離心沉淀進(jìn)行精子涂片，剩余沉淀加入2.5%戊二醛固定過(guò)夜，PBS緩沖液沖洗2次，每次15 min，之后經(jīng)過(guò)1%鋨酸后固定1 h，再經(jīng)過(guò)PBS緩沖液沖洗2次，每次15 min，2%醋酸鈾染色，乙醇逐級(jí)脫水，100%丙酮置換，用環(huán)氧樹脂Epon 812包埋，切片機(jī)超薄切片，醋酸鈾與檸檬酸鉛雙重染色，最后在透射電鏡下觀察精子尾部超微結(jié)構(gòu)。

4.組織病理學(xué)檢測(cè)：解剖Cfap43(-/-)小鼠與WT 小鼠，取肝、脾、肺、腎、腦、小腸，4%多聚甲醛固定過(guò)夜，睪丸、附睪用Bouin固定液固定過(guò)夜。經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，比較病理學(xué)差異。腎、小腸的電鏡檢測(cè)過(guò)程同上述精子的電鏡檢測(cè)過(guò)程。

結(jié) 果

一、小鼠基因型鑒定

按照人類的表型，我們通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了Cfap43基因第20號(hào)外顯子上的一個(gè)2 bp的刪除，從而導(dǎo)致移碼突變并終止了Cfap43 的轉(zhuǎn)錄，Sanger測(cè)序?qū)π∈蠡蛐丸b定，與構(gòu)建模型吻合(圖1)。

A：在Cfap43上構(gòu)建了2 bp的刪除(紅色)；B：2 bp的刪除造成的移碼突變直接導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄的提前終止，cDNA中的終止子用*表示；C：Sanger測(cè)序鑒定小鼠基因型，與構(gòu)建方案吻合，2 bp缺失的位置如方框所示圖1 Cfap43缺陷小鼠構(gòu)建和鑒定

圖2 兩組小鼠精子形態(tài)學(xué)結(jié)果(HE染色，×40)

二、兩組小鼠的精子形態(tài)

WT小鼠精子的頭部呈鐮刀狀，鞭毛較長(zhǎng)。與WT小鼠相比，Cfap43基因缺陷小鼠精子尾部則出現(xiàn)短、粗、卷曲甚至缺失等異常(圖2)。透射電鏡下觀察，兩組小鼠精子頭部差異不明顯，但尾部超微結(jié)構(gòu)顯示：WT小鼠精子纖維鞘排列整齊，內(nèi)部中央微管與外周微管呈現(xiàn)經(jīng)典的“9+2”結(jié)構(gòu)；而Cfap43(-/-)小鼠，精子尾部出現(xiàn)程度不一的結(jié)構(gòu)紊亂，如纖維鞘的增厚，纖維鞘、外周致密纖維、微管的排列異常與數(shù)目異常等(圖3)。

三、兩組小鼠各組織病理學(xué)特征

生殖系統(tǒng)方面，WT小鼠與Cfap43(-/-)小鼠附睪內(nèi)的精子數(shù)無(wú)明顯差異。WT小鼠附睪內(nèi)精子發(fā)育成熟，有明顯的正常尾部鞭毛(圖4A)，而Cfap43(-/-)小鼠附睪內(nèi)成熟精子較少，且精子尾部出現(xiàn)粗、短等明顯的MMAF表型(圖4C)；睪丸內(nèi)，WT小鼠睪丸的各級(jí)生精細(xì)胞排布整齊，有較多正常的長(zhǎng)形精子(圖4B)，而Cfap43(-/-)小鼠生精細(xì)胞精子鞭毛發(fā)育異常，未見正常的長(zhǎng)形精子，但精子頭部的變形和濃縮未見明顯異常，可見正常殘余體(residual body，RB)的存在(圖4D)。

Cfap43(-/-)小鼠的肝臟組織與WT組相比無(wú)明顯差異，肝小葉完整，中央靜脈存在，肝內(nèi)膽管未見明顯擴(kuò)張，肝細(xì)胞未見明顯充血、水腫，肝臟未見纖維化；Cfap43(-/-)小鼠的脾臟組織白髓與紅髓結(jié)構(gòu)正常，小梁間血管排列緊密，與WT組相比無(wú)明顯差異；Cfap43(-/-)小鼠的肺臟組織，鏡下可見各級(jí)支氣管、肺泡管、肺泡及肺泡囊結(jié)構(gòu)整齊，肺泡內(nèi)未見明顯滲出，肺間質(zhì)未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，與WT組相比無(wú)明顯差異；Cfap43(-/-)小鼠的腎臟組織腎小體與腎小管結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，未見明顯充血、水腫、纖維化，與WT組相比無(wú)明顯差異；Cfap43(-/-)小鼠的大腦皮質(zhì)與海馬體排列結(jié)構(gòu)正常，未見明顯神經(jīng)細(xì)胞萎縮等異?，F(xiàn)象，與WT組相比無(wú)明顯差異；Cfap43(-/-)小鼠的小腸組織的各層結(jié)構(gòu)排列整齊，腺體無(wú)明顯萎縮，管腔見較多的環(huán)形皺襞與絨毛，與WT組相比無(wú)明顯差異(圖5)。

圖3 兩組小鼠精子的透射電鏡圖

★示附睪內(nèi)正常鞭毛精子；▲示附睪內(nèi)MMAF表型；示正常長(zhǎng)形精子；→示睪丸生精細(xì)胞鞭毛異常；?示精子頭部變形和濃縮；示正常殘余體圖4 小鼠睪丸與附睪病理圖片(HE染色，附睪×50；睪丸×80)

透射電鏡下觀察，兩組小鼠的小腸腸腔表面均分布有緊密排列的正常微絨毛結(jié)構(gòu)，兩者對(duì)比未見明顯差異。兩組小鼠的腎小管(近曲小管)有著緊密排列的的微絨毛，兩者對(duì)比亦未見明顯差異(圖6)。

A：肝、肺、腎組織(HE染色，×20).B：腦組織(HE染色，×5)及脾、小腸組織(HE染色，×10)圖5 兩組小鼠各組織切片病理結(jié)果

圖6 兩組小鼠部分非生殖器官的電鏡圖

討 論

纖毛/鞭毛組織在人體內(nèi)廣泛分布于聽覺(jué)器官、視覺(jué)器官、呼吸道上皮、肝臟、腎臟、輸卵管、睪丸組織等，其在各組織內(nèi)的作用有所不同[6]。哺乳動(dòng)物通過(guò)纖毛運(yùn)輸來(lái)實(shí)現(xiàn)視覺(jué)色素的更新，因此纖毛組織的受損會(huì)影響視覺(jué)功能。氣管與支氣管上皮細(xì)胞表面存在著許多纖毛柱狀上皮，這些纖毛規(guī)律地?cái)[動(dòng)能夠及時(shí)清除異物組織及粘液[7]。肝臟、腎臟等部分實(shí)質(zhì)器官中，纖毛組織能夠起到調(diào)控液體流動(dòng)的作用，當(dāng)相關(guān)基因突變時(shí)，纖毛的這種調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)紊亂，引發(fā)器官的囊性病變[8]。在輸卵管中，纖毛組織在性激素的調(diào)控下，周期性地發(fā)生擺動(dòng)，加速卵子或受精卵的移動(dòng)。在睪丸組織內(nèi)，鞭毛作為精子的重要組成，是精子運(yùn)動(dòng)不可缺少的部分，任何影響精子鞭毛結(jié)構(gòu)的基因突變，均可引起精子活動(dòng)力的下降甚至導(dǎo)致精子不活動(dòng)[9]。

MMAF是一類鞭毛發(fā)育異常引起的功能性疾病，主要表現(xiàn)為精子尾部的粗、短、卷曲等形態(tài)異常，電子顯微鏡下觀察，整個(gè)精子鞭毛組裝均出現(xiàn)異常[10]，包括纖維鞘、線粒體鞘的發(fā)育不良，微管的缺失與排列異常，外周致密纖維的數(shù)目與排列異常等[11]。本課題組通過(guò)全外顯子組測(cè)序的方法鑒定出中國(guó)MMAF患者的疾病相關(guān)基因Dnah1、Ccdc39、Cfap43、Cfap44和Cfap65[4]。此后在國(guó)際上報(bào)道了Cfap43導(dǎo)致的MMAF新病例。據(jù)目前文獻(xiàn)來(lái)看，Cfap43是除DNAH1之外MMAF最為常見的致病基因，而Cfap43的功能尚不完全明確。Coutton等[12]對(duì)MMAF的研究中發(fā)現(xiàn)，Dnah1、Cfap43、Cfap44基因突變的病例占到其病例總數(shù)的28.2%，這也提示深入研究這三種基因的潛在功能對(duì)于更好地理解MMAF的發(fā)病有重要的作用。近年來(lái)MMAF受到了學(xué)者們的關(guān)注，近期又報(bào)道了MMAF的新致病基因Cfap69[5]以及最新報(bào)道的Cfap251[13-14]。這些研究均著眼于目的基因?qū)颖廾挠绊?，涉及?duì)其他臟器的潛在威脅。本研究發(fā)現(xiàn)，Cfap43缺陷的小鼠其精子出現(xiàn)典型的MMAF表型，其睪丸病理提示生精功能存在異常，但是其他臟器的組織病理無(wú)顯著異常。有研究發(fā)現(xiàn)，Cfap43基因高表達(dá)于成年小鼠睪丸中[15]，其他組織相對(duì)較少或不表達(dá)，這或許可以解釋Cfap43缺陷導(dǎo)致的MMAF并不一定會(huì)伴隨著其他臟器的疾病。

CFAP43蛋白首次在牛精子中心粒被鑒定[16]，之后發(fā)現(xiàn)在人類精子也存在CFAP43蛋白[17]。CFAP蛋白是一類纖毛中高度保守的蛋白，其結(jié)構(gòu)中富含WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域，而這種結(jié)構(gòu)域在精子鞭毛內(nèi)運(yùn)輸(intraflagellar transport，IFT)蛋白中高度富集[18]，提示其在精子鞭毛形成過(guò)程中的重要作用[19]。IFT蛋白將位于胞質(zhì)合成的重要蛋白運(yùn)送到軸絲部位，參與動(dòng)力蛋白臂的合成，其在精子鞭毛發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用。CCDC39基因突變引起纖毛內(nèi)側(cè)動(dòng)力蛋白臂的缺失，文獻(xiàn)報(bào)道該基因與PCD有較大關(guān)聯(lián)[20]。據(jù)統(tǒng)計(jì)。PCD男性病例中，約有76%病例同時(shí)表現(xiàn)為弱精子癥[13]，而這部分患者中精子形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為MMAF的比例并不清楚。

本研究中，我們僅對(duì)部分實(shí)質(zhì)器官進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究。除睪丸與附睪組織外，其他臟器組織并未發(fā)現(xiàn)有明顯的異常。CFAP43在肺組織中有一定的表達(dá)[15]，而肺的各級(jí)支氣管的表面分布著呈柱狀的纖毛組織，擺動(dòng)的纖毛負(fù)責(zé)清除粘液與異物組織[7，21]。CFAP43作為一種結(jié)構(gòu)蛋白，其在精子鞭毛形成中主要影響內(nèi)側(cè)動(dòng)力蛋白臂的正常結(jié)構(gòu)形成[12]，但其是否影響其他運(yùn)動(dòng)纖毛(呼吸道、支氣管粘膜表面的運(yùn)動(dòng)纖毛)的正常結(jié)構(gòu)與功能目前尚無(wú)研究。腎臟上皮細(xì)胞電鏡下存在著初級(jí)纖毛，與運(yùn)動(dòng)纖毛不同的是，初級(jí)纖毛主要起到維持細(xì)胞形態(tài)與組織完整的作用[22]，ADPKD的發(fā)生正是由于初級(jí)纖毛上的多囊蛋白(polycystin-1、2，PC-1、2)突變引起，CFAP43蛋白是否參與腎臟上皮細(xì)胞的初級(jí)纖毛結(jié)構(gòu)組成，以及該蛋白突變后能否引起纖毛信號(hào)通路(cilia-dependent cyst activation，CDCA)的激活或抑制進(jìn)而引起腎臟的囊性病理改變[8]，目前尚無(wú)充分研究解釋這些猜想。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果暫未發(fā)現(xiàn)Cfap43敲除小鼠腎臟組織病理表現(xiàn)為典型的多囊腎，后期需要更多的探索來(lái)解開這些疑問(wèn)。

總結(jié)與展望：Cfap43缺陷導(dǎo)致精子尾部畸形，但是含纖毛的組織(肺、腎、腦)和不包含纖毛的組織(肝、脾)病理上未發(fā)現(xiàn)明顯影響。纖毛組織在不同的物種間具有高度的保守性，但在同一物種內(nèi)，其在各器官內(nèi)的分化機(jī)制卻不相同。CFAP43作為一種纖毛與鞭毛的結(jié)構(gòu)蛋白，其在小鼠的各器官中表達(dá)含量不盡相同，當(dāng)Cfap43缺陷時(shí)，各器官尤其是含有纖毛組織的器官病變也存在較大的差異。纖毛組織在生物體內(nèi)除了起到運(yùn)動(dòng)功能外，其還參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程，而各組織細(xì)胞間存在著部分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的差異性，導(dǎo)致后期的生物學(xué)事件也不相同，這可能與上述器官病變的差異性有關(guān)。未來(lái)需要更多的研究去解釋這些現(xiàn)象。