蔣益群，李東，王珊珊，陳林君，史建彬，張寧媛

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京 210008)

輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用提高了多胎妊娠率以及相關(guān)的孕產(chǎn)婦和新生兒并發(fā)癥發(fā)生率，包括高血壓、糖尿病、出血、貧血、絨毛膜羊膜炎、泌尿生殖系統(tǒng)感染、早產(chǎn)和低出生體重[1-2]。選擇性單胚胎移植可使多胎妊娠率最小化，而囊胚越過(guò)了胚胎基因組激活階段，可淘汰部分非整倍體胚胎，有助于胚胎挑選[3-4]。基于此,單囊胚移植技術(shù)已被大多數(shù)生殖中心廣泛應(yīng)用，通過(guò)選擇最具活力的胚胎來(lái)提高妊娠率，降低多胎率。

關(guān)于囊胚形態(tài)參數(shù)與妊娠結(jié)局的相關(guān)性，結(jié)論不一。有的研究認(rèn)為滋養(yǎng)層等級(jí)最能預(yù)測(cè)新鮮或凍融周期的單囊胚移植的妊娠成功[5-6]，而另一些研究則認(rèn)為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)等級(jí)是成功胚胎植入和活產(chǎn)的有力預(yù)測(cè)因子[7-8]，還有的研究建議評(píng)估囊胚腔的擴(kuò)張程度以預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局[9-10]。本研究考慮到囊胚滋養(yǎng)層(TE)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的高度動(dòng)態(tài)性、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)準(zhǔn)確觀察的困難性以及它們之間存在相互影響、相互促進(jìn)的關(guān)系，我們?cè)O(shè)計(jì)了這項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究，評(píng)估在單囊胚凍融周期中囊胚整體質(zhì)量與妊娠結(jié)局以及新生兒結(jié)局之間的相關(guān)性。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2016～2017年在本中心進(jìn)行單囊胚凍融移植患者的臨床資料。

納入/排除標(biāo)準(zhǔn)：新鮮周期促排方案為常規(guī)長(zhǎng)方案患者；女方年齡≤38周歲；移植日子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm；體重指數(shù)(BMI)18～25 kg/m2；排除供精、供卵及PGD/PGS周期病例。

共納入984例患者。根據(jù)囊胚整體質(zhì)量分為3組：A組為高質(zhì)量囊胚(n=259)，B組為中等質(zhì)量囊胚(n=400)，C組為低質(zhì)量囊胚(n=325)。同時(shí)根據(jù)滋養(yǎng)層外是否存在碎片或卵裂球?qū)組患者進(jìn)一步分組：C1組為不存在碎片或卵裂球(n=197)，C2組為存在碎片或卵裂球(n=128)。

二、囊胚培養(yǎng)與評(píng)分

常規(guī)促排卵及常規(guī)體外受精[11-12]后第3天，將移植冷凍后剩余胚胎轉(zhuǎn)至囊胚培養(yǎng)液 G2(Vitrolife，瑞典)進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。第5、6天(D5、D6)觀察胚胎，按照Gardner評(píng)分體系[13]對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)分。本中心的冷凍標(biāo)準(zhǔn)為3BC和3CB及以上級(jí)別的囊胚。

本研究將高質(zhì)量囊胚定義為：(3～6)AA、AB、BA；中等質(zhì)量囊胚定義為：(3～6)BB、AC、CA；低質(zhì)量囊胚定義為(3～6)CB、BC。

三、囊胚冷凍與復(fù)蘇

對(duì)囊胚進(jìn)行激光皺縮，然后將囊胚放入平衡液(ES)中平衡10～15 min，轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液(VS)(KITAZATO，日本)中平衡30～60 s，轉(zhuǎn)移至冷凍載桿(Cryotop)上，然后浸入液氮。在移植當(dāng)天進(jìn)行囊胚復(fù)蘇，分四步，將待復(fù)蘇囊胚依次置于復(fù)蘇液(TS、DS、WS、WS)(KITAZATO，日本)中，將復(fù)蘇囊胚移入提前準(zhǔn)備好的囊胚培養(yǎng)液G2(Vitrolife，瑞典)中，放入37℃、6%CO2和5%O2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。移植前評(píng)估胚胎的存活情況，囊胚腔重新擴(kuò)張判斷為囊胚存活。

四、子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備與囊胚移植

采用人工周期或自然周期進(jìn)行子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備。自然周期：月經(jīng)規(guī)律，排卵正常者于月經(jīng)周期的第12天開始陰道B超監(jiān)測(cè)排卵，排卵日后第1天常規(guī)黃體支持，第5天胚胎移植；人工周期：排卵障礙者于月經(jīng)第2天開始服戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂(lè),先靈，德國(guó))，2～3 mg，Bid，服用10 d后開始陰道B超監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜，當(dāng)內(nèi)膜厚度達(dá)到8 mm以上時(shí)開始常規(guī)黃體支持，黃體支持第6天胚胎移植。

五、妊娠判定標(biāo)準(zhǔn)

移植后14 d檢測(cè)HCG指標(biāo)，陽(yáng)性者于移植后28 d行B超檢查，見孕囊者確診為臨床妊娠。不足28周終止妊娠者為流產(chǎn)。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、三組患者一般資料

A、B、C三組患者的女方年齡、不孕年限、不孕類型、BMI、FET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、移植當(dāng)日內(nèi)膜厚度均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而三組患者間囊胚冷凍時(shí)期比較有顯著性差異(P<0.05)(表1)。

組 別例數(shù)女方年齡不孕年限不孕類型原發(fā)不孕繼發(fā)不孕BMI(kg/m2)A組25930.97±3.963.47±2.50115(44.40)144(55.60)21.07±2.08B組40030.96±3.943.75±2.69200(50.00)200(50.00)21.00±2.22C組32531.11±3.953.43±2.50164(50.46)161(49.54)20.94±2.44組 別例數(shù)FET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案囊胚冷凍時(shí)期人工周期自然周期D5D6移植日內(nèi)膜厚度(mm)A組259204(78.76)55(21.24)222(85.71)?37(14.29)?9.40±1.57B組400302(75.50)98(24.50)292(73.00)?108(27.00)?9.42±1.43C組325252(77.54)73(22.46)198(60.92)?127(39.08)?9.40±1.66

注：組間相互比較，*P<0.05

二、三組患者臨床結(jié)局和新生兒結(jié)局

A、B、C三組患者間臨床妊娠率(70.66% vs.60.75% vs.44.31%，P<0.05)及活產(chǎn)率(61.39% vs.48.00% vs.34.46%，P<0.05)均有顯著差異；A、B、C三組患者的流產(chǎn)率逐漸增加，但無(wú)顯著性差異(13.11% vs.19.75% vs.22.92%，P>0.05)；三組患者間新生兒出生體重?zé)o顯著差異(P>0.05)(表2)。

三、C組患者兩個(gè)亞組比較

1.一般資料：C1、C2兩組患者間女方年齡、不孕年限、不孕類型、BMI、FET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、移植當(dāng)日內(nèi)膜厚度以及囊胚冷凍時(shí)期均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

組 別例數(shù)臨床妊娠率流產(chǎn)率活產(chǎn)率孕周新生兒體重(g)A組259183/259(70.66)?24/183(13.11)159/259(61.39)?38.21±1.653 426.73±578.80B組400243/400(60.75)?48/243(19.75)192/400(48.00)?38.02±1.643 361.80±481.65C組325144/325(44.31)?33/144(22.92)112/325(34.46)?38.45±1.633 395.98±456.61

注：組間相互比較，*P<0.05

2.臨床結(jié)局及新生兒結(jié)局比較：與C1組比較，C2組的臨床妊娠率(50.00% vs.40.61%，P<0.05)及活產(chǎn)率(39.84% vs.30.96%，P<0.05)均顯著升高(表4)。

注：與C1組比較，*P<0.05

討 論

在凍融單囊胚移植周期中，影響囊胚成功種植的因素有子宮內(nèi)膜、囊胚質(zhì)量以及患者心理因素等，其中囊胚質(zhì)量是胚胎實(shí)驗(yàn)室關(guān)注的最重要的指標(biāo)。我們的臨床資料中顯示，高質(zhì)量囊胚組D5比例顯著高于低質(zhì)量囊胚組。武龍梅等[14]的研究也得出相似結(jié)果，他們回顧性分析凍融囊胚移植患者的臨床資料，D5組與D6組相比，新鮮周期的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率均顯著增高。分析可能的原因：D6囊胚發(fā)育延遲，影響囊胚質(zhì)量；優(yōu)質(zhì)囊胚在D5已被優(yōu)先冷凍。

本研究結(jié)果顯示：隨著囊胚質(zhì)量的增加，臨床妊娠率和活產(chǎn)率均顯著增加，流產(chǎn)率有降低趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。Oron等[15]回顧性分析了凍融單囊胚移植周期1541例患者的臨床結(jié)局，結(jié)果顯示移植高質(zhì)量囊胚相比低質(zhì)量囊胚可獲得更高的臨床妊娠率和活產(chǎn)率。柳亞楠等[16]的研究將231例高質(zhì)量囊胚與154例低質(zhì)量囊胚進(jìn)行比較，結(jié)果顯示臨床妊娠率(71.00% vs.42.86%)和活產(chǎn)率(54.55% vs.32.47%)均有顯著性差異，囊胚的質(zhì)量能顯著影響妊娠結(jié)局。在一項(xiàng)通過(guò)形態(tài)學(xué)預(yù)測(cè)整倍體囊胚妊娠結(jié)局的研究中，作者強(qiáng)調(diào)整倍體囊胚總體質(zhì)量、TE和ICM等級(jí)與患者妊娠結(jié)局正相關(guān)[17]。Irani等[18]的研究根據(jù)囊胚質(zhì)量將701例囊胚分為好、中、差三組，其活產(chǎn)率和種植率有顯著性差異。Minasi等[19]還研究了1 730個(gè)囊胚的倍性狀態(tài)與形態(tài)學(xué)和形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)之間的潛在相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)整倍體胚胎開始分裂、擴(kuò)張和孵化的時(shí)間較短，而且高質(zhì)量TE和ICM的比例較高，發(fā)育級(jí)別較高。

關(guān)于新生兒出生結(jié)局，我們的研究結(jié)果顯示：孕周和新生兒出生體重與移植的囊胚質(zhì)量無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。孟慶霞等[20]的研究也表明內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層質(zhì)量并不能預(yù)測(cè)新生兒出生體重。王雪等[21]的研究顯示，在單胎組中，D5和D6囊胚凍融移植后出生的新生兒孕周、出生體重和體長(zhǎng)均無(wú)顯著性差異，同時(shí)在雙胎組中也得出相似的結(jié)果。也有研究指出，出生體重與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量相關(guān)，因?yàn)閮?nèi)細(xì)胞團(tuán)最終會(huì)發(fā)育成胎兒[22]。然而，出生體重的影響因素很多，包括新生兒性別、父母體重、孕婦的健康狀況以及孕期營(yíng)養(yǎng)等。本研究中新生兒結(jié)局的樣本量相對(duì)較少，后續(xù)還需進(jìn)一步排除混雜因素，做更深入研究。另有研究表明囊胚期胚胎相比于分裂期胚胎性別比有顯著性差異[23-24]，可能由于男女胚胎染色體的差異，男性胚胎較女性胚胎具有更好的發(fā)育潛能[25-26]。因此，探討囊胚質(zhì)量與新生兒性別的關(guān)系，也需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究。

在臨床工作中，我們發(fā)現(xiàn)形成的低質(zhì)量囊胚，在滋養(yǎng)層外經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)排出的碎片或卵裂球，胚胎碎片有可能是促排卵或體外操作導(dǎo)致卵裂球損傷產(chǎn)生的，也有可能是胚胎修復(fù)機(jī)制，排出了染色體異常的卵裂球，或以碎片形式排出部分異常細(xì)胞[27-28]。我們的結(jié)果也顯示，對(duì)于存在碎片或卵裂球的囊胚，其臨床妊娠率及活產(chǎn)率不但沒(méi)有受到影響，反而有顯著性增加。有理由推斷，本研究中低質(zhì)量組的C2亞組囊胚由于排出了染色體異常的細(xì)胞，相比于C1亞組可能有更高的整倍性。因此，我們推斷當(dāng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層質(zhì)量達(dá)到一定等級(jí)時(shí)，滋養(yǎng)層外碎片及卵裂球不應(yīng)作為一項(xiàng)負(fù)性指標(biāo)。需要在以后的研究中對(duì)這一類型囊胚進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT-A)，進(jìn)一步驗(yàn)證這一推斷。

綜上所述，本研究表明，在凍融單囊胚移植周期中，囊胚總體質(zhì)量可預(yù)測(cè)患者臨床妊娠率、活產(chǎn)率；同時(shí)，對(duì)于低質(zhì)量囊胚，滋養(yǎng)層外碎片或卵裂球不應(yīng)作為臨床妊娠率和活產(chǎn)率的負(fù)性指標(biāo)。本研究沒(méi)有細(xì)分D5與D6囊胚，也沒(méi)有對(duì)TE和ICM形態(tài)進(jìn)行區(qū)分比較，而且這是一項(xiàng)回顧性研究，因此，在以后的研究中需要有更大的隊(duì)列進(jìn)行前瞻性研究來(lái)綜合考量目前的結(jié)論。